乳腺癌組織中泛素特異性蛋白酶18/干擾素刺激基因15表達水平及其臨床意義

蔡冰，尹香利，劉靜

乳腺癌發(fā)病率呈逐年增高趨勢，對女性生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［1］。泛素特異性蛋白酶18（USP18）在喉鱗狀細胞癌組織中呈過表達，其有助于評估喉鱗狀細胞癌預(yù)后情況［2］；干擾素刺激基因15（interfer?on stimulated gene 15，ISG15）在乳腺癌組織中表達上調(diào)，其可能是診治乳腺癌的潛在靶標(biāo)［3］；且USP18 可將ISG15從其靶向蛋白上水解出來，進而在調(diào)控細胞多種信號途徑中發(fā)揮作用［4］。但USP18 在乳腺癌病人癌組織中的表達水平與ISG15的相關(guān)性及與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系尚未明確。基于此，本研究通過Ual?can 數(shù)據(jù)庫檢索USP18、ISG15 在乳腺癌中的表達情況及二者與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法、免疫組化法檢測乳腺癌病人癌組織USP18、ISG15 表達水平，旨在分析USP18、ISG15相關(guān)性及兩者與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012 年5 月至2015 年7 月于渭南市中心醫(yī)院行根治性切除術(shù)的乳腺癌病人99例為研究對象，均為女性，年齡（49.28±10.22）歲，范圍為35~65 歲，<50 歲者53 例，≥50 歲者46 例；腫瘤長徑<2 cm 者48 例，≥2 cm 者51 例；TNM 分期Ⅰ~Ⅱ期者66例，Ⅲ~Ⅳ期者33例；絕經(jīng)者40例，未絕經(jīng)者59 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者64 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35 例；低分化者25 例，中、高分化者74 例。根據(jù)文獻［5］及雌激素受體（ER）、表皮生長因子受體-2（HER-2）、孕激素受體（PR）免疫組化檢測結(jié)果將乳腺癌病人分為Luminal A 型（PR+或ER+、HER-2-）41 例、HER-2過表達型（PR-、ER-、HER-2+）20 例、Luminal B 型（PR+或ER+、HER-2+）23 例、基底細胞樣型（PR-、ER-、HER-2-）15例。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《乳腺癌診療規(guī)范（2011 年版）》［6］有關(guān)乳腺癌判定標(biāo)準(zhǔn)進行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）受試者術(shù)后組織樣本經(jīng)病理學(xué)檢查確診為浸潤性乳腺癌；（2）受試者均行腹部和婦科B 超等檢查，檢查資料齊全；（3）受試者術(shù)前未接受放化療、內(nèi)分泌治療或其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并胃癌、前列腺癌或其他腫瘤者；（2）合并高血壓、急慢性感染、嚴(yán)重心、肝、腎功能不全、糖尿病者；（3）病理診斷不明確或失訪者。

受試對象對本研究知情同意，獲得渭南市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號201204152）。

1.2 方法

1.2.1Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索 利用Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu）檢索USP18、ISG15 表達水平及二者與預(yù)后的關(guān)系。gene symbol 設(shè)置為USP18、ISG15，TCGA 數(shù)據(jù)集設(shè)定為breast invasive carcinoma，進行檢索。

1.2.2組織標(biāo)本收集 取乳腺癌病人在根治性切除術(shù)中切除的組織標(biāo)本（乳腺癌組織和距離癌組織>3 cm 的癌旁正常組織），液氮罐中凍存24 h，移至-80 ℃冰箱中凍存；剩余部分組織標(biāo)本放置于福爾馬林中固定，用于制備石蠟標(biāo)本切片。

1.2.3qRT-PCR 法檢測組織標(biāo)本USP18、ISG15 mRNA 表達水平 取出“1.2.1”中凍存的標(biāo)本，研碎，利用TRIzol試劑盒（無錫百泰克生物技術(shù)有限公司）提取標(biāo)本總RNA，應(yīng)用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，上海恒斐生物科技有限公司）將組織標(biāo)本RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。依照Perfectstart SYBR Green qPCR master mix 試劑盒（TQ2300-02，北京索萊寶科技有限公司）說明書配制反應(yīng)體系，運用qRT-PCR 儀（ABI7500，上海普迪生物技術(shù)有限公司）進行擴增、檢測。以2-??Ct法計算USP18、ISG15 mRNA 相對表達量。USP18、ISG15 均以GAPDH 為內(nèi)參，引物序列詳見表1。

表1 USP18、ISG15、GAPDH引物序列

1.2.4免疫組化法檢測組織標(biāo)本USP18、ISG15蛋白表達水平 取石蠟標(biāo)本切片（厚約4 μm），利用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法染色，參考相關(guān)試劑盒說明書進行操作，一抗分別為兔抗人USP18 多克隆抗體（上海群己生物科技有限公司，批號H00011274-B01，稀釋比為1∶100）、ISG15多克隆抗體（艾美捷科技有限公司，批號A71120-100，稀釋比為1∶100），應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水，封片，顯微鏡（DMi1，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）下拍照。按染色程度（A）和陽性細胞比例（B）評分乘積判定USP18、ISG15蛋白表達情況：（1）染色程度：將無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別定義為0、1、2、3 分；（2）陽性細胞百分比：將<25%、25%~49%、50%~75%、>75%分別定義為0、1、2、3分。判定結(jié)果（A×B）：<3分定義為陰性，以≥3分定義為陽性［7］。

