木栓酮合酶TwOSC1的產(chǎn)物異構(gòu)化研究

張凱月,鄒旭,張晨爍,余源,王洋

( 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 唐山 063210)

木栓酮(Friedelin)又稱為無(wú)羈萜或軟木三萜酮,是廣泛分布于自然界中的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物,是植物體內(nèi)一種重要的木栓烷型五環(huán)三萜類化合物。木栓酮在雷公藤(Tripterygium wilfordii)、刺葉美登木(Maytenus ilicifolia)、大葉落地生根(Kalanchoe daigremontiana)等多種藥用植物的樹(shù)葉、樹(shù)皮和樹(shù)根中含量豐富[1-3],具有非常重要的生理和藥理學(xué)活性,例如抗腫瘤、抗氧化、消炎抗菌、降低血糖、清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及保肝護(hù)肝等多種功效,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品保健和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[4-5]。此外,木栓酮還具有除草殺蟲(chóng)的作用,可以應(yīng)用于植物保護(hù)[6]。

雖然植物提取和化學(xué)合成都可以獲得木栓酮,但是依然存在提取效率低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、污染生態(tài)環(huán)境等缺點(diǎn),Gao等人將來(lái)源于雷公藤的木栓酮合酶TwOSC1引入釀酒酵母細(xì)胞中,成功構(gòu)建了木栓酮的從頭合成體系,通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母工程菌使木栓酮產(chǎn)量達(dá)到63.91 mg/L,但產(chǎn)量依然較低,無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求[7-8]。由于TwOSC1是一種多功能合酶,不僅能夠催化(3S)-2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成木栓酮,還能生成α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇等副產(chǎn)物,嚴(yán)重影響了釀酒酵母工程菌中木栓酮的產(chǎn)量。通過(guò)理性和半理性設(shè)計(jì)分析TwOSC1的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn),利用蛋白質(zhì)工程對(duì)其關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行改造,提高TwOSC1的催化活性及產(chǎn)物專一性,對(duì)提高釀酒酵母中木栓酮的產(chǎn)量具有重要意義。

Yu等在提高α-香樹(shù)脂醇合酶MdOSC1催化活性的研究中,將靠近N末端氨基酸殘基N11突變成N11I,α-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量提高了大約6倍,表明N端第11位氨基酸對(duì)MdOSC1的活性具有明顯影響[9]。Mazzeu等對(duì)來(lái)源于美登木的木栓酮合酶(MiFRS)M549進(jìn)行了研究,突變體M549S的催化活性顯著提高,木栓酮的產(chǎn)量增加了2倍,但在產(chǎn)物中檢測(cè)到了α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇,該突變體影響了MiFRS的產(chǎn)物專一性[10]。此外,(3S)-2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)具有保守區(qū)域259XWCYCR264,這一序列決定了(3S)-2,3-氧化鯊烯的折疊模式和產(chǎn)物類型[11]。根據(jù)OSC基因家族的保守性及TwOSC1序列分析,該項(xiàng)研究初步篩選了5個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)(N11、I259、G280、I548、M552),利用蛋白質(zhì)工程構(gòu)建了16個(gè)TwOSC1突變體,分析了各個(gè)突變體對(duì)木栓酮合酶TwOSC1催化活性及產(chǎn)物專一性的影響,為后續(xù)深入探究TwOSC1關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)提供了有價(jià)值的參考資料。

1材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

釀酒酵母菌株aAM2(以釀酒酵母INVSc1為底盤(pán)宿主,分別在其基因組的rDNA位點(diǎn)和Delta位點(diǎn)整合PALA1-ERG20_PGPM1-ERG9_PTYS1-ERG1_HIS3以及PTDH3-tHMG1_PADH1-DGA1_LEU2)[12],釀酒酵母質(zhì)粒pESC-Trp均由本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加入20 g瓊脂粉):YPD培養(yǎng)基(1 L):超純水950 mL、蛋白胨20 g、酵母提取物10 g;SD培養(yǎng)基(1 L):超純水950 mL、YNB 6.7 g、必需氨基酸0.6 g、組氨酸20 mg、亮氨酸100 mg、尿嘧啶20 mg、色氨酸20 mg、用2 M的NaOH調(diào)至pH為6.2。高壓滅菌:121 ℃,20 min,并加入50 mL經(jīng)115 ℃高壓滅菌15 min的40%葡萄糖溶液。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加入瓊脂 15～20 g):超純水1 000 mL、酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、pH 7.4～7.6,高壓滅菌:121 ℃,20 min。氨芐青霉素的使用濃度100 μg/mL。

