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    響應(yīng)面法分析丹皮酚與常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用

    2023-06-21 07:25:56趙貴紅王京雪于偉東張大虎段升霞
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年10期
    關(guān)鍵詞:丹皮抗氧化劑兒茶素

    劉 建,趙貴紅,王 波,王京雪,于偉東,張大虎,段升霞

    (1. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,山東菏澤 274000;2. 菏澤學(xué)院化工學(xué)院,山東菏澤 274000;3. 山東大樹(shù)達(dá)孚特膳食品有限公司,山東菏澤 274000)

    隨著我國(guó)食品工業(yè)的快速壯大和不斷發(fā)展,單一食品抗氧化劑的應(yīng)用效果已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)代人對(duì)高品質(zhì)生活的追求,所以復(fù)配協(xié)同抗氧化劑也逐漸成為當(dāng)前食品生產(chǎn)過(guò)程中使用抗氧化劑的發(fā)展趨勢(shì),且其協(xié)同抗氧化的作用機(jī)理也已經(jīng)逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[1-4]。如今,為找尋更加合理且高效的復(fù)合型協(xié)同抗氧化劑,人們將更多的精力放在研究這些天然的抗氧化劑間的相互作用上。復(fù)配型抗氧化劑是由2 種及以上的抗氧化劑進(jìn)行不同比例、濃度的配比,用以提高食品抗氧化能力的抗氧化劑。不同的抗氧化劑經(jīng)過(guò)復(fù)配可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的效果。如果抗氧化劑復(fù)配合理,就能使其中的組成成分起到協(xié)同作用,進(jìn)而增強(qiáng)該食品的抗氧化能力。反之,則起不到協(xié)同效果。

    丹皮酚,別稱(chēng)牡丹酚,是一種小分子酚類(lèi)化合物,提取自牡丹的干燥根皮。據(jù)相關(guān)試驗(yàn)研究表明,丹皮酚具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種對(duì)人體有益的藥理作用[5-6],且具有多種生物活性。張延龍等人[7]通過(guò)試驗(yàn),發(fā)明了一種含牡丹酚的牡丹籽油復(fù)合天然抗氧化劑。將牡丹酚、茶多酚、抗壞血酸棕櫚酸酯進(jìn)行復(fù)配,所得的研究結(jié)果表明此3 種物質(zhì)之間產(chǎn)生了明顯的協(xié)同抗氧化作用。由此說(shuō)明,該復(fù)合天然抗氧化劑具有顯著的協(xié)同抗氧化能力,且對(duì)人體不存在毒性損害,具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性等特性,可用于牡丹籽油的生產(chǎn)加工。

    阿魏酸、槲皮素、兒茶素等多酚物質(zhì)是從植物體內(nèi)提取的一類(lèi)酚類(lèi)物質(zhì)。這些多酚有著優(yōu)良的抗氧化性,且清除自由基的能力較強(qiáng)[8-10]。它能與多種抗氧化物在生物體內(nèi)相互配合發(fā)揮抗氧化作用,已經(jīng)成為廣受大眾關(guān)注的天然抗氧化劑。石艷賓等人[11]為測(cè)定多酚物質(zhì)的抗氧化活性,以DPPH 自由基清除率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),選取了茶多酚、兒茶素、綠原酸和沒(méi)食子酸,并運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)方法,比較這些酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力。結(jié)果表明,這4 種酚類(lèi)物質(zhì)在清除DPPH 自由基方面均表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力。且它們之間存在某種程度上的交互作用,但并不明顯。

    目前,丹皮酚與其他多酚類(lèi)化合物抗氧化協(xié)同作用的研究較少,其協(xié)同作用效果及機(jī)制尚不清楚,但是將丹皮酚和常見(jiàn)多酚復(fù)配成抗氧化劑,具備較高的可行性,且在果蔬、肉等冷鮮食品的保鮮方面應(yīng)用前景非常樂(lè)觀[12]。前期研究發(fā)現(xiàn),丹皮酚對(duì)于DPPH 自由基的清除效果并不明顯,但表現(xiàn)出良好的清除ABTS 自由基活性。所以,研究以ABTS 自由基的清除活性評(píng)價(jià)丹皮酚、槲皮素、咖啡酸等的抗氧化活性,以期明確丹皮酚與常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    丹皮酚(純度98%),上海源葉生物技術(shù)有限公司提供;槲皮素(純度95%)、芥子酸(純度98%)、抗壞血酸(純度> 99%)、兒茶素(純度≥95%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供;ABTS(純度98%)、過(guò)硫酸鉀(純度99%)、咖啡酸(純度99%)、對(duì)羥基苯甲酸(純度≥99.5%)、阿魏酸(純度99%)、3,4 -二羥基苯甲酸(純度≥97%),上海麥克林生化科技有限公司提供;無(wú)水甲醇,煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司提供。

    V-1200 型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美析儀器有限公司產(chǎn)品;FA2004N 型電子天平,上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品;冰箱,海爾智家股份有限公司產(chǎn)品;快速混勻器,江蘇新康醫(yī)療機(jī)械有限公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 ABTS+·清除能力的測(cè)定[2]