1.3 隨訪對99例乳腺癌病人術(shù)后進行9~60個月隨訪，以院內(nèi)復(fù)查、微信為主要隨訪方式，以乳腺癌病人手術(shù)次日為隨訪起點，2020 年7 月或乳腺癌病人死亡為隨訪終點，記錄乳腺癌病人預(yù)后生存狀況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)。以±s表示連續(xù)變量資料，組間比較行獨立樣本t檢驗；以例（%）表示計數(shù)資料，乳腺癌組織USP18、ISG15表達水平與臨床病理特征關(guān)系進行χ2檢驗；乳腺癌病人組織中USP18、ISG15蛋白表達情況及乳腺癌病人癌組織中USP18 表達水平與ISG15 相關(guān)性進行χ2檢驗；利用Kaplan-Meier曲線及l(fā)og-rank檢驗分析乳腺癌組織USP18、ISG15表達水平與乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系；Cox回歸分析法分析乳腺癌病人預(yù)后的影響因素。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ualcan 數(shù)據(jù)庫中乳腺癌組織和正常乳腺組織USP18、ISG15 mRNA 表達水平比較Ualcan 數(shù)據(jù)庫中，乳腺癌組織USP18 為18.40±4.17、ISG15 mRNA 表達水平為168.56±43.95，均高于正常乳腺組織（10.00±3.14、30.76±8.23，P<0.001）。

2.2 乳腺癌、癌旁正常組織中USP18、ISG15 mRNA 及其蛋白表達水平比較與癌旁正常組織相比，乳腺癌組織USP18、ISG15 mRNA 表達水平顯著升高，分別為癌旁正常組織的1.62、1.88 倍（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，USP、ISG15 均主要定位于細胞質(zhì)，如圖1 所示。乳腺癌組織USP18、ISG15陽性表達率均高于癌旁正常組織，分別為癌旁正常組織的3.38、2.11倍。見表2。

圖1 USP18、ISG15蛋白在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的典型表達病理示例（鏈霉親合素-生物素復(fù)合物法×200）

表2 乳腺癌病人99例乳腺癌組織、癌旁正常組織USP18、ISG15 mRNA及其蛋白表達水平比較

2.3 乳腺癌組織USP18、ISG15 表達水平與臨床病理特征關(guān)系乳腺癌組織USP18、ISG15 表達水平均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺癌分子亞型、腫瘤分化程度、TNM 分期相關(guān)（P<0.05），而與年齡、腫瘤長徑、是否絕經(jīng)無關(guān)（P>0.05）。見表3。

表3 乳腺癌組織USP18、ISG15表達水平與臨床病理特征關(guān)系/例（%）

2.4 乳腺癌病人癌組織USP18 表達水平與ISG15的相關(guān)性配對χ2檢驗顯示，乳腺癌病人癌組織中USP18 表達水平與ISG15 呈正相關(guān)（P<0.05）。見表4。

表4 乳腺癌病人癌組織中USP18表達水平與ISG15相關(guān)性/例

2.5 Ualcan 數(shù)據(jù)庫中癌組織USP18、ISG15 表達水平與乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系Ualcan 數(shù)據(jù)庫分析顯示，癌組織USP18、ISG1 高低表達組累積生存率［21.89%（58/265）比36.89%（301/816）、22.10%（59/267）比36.98%（301/814）］差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.6 癌組織USP18、ISG15 表達水平與乳腺癌病人預(yù)后的關(guān)系跟蹤隨訪99 例乳腺癌病人9~60 個月，死亡23 例，總生存率為76.77%。Kaplan-Meier生存分析顯示，USP18 陽性組乳腺癌病人平均生存時間為50.61 個月，95%CI：（46.57，54.66），短于USP18 陰性組平均生存時間為57.56 個月，95%CI：（35.05，60.06），log-rank 檢驗比較USP18 陽性組與USP18 陰性組生存率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.24，P=0.002）；ISG15 陽性組平均生存時間為50.92 個月，95%CI：（47.12，54.71），短于ISG15 陰性組平均生存時間為57.98 個月，95%CI：（55.44，60.51），經(jīng)Log-Rank 檢驗結(jié)果顯示，ISG15 陽性組、陰性組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.97，P=0.003）。

2.7 Cox 回歸分析乳腺癌病人預(yù)后的影響因素單因素Cox分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺癌分子亞型（啞變量賦值：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 過表達型、基底細胞樣型分別賦值為0、1、2、3）中HER-2過表達型、基底細胞樣型、TNM 分期、USP18、ISG15 是影響乳腺癌病人不良預(yù)后的危險因素（P<0.05），分化程度是影響乳腺癌病人預(yù)后的保護因素（P<0.05）；多因素Cox 分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、USP18、ISG15 均是影響乳腺癌病人不良預(yù)后的獨立危險因素（P<0.05）。見表5。