1.2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、prime star HS DNA 聚合酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司、大腸桿菌Top10感受態(tài)購(gòu)自上海昂羽生物技術(shù)有限公司、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技公司、木栓酮標(biāo)準(zhǔn)品、α-香樹(shù)脂醇標(biāo)準(zhǔn)品、β-香樹(shù)脂醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

PCR基因擴(kuò)增儀(Eppendorf)、電泳儀(JY600E) 、凝膠快速成像儀(JY02G)、微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(NanoDrop One/OneC)、安捷倫7000D三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 GC/MS 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。

1.3 雷公藤TwOSC1全長(zhǎng)基因的克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載來(lái)源于雷公藤TwOSC1的全長(zhǎng)基因序列,并對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化(http://www.friendbio.com/codon.html)和組裝設(shè)計(jì)(http://54.235.254.95/gd/)。利用SOE-PCR設(shè)計(jì)引物經(jīng)過(guò)多輪PCR反應(yīng)以擴(kuò)增出全長(zhǎng)TwOSC1基因片段。

(1) 將TwOSC1全長(zhǎng)序列(2 298 bp)分為3個(gè)片段,每個(gè)片段設(shè)計(jì)24條引物,大約750 bp堿基。片段1引物:01.001-01.024;片段2引物:02.001-02.024;片段3引物:03.001-03.024。

(2) 分別將各個(gè)片段包含的24條引物每條取10 μL于1.5 mL EP管中混合均勻,進(jìn)行第一輪無(wú)模板降落PCR,將各個(gè)引物片段連接起來(lái)。3個(gè)片段皆按照此方法。PCR反應(yīng)體系:2×mix 12.5 μL、混合引物5 μL、ddH2O 7.5 μL,反應(yīng)條件:95 ℃×2 min、95 ℃×20 s、 69～0.5 ℃ /循環(huán)30 s、72 ℃×1 min、72 ℃×5 min、4 ℃保存 (第2步到第4步循環(huán)30次)。

(3) 利用第一輪無(wú)模板降落PCR的產(chǎn)物為模板,每段片段的首尾引物作為上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)結(jié)束后利用1%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,通過(guò)凝膠成像儀檢測(cè)條帶大小及亮度。利用瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,NanoDrop One檢測(cè)各個(gè)回收片段濃度,-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系:2×mix 12.5 μL、第一輪PCR產(chǎn)物2.5 μL、上游引物1 μL、下游產(chǎn)物1 μL、ddH2O 8 μL,反應(yīng)條件:95 ℃×2 min、95 ℃×20 s、56 ℃×30 s、72 ℃×1 min、72 ℃×5 min、4 ℃保存 (第2步到第4步循環(huán)30次)。

(4) 第二輪膠回收產(chǎn)物為模板,以第一個(gè)片段和第三個(gè)片段的首尾引物為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)片段。電泳并膠回收后測(cè)量濃度,-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系:2×mix 12.5 μL、第二輪PCR產(chǎn)物各1.5 μL、上游引物1 μL、下游產(chǎn)物1 μL、 ddH2O 6 μL,反應(yīng)條件:95 ℃×2 min、95 ℃×20 s、56 ℃×30 s、72 ℃×2 min15 s、72 ℃×5 min、4 ℃保存 (第2步到第4步循環(huán)30次)。

1.4 TwOSC1表達(dá)載體及突變體的構(gòu)建

經(jīng)過(guò)SOE-PCR獲得的TwOSC1全長(zhǎng)序列為模板,用帶有BamH1和Xho1酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增TwOSC1,電泳后膠回收,與載體質(zhì)粒pESC-Trp用上述限制性核酸酶切酶分別37 ℃酶切2 h和1 h。酶切后的TwOSC1和pESC-Trp電泳后膠回收,測(cè)定濃度后用T4連接酶連接(16 ℃, 2 h),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,用帶有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選成功轉(zhuǎn)化的單菌落。搖菌后提質(zhì)粒,并驗(yàn)證所得序列是否正確。

利用Auto dock對(duì)TwOSC1蛋白與(3S)-2,3-氧化鯊烯進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)圖1),通過(guò)理性與半理性確定突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1),以pESC-Trp-TwOSC1為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳并膠回收后,37 ℃條件下使用Dpn1酶消化1 h,以消除模板干擾,隨后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,用帶有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選成功轉(zhuǎn)化的單菌落。搖菌后提質(zhì)粒,并驗(yàn)證預(yù)測(cè)位點(diǎn)是否突變。