    ABTS 可與過(guò)氧化鉀發(fā)生反應(yīng),ABTS 被氧化,生成藍(lán)綠色的ABTS 陽(yáng)離子自由基,該陽(yáng)離子自由基較為穩(wěn)定,在波長(zhǎng)734 nm 處有最大吸收峰,在抗氧化劑的存在下,ABTS+·與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng),使陽(yáng)離子自由基褪色。

    將0.192 g ABTS(純度98%) 和0.033 g 過(guò)硫酸鉀(純度99%) 分別溶于50 mL 蒸餾水中,再等量混勻,室溫黑暗條件下靜置12~16 h 使其充分反應(yīng),12~16 h 后將其取出,即可得ABTS 母液,再向母液中加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊湓?5 ℃,波長(zhǎng)734 nm 處的吸光度為0.70±0.02,即得試驗(yàn)所需的ABTS+·工作液,工作液呈現(xiàn)透明綠色,需避光保存。取0.5 mL 不同濃度的丹皮酚、多酚物質(zhì)或復(fù)配物溶液,分別將其加入已標(biāo)記好的試管中,再分別向各個(gè)試管中加入ABTS+·工作液5 mL(其中空白管加入0.5 mL 蒸餾水,對(duì)照管則用0.5 mL 70%甲醇替代樣品)。室溫黑暗下靜置600 s,于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定其吸光度。若樣品具備清除ABTS 自由基的活性,則樣品反應(yīng)溶液吸光度會(huì)低于對(duì)照溶液。試驗(yàn)每份試樣重復(fù)3 次。

    1.2.2 丹皮酚與槲皮素等的協(xié)同作用效果

    應(yīng)用響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)(CCD)四因素五水平試驗(yàn)考查丹皮酚與槲皮素等的協(xié)同作用效果,四因素分別為槲皮素、兒茶素、阿魏酸與丹皮酚;丹皮酚質(zhì)量濃度分別為3,6,9,12,15 μg/mL;槲皮素質(zhì)量濃度分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μg/mL;兒茶素質(zhì)量濃度分別為1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 μg/mL;阿魏酸質(zhì)量濃度分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μg/mL。所有試驗(yàn)均做3 次重復(fù),并利用軟件SPSS 19.0 對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,接著建立多元二次回歸模型,分析該多酚物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。

    CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼見(jiàn)表1。

    表1 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼/μg·mL-1

    1.2.3 復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)(SE) 計(jì)算

    通過(guò)計(jì)算多酚物質(zhì)的復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)(SE) 可得知,這些多酚物質(zhì)之間是否具有協(xié)同抗氧化作用。通過(guò)試驗(yàn)可得復(fù)配溶液的清除率(ESC) 及理論清除率(TSC) 的比率,即SE 值。

    當(dāng)SE>1,表明該復(fù)配溶液有協(xié)同作用;SE<1,表明該復(fù)配溶液無(wú)明顯的抗氧化協(xié)同作用??寡趸瘏f(xié)同系數(shù)SE 可由如下公式計(jì)算得知:

    理論清除率(TSC) 的計(jì)算如下:

    式中:ESC1,…,ESCn——各個(gè)溶液的試驗(yàn)清除率;

    n——此評(píng)價(jià)體系中的所用抗氧化劑的數(shù)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 多酚物質(zhì)抗氧化能力比較

    先配制不同質(zhì)量濃度的丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、抗壞血酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、3,4 - 二羥基苯甲酸試樣,然后依據(jù)1.2.1中所示的試驗(yàn)方法,測(cè)定各個(gè)試樣的吸光度。再根據(jù)吸光度值計(jì)算半數(shù)清除率IC50。

    不同多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基的清除率見(jiàn)圖1 和不同多酚物質(zhì)的IC50見(jiàn)表2。

    圖1 不同多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基的清除率

    表2 不同多酚物質(zhì)的IC50

    由圖1 可知,隨著多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加,ABTS 自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中,當(dāng)阿魏酸的質(zhì)量濃度上升至15 μg/mL 后,ABTS 自由基清除率變化漸漸趨于穩(wěn)定;當(dāng)槲皮素的樣品質(zhì)量濃度上升至30 μg/mL 后,ABTS 自由基清除率變化不明顯且逐漸趨于穩(wěn)定。該試驗(yàn)對(duì)多酚物質(zhì)抗氧化性能的評(píng)價(jià),以半數(shù)清除率IC50為指標(biāo),比較丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸、3,4 -二羥基苯甲酸的抗氧化能力的強(qiáng)弱。文中IC50值可以定義為清除ABTS 自由基50%時(shí)樣品的質(zhì)量濃度,所以IC50值越高,其抗氧化能力越弱,反之則越強(qiáng)。由表2 可知,槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羥基苯甲酸的IC50值小于對(duì)照物質(zhì)維C 的IC50值,這些多酚物質(zhì)的抗氧化性均較強(qiáng)。各種多酚物質(zhì)的IC50值由低到高分別為槲皮素、阿魏酸、兒茶素、3,4 -二羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸。選取IC50值由低到高排列的前3 位多酚化合物,即槲皮素、阿魏酸和兒茶素,并與丹皮酚進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