表5 影響乳腺癌病人預(yù)后因素的Cox回歸分析

3 討論

乳腺癌是多發(fā)于女性乳房腺上皮組織的婦科腫瘤，發(fā)病率較高，直接威脅女性生存情況［8］。因此，尋找與乳腺癌發(fā)病及預(yù)后有關(guān)的指標(biāo)，給予合適干預(yù)，對改善女性病人生存狀況有一定積極意義。

USP18 是泛素系統(tǒng)成員之一，其可介導(dǎo)蛋白泛素化，調(diào)控多種信號途徑，影響細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，USP18在結(jié)直腸癌中呈高表達，其可能通過泛素化途徑調(diào)控Snail1蛋白表達，進而促進結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移，從而在結(jié)直腸癌病理發(fā)展中起促進作用［11］。此外，Tan 等［12］通過基因富集分析、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)USP18 可能與乳腺癌病人癌細胞凋亡呈負相關(guān)、與乳腺癌病人不良預(yù)后關(guān)系密切，USP18 可能通過激活有關(guān)途徑，并上調(diào)表皮生長因子受體進而在乳腺癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，乳腺癌病人癌組織中USP18 蛋白陽性表達率、USP18 mRNA 表達水平較高，與Tan 等［12］研究結(jié)果及Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果相符，且乳腺癌組織USP18 表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乳腺癌分子亞型、腫瘤分化程度、TNM 分期相關(guān)，提示USP18 表達異常可能與乳腺癌分子亞型、病變進程有關(guān)，USP18 可能是治療乳腺癌的潛在靶標(biāo)，測定癌組織USP18 表達情況有助于臨床制定較為精準(zhǔn)的個體治療方案，推測高表達USP18 可能通過泛素化途徑調(diào)節(jié)多種蛋白異常表達，促進乳腺癌細胞異常增殖、轉(zhuǎn)移，影響其凋亡，從而促進乳腺癌病情進展［13］。

ISG15 是一種類泛素蛋白，其能通過酶級聯(lián)反應(yīng)修飾靶蛋白，調(diào)節(jié)蛋白活性，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)、RNA 剪接、蛋白質(zhì)翻譯等過程［14-16］。研究發(fā)現(xiàn)，ISG15在乳腺癌細胞中表達水平顯著升高，其可能參與乳腺癌發(fā)展進程，ISG15 可能是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵標(biāo)志物［17］；另外，王軍武等［18］發(fā)現(xiàn)ISG15在乳腺癌病人中呈高表達，ISG15可作為評估乳腺癌病人病情的潛在指標(biāo)。本研究中，乳腺癌病人癌組織中ISG15 蛋白陽性表達率、ISG15 mRNA 表達水平較高，與Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果一致，ISG15陽性表達率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期升高/分化程度降低而呈升高趨勢，且與乳腺癌分子亞型有關(guān)，提示ISG15 可能與乳腺癌病變進展及不同分子亞型乳腺癌顯著相關(guān)，檢測癌組織ISG15表達水平有利于判定乳腺癌分子亞型，制定有效的干預(yù)方案，究其原因，高水平ISG15可能通過修飾靶蛋白，影響有關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達，從而影響乳腺癌病變過程［19］。此外，本研究顯示，乳腺癌病人癌組織中USP18 表達水平與ISG15 呈正相關(guān)，提示USP18 可能與ISG15 共同影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展，可能原因，USP18 可影響ISG15 水平，進而影響乳腺癌進程。進一步研究顯示，USP18 陽性組、ISG15 陽性組乳腺癌病人術(shù)后60 個月生存率低于USP18 陰性組、ISG15 陰性組，提示癌組織USP18、ISG15 表達水平均與乳腺癌病人不良預(yù)后關(guān)系密切，USP18、ISG15表達水平越高，乳腺癌病人預(yù)后可能越差，USP18、ISG15 可輔助評估乳腺癌病人預(yù)后情況，但本研究與Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果并不一致，這可能與個體差異、分組情況、隨訪年限有關(guān)，后期將擴大樣本、延長隨訪年限，確定本研究的準(zhǔn)確性。Cox分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、TNM 分期越高、USP18、ISG15 表達水平升高均可能提高乳腺癌病人發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險，及時檢測乳腺癌組織USP18、ISG15表達情況可能有利于及早評估乳腺癌病人預(yù)后狀況。

綜上，USP18、ISG15 在乳腺癌病人癌組織均表達上調(diào)，兩者均與乳腺癌病人預(yù)后有關(guān)，測定癌組織USP18、ISG15 水平有利于臨床判斷乳腺癌病人病情、評估乳腺癌病人預(yù)后。本研究創(chuàng)新點在于：利用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析了USP18、ISG15在乳腺癌中的表達情況，并從mRNA 水平（qRT-PCR）和蛋白水平（免疫組化）驗證了USP18、ISG15 在乳腺癌中的表達情況，初步分析了USP18、ISG15間的相關(guān)性，及二者與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床評估乳腺癌病人病情及預(yù)后提供參考，但存在一定局限性，后期將進一步擴大樣本量分析不同分子分型中ISG15、USP18與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。