圖1 TwOSC1與(3S)-2,3-氧化鯊烯分子對(duì)接

1.5 TwOSC1及其突變體在釀酒酵母中的表達(dá)及GC-MS檢測(cè)產(chǎn)物

采用標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pESC-Trp-TwOSC1轉(zhuǎn)化到釀酒酵母aAM2,在含終濃度2%葡萄糖的SD-Trp固體培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)2 d,挑選單菌落轉(zhuǎn)接至SD-His-Leu-Trp液體培養(yǎng)基中30 ℃,200 rpm培養(yǎng)2 d,換終濃度2%的半乳糖的SD-His-Leu-Trp培養(yǎng)基繼續(xù)在30 ℃、200 rpm條件下誘導(dǎo)基因表達(dá),2 d后將菌液離心(4 000 rpm,3 min),倒掉上清收集菌塊。取20% KOH于菌塊中渦旋混勻以裂解細(xì)胞,100 ℃沸水浴10 min,放至室溫,加入正己烷渦旋萃取10 min后靜置2 min,吸取上清,蒸發(fā)濃縮(1 300 rpm,60 ℃)至完全干燥,加入烷基化試劑(吡啶和三甲基硅基各100 μL),80 ℃水浴30 min進(jìn)行烷基化,放至室溫,離心取上清。GC-MS檢測(cè)分析產(chǎn)物,溫度以20 ℃/min的速率從80 ℃上升到300 ℃,并保持30 min。

2結(jié)果與討論

2.1 雷公藤OSC1(TwOSC1)的克隆及釀酒酵母表達(dá)

TwOSC1含有763個(gè)氨基酸,根據(jù)釀酒酵母偏好的密碼子對(duì)該序列進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)SOE-PCR首先獲得3個(gè)約750 bp的片段,使用引物01.001和03.024將3個(gè)片段組裝得到TwOSC1全長(zhǎng)序列,2 298 bp(見(jiàn)圖2)。

圖2 TwOSC1基因的克隆

TwOSC1基因與釀酒酵母表達(dá)載體pESC-Trp經(jīng)BamH1和Xho1雙酶切,并用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pESC-Trp-TwOSC1(見(jiàn)圖3),TwOSC1序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證組裝正確并順利插入到表達(dá)載體中。

圖3 pESC-Trp-TwOSC1

采用標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法,將pESC-Trp-TwOSC1轉(zhuǎn)化至釀酒酵母aAM2中,在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD-His-Leu-Trp上篩選出成功轉(zhuǎn)化的菌株。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中加入半乳糖誘導(dǎo)基因表達(dá),利用正己烷萃取釀酒酵母工程菌中的合成代謝產(chǎn)物,烷基化后通過(guò)GC-MS檢測(cè)到木栓酮、α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇(見(jiàn)圖4)。

圖4 含pYYG-Trp-TwOSC1的酵母菌菌株產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析

圖5 突變質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 TwOSC1突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

以pYYG-Trp-TwOSC1為模板,根據(jù)設(shè)計(jì)的突變引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得定點(diǎn)突變的pYYG-Trp-TwOSC1全長(zhǎng)序列,dpnI將模板消化后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞中,在含有Amp終濃度為100 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基篩選,最終獲得16個(gè)突變質(zhì)粒(見(jiàn)圖5),并將測(cè)序結(jié)果與野生型TwOSC1序列比對(duì)確定設(shè)計(jì)的位點(diǎn)已經(jīng)成功突變。

2.3 TwOSC1突變體在釀酒酵母中的表達(dá)

2.3.1木栓酮的產(chǎn)量

突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞后,在SD-His-Leu-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上篩選,經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)和基因誘導(dǎo)表達(dá)后,利用GC-MS測(cè)定木栓酮的產(chǎn)量見(jiàn)圖6。結(jié)果表明突變體G280P、G280S、G280H和M552S中木栓酮產(chǎn)量高于野生型TwOSC1,顯著提高了TwOSC1的催化活性,其中G280H催化活性最高,木栓酮產(chǎn)量為26.1 mg/L,是野生型產(chǎn)量的1.27倍;突變體N11I、N11W、N11F、N11R、N11A、I548L和I548W的木栓酮產(chǎn)量低于野生型TwOSC1,降低了TwOSC1的催化活性;突變體I259A、I259E、I259K、I259M、I259R中未檢測(cè)到木栓酮,無(wú)催化活性(見(jiàn)圖6)。TwOSC1的G280位和M552位氨基酸殘基的突變可能會(huì)提高TwOSC1的活性,而N11位氨基酸殘基的突變會(huì)降低TwOSC1的活性,I259位氨基酸殘基的突變導(dǎo)致其無(wú)催化活性。