    2.2 多酚物質(zhì)間抗氧化作用分析

    2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,依據(jù)表1 進(jìn)行響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)(CCD),考查丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、兒茶素間抗氧化能力的強(qiáng)弱。

    CCD 試驗(yàn)結(jié)果及SE 值的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 CCD 試驗(yàn)結(jié)果及SE 值的計(jì)算結(jié)果

    由表3 可知,CCD 試驗(yàn)的結(jié)果中,第29 組,即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL,槲皮素質(zhì)量濃度為2 μg/mL,兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL,復(fù)配協(xié)同系數(shù)SE 大于1。說(shuō)明在合適的濃度下,4 種多酚物質(zhì)有協(xié)同抗氧化作用。

    2.2.2 方差分析

    將表3 中所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用軟件Design Expert 8.06 進(jìn)行回歸分析。

    回歸模型方差與分析見(jiàn)表4。

    表4 回歸模型方差與分析

    由表4 可知,丹皮酚(A)、兒茶素(C) 的p 值均大于0.005,說(shuō)明這2 種多酚對(duì)清除率的影響不大;但槲皮素(B)、阿魏酸(D) 的p 值接近0.000 1,表明這2 種多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基清除率的影響較明顯。各多酚物質(zhì)間存在某些程度上的交互作用,但均不明顯。多酚物質(zhì)間的交互作用由小到大的順序依次是B 與D、C 與D、A 與C、B 與C、A 與D、A與B。

    2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析

    根據(jù)CCD 試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行回歸分析,并創(chuàng)建全變量二次回歸模型:

    ABTS 自由基清除率(%)= 44.35-0.67A+3.30B+1.97C+3.25D-1.19AB-0.37AC-0.61AD-0.46BC-0.04BD-0.36CD+1.25A2-0.63B2-0.17C2-0.30D2.

    由表4 可知,模型中p<0.01 時(shí),表明差異非常明顯;且失擬項(xiàng)p=0.063 1>0.05,表示失擬項(xiàng)不明顯,表明這是適宜丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、兒茶素的協(xié)同抗氧化能力的數(shù)學(xué)分析模型?;貧w方程的系數(shù)表現(xiàn)其顯著性。由此可得,對(duì)ABTS 自由基的清除率的影響較明顯的是B,C,D,且影響因素由強(qiáng)到弱依為B,D,C。由于B,C,D 的一次項(xiàng)系數(shù)為正數(shù),說(shuō)明它們?cè)谇宄鼳BTS 自由基方面存在正相關(guān)性。

    2.2.4 響應(yīng)面交互作用分析

    利用軟件Design Expert 8.06 對(duì)表3 所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。A 和B 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖2,A和C 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖3,A 和D 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。

    圖2 A 和B 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

    圖3 A和C 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

    圖4 A和D 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

    由圖2 ~圖4 可知,隨多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度的提高,ABTS 自由基清除率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),即其對(duì)清除ABTS 自由基的能力逐漸增強(qiáng)。圖2 ~圖4 為多酚物質(zhì)兩兩之間的交互作用響應(yīng)曲面圖,可直觀地觀察到多酚物質(zhì)的響應(yīng)值變化。這幾組響應(yīng)曲面圖表現(xiàn)出,該4 種多酚物質(zhì)在清除ABTS 自由基方面都有影響。同時(shí),由于各個(gè)響應(yīng)曲面圖的坡度不同,表明這4 種多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基清除率的影響強(qiáng)度不同。在該響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中,復(fù)配組合第29組,即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL,槲皮素質(zhì)量濃度為 2 μg/mL,兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL,SE 值大于1。4 種多酚物質(zhì)在合適的質(zhì)量濃度下,能達(dá)到明顯的協(xié)同作用,進(jìn)而加強(qiáng)了丹皮酚的ABTS 自由基的清除能力。

    3 結(jié)論

    槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羥基苯甲酸對(duì)清除ABTS 自由基的能力高于對(duì)照物質(zhì)維C。丹皮酚與槲皮素、丹皮酚與兒茶素、丹皮酚與阿魏酸、槲皮素與兒茶素、槲皮素與阿魏酸、兒茶素與阿魏酸對(duì)ABTS 自由基清除率存在負(fù)相關(guān)作用。第29 組,即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL,槲皮素質(zhì)量濃度為2 μg/mL,兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL,SE 值大于1,4 種多酚在合適的質(zhì)量濃度下,能達(dá)到明顯的協(xié)同作用,進(jìn)而加強(qiáng)丹皮酚的ABTS 自由基清除能力。研究需要在后續(xù)的工作中優(yōu)化丹皮酚、槲皮素質(zhì)量濃度、兒茶素質(zhì)量濃度和阿魏酸的復(fù)配質(zhì)量濃度,明確其協(xié)同作用機(jī)制。

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