圖6 突變體在aAM2中的木栓酮產(chǎn)量

2.3.2釀酒酵母中突變體的產(chǎn)物變化

TwOSC1是一種以木栓酮為主要產(chǎn)物,α-香樹(shù)脂醇、β-香樹(shù)脂醇為副產(chǎn)物的多功能合酶。分別將其G280、N11、I548、I259、M552突變后,木栓酮、α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量隨之發(fā)生變化。以野生型(WT)TwOSC1作為參照,3種產(chǎn)物的變化如圖7所示。與TwOSC1相比,突變體G280P的3種產(chǎn)物無(wú)明顯變化;突變體G280S和G280H隨著木栓酮產(chǎn)量的提高,α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量也高于野生型。N11位突變后木栓酮產(chǎn)量均低于野生型,β-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量均明顯高于野生型;突變體N11I、N11W、N11A的α-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量略低于野生型,但N11F和N11R的α-香樹(shù)脂醇明顯高于野生型,其中N11R是16個(gè)突變體中α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量最高的突變體,且3種產(chǎn)物產(chǎn)量差異不大。I548位突變后,木栓酮產(chǎn)量均低于野生型,但α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量均高于野生型。I259位突變之后,該酶完全喪失合成木栓酮的能力,且β-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量顯著降低,但I(xiàn)259E催化合成α-香樹(shù)脂醇的活性顯著提高,約為野生型的5倍。突變體M552S同時(shí)提高了木栓酮、α-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)量,且3種產(chǎn)物的產(chǎn)量比接近2:1:1,與野生型相比,該突變體降低了TwOSC1產(chǎn)物合成木栓酮的專一性。

圖7 TwOSC1突變體在aAM2中的產(chǎn)物變化

第11位氨基酸與第548位氨基酸的突變降低了木栓酮的產(chǎn)量,但2種香樹(shù)脂醇的總產(chǎn)量明顯提高,表明這些氨基酸殘基位點(diǎn)的突變可能影響了底物折疊過(guò)程中正電荷的遷移[13],促使更多的(3S)-2,3-氧化鯊烯環(huán)化合成香樹(shù)脂醇。第280位和552位氨基酸殘基突變后,3種產(chǎn)物產(chǎn)量同時(shí)增加,表明這2個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)的突變能夠增強(qiáng)底物與TwOSC1的親和力,進(jìn)而提高其催化活性。I259位氨基酸殘基位于OSC保守基序259XWCYCR264中,TwOSC1的第259位氨基酸殘基與來(lái)源于大葉落地生根中的木栓酮合酶KdFRS[1]、山楊(Populus davidiana)中的木栓酮合酶PdFRS[14]和刺葉美登木中的木栓酮合酶MiFRS[15]的第259位氨基酸殘基不同,將TwOSC1的第259位突變后,所有突變體喪失了合成木栓酮的活性,但突變體TwOSC1I259E合成α-香樹(shù)脂醇的專一性顯著提高,這與259XWCYCR264保守基序可能與產(chǎn)物的特異性有關(guān)的推測(cè)一致[11,16],因此TwOSC1的I259位對(duì)木栓酮的合成具有重要意義。此外,推測(cè)這些突變的氨基酸殘基位于TwOSC1的活性中心通道附近(見(jiàn)圖1),其極性與所帶電荷影響著(3S)-2,3-氧化鯊烯進(jìn)入活性中心的能力及與TwOSC1的親和力,進(jìn)而影響著TwOSC1的催化活性。為了實(shí)現(xiàn)木栓酮的工業(yè)化生產(chǎn),不僅要提高突變體的催化活性,還要提高其特異性,因此仍需探索更多的TwOSC1關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),獲得催化活性高且產(chǎn)物專一性強(qiáng)的TwOSC1突變體。

3結(jié)論

(1) 研究初步探索了TwOSC1的5個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn),構(gòu)建了16個(gè)突變體。

(2) 16個(gè)突變體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中,通過(guò)GC-MS分析,篩選出木栓酮合酶突變體TwOSC1G280H的催化活性最高,突變體TwOSC1I259E對(duì)α-香樹(shù)脂醇的產(chǎn)物專一性最高。

(3) 研究為后續(xù)深入探究木栓酮合酶TwOSC1的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)提供了一定的參考價(jià)值。