柴胡疏肝散對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠瞬時受體電位香草酸亞型1/降鈣素基因相關(guān)肽通路及坐骨神經(jīng)電生理變化的影響

王陽陽，黃霄云，馮茂勝

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組代謝性疾病，與胰島素分泌受損或細胞對該激素作用的抵抗有關(guān)［1］。糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是DM 最復(fù)雜的病理改變之一，據(jù)估計，大約一半的DM病人存在這種情況［2-3］。因此，探究DPN 的致病機理及影響因素，對于預(yù)防嚴(yán)重的DPN 并發(fā)癥至關(guān)重要［4］。柴胡疏肝散近年來被廣泛用于治療多種病癥，可疏肝理氣、活血止痛，如2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）合并高脂血癥等［5］。瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor poten?tial vanlloid 1，TRPV1）可在多種物理、化學(xué)因素刺激下參與痛覺整合、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸等生理和病理過程［6］。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是由感覺神經(jīng)元釋放的一種肽類物質(zhì)，可將感覺信息傳遞給中樞系統(tǒng)以調(diào)節(jié)神經(jīng)活動［7］。研究證實，過表達CGRP 能夠促進神經(jīng)血管擴張，增加血流，改善DPN［8］。同時，TRPV1 激活后可促進CGRP 等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，具有擴張血管和利尿的作用［9］。因此本研究通過建立DPN 大鼠模型，檢測應(yīng)用柴胡疏肝散治療DPN 大鼠后對TRPV1/CGRP 通路的影響，以期發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散在DPN中的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 2019年12月至2020年9月，從北京生命科學(xué)研究所動物實驗中心［合格證號為SYXK（京）2015-0002］購入40只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量范圍為150~180g，飼養(yǎng)在適宜的溫度和濕度下。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.1.2藥品 柴胡疏肝散：柴胡、陳皮各6 g，白芍、枳殼、川芎、香附各4.5 g，炙甘草1.5 g，由廣州致信藥業(yè)有限公司提供，藥材經(jīng)冷水浸泡2 h，常規(guī)兩煎，混合煎液并過濾，經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥1.26 g/mL 的濃縮藥，高壓滅菌后冷藏備用。彌可保（江蘇衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號20190318）；鏈脲佐菌素（strep?tozotocin，STZ；美國Sigma 公司，批號20190607）；兔抗鼠TRPV1、CGRP、腫瘤壞死因子-α（tumor necro?sis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）一抗（英國Abcam 公司，貨號ab120099、ab272713、ab215188、ab197447）；HE 染色試劑盒（德國默克公司，批號G1120）；二喹啉甲酸（bicinchonin?ic acid，BCA）試劑盒（美國賽默飛公司，貨號A53225）；考馬斯亮藍試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆浱朘L-D3297）。

1.1.3實驗設(shè)備 GIS-500 凝膠成像儀（上海艾研生物科技有限公司，貨號1708195）；肌電圖儀（丹麥丹迪醫(yī)療公司，型號Keypoint-4）；血糖儀（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，型號拜安捷2）；CX43 光學(xué)顯微鏡（濟南歐萊博電子商務(wù)有限公司，貨號CX43）。

1.2 方法

1.2.1模型建立 隨機選取5 只大鼠為對照組（給予普通飼料喂養(yǎng)），其余大鼠用于造模。造模大鼠采用高脂飼喂4 周，以誘發(fā)胰島素抵抗。隨后大鼠禁食14 h，再給予小劑量STZ（25 mg/kg，溶于0.1 mol/L、pH 4.5 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，將STZ 配置為1%的溶液，經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌）。對照組給予等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。3 d后從尾靜脈采血，用血糖儀測定空腹血糖（fasting blood sugar，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG≥13.8 mmol/L，確定為DM 大鼠，用于實驗。DM 大鼠再繼續(xù)高糖高脂飼喂8 周，使用肌電圖儀對大鼠下肢坐骨神經(jīng)的感覺和運動傳導(dǎo)速度進行檢測，若大鼠感覺或運動傳導(dǎo)速度減慢超過11%，則表示成功建立DPN 模型［10］。在實驗過程中有5 只大鼠死亡或造模失敗，成功建立DPN模型30只。

1.2.2分組與給藥 將DPN 模型大鼠隨機分為模型組（n=5）、彌可保組（n=5）、低中高劑量柴胡疏肝散組（每組n=5）。參考文獻［11］彌可保組按1 次/天，175 μg/kg 劑量灌胃給藥，參考文獻［12］柴胡疏肝散低中高劑量分別按照1 次/天，3.15 g/kg、6.30 g/kg、12.60 g/kg灌胃給藥，連續(xù)給藥8周。

1.2.3各組大鼠擺尾溫度閾值檢測 給藥8周后，將大鼠放置于寬松的籠內(nèi)，露出尾部，用恒溫加熱儀（每分鐘加熱2 ℃），加熱水溫，水溫從20 ℃開始將鼠尾浸入水中約2 cm，鼠尾因水溫過高而擺動并露出水面時記錄水溫，此時水溫即為擺尾溫度閾值。

1.2.4各組大鼠運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）的測定 第8周末采用1%戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，使用肌電圖儀檢測大鼠下肢MNCV，觀察MNCV 及其支配肌復(fù)合運動動作電位的波幅（AMP）、潛伏期（LAT）的變化。在腘窩下1~2 cm 處經(jīng)皮插入2 個針電極（電極間距1 cm）用方波（10~15 mA，0.1 ms 脈波寬，頻率1 Hz）刺激神經(jīng)，在距刺激電極2~3 cm 處的同側(cè)脛前肌記錄肌肉動作電位。兩個刺激部位間的距離用彎腳規(guī)測量，運動神經(jīng)在兩個刺激部位間的傳導(dǎo)時間為潛伏期差，計算MNCV（距離/潛伏期差值），記錄AMP、LAT變幅。

1.2.5qRT-PCR 法檢測大鼠血清TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平 采用腹主動脈取血，離心分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩rizol 法提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 行qRT-PCR 擴增。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Mix，1 μL cDNA模板，0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，8 μL雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min 的40 個循環(huán)，72 ℃、10 min。2-??Ct方法對mRNA 表達水平進行定量，并標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6HE 染色觀察大鼠坐骨神經(jīng)病理學(xué)變化 解剖后取坐骨神經(jīng)組織于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，切片經(jīng)脫蠟、水化后，用蘇木素染色10min，滴加伊紅染液復(fù)染5 min 后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織病理變化。另切除約50 mg 大鼠坐骨神經(jīng)組織，用于蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠坐骨神經(jīng)中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平 取坐骨神經(jīng)組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶將膜封閉2 h 后，與一抗TRPV1（1∶1 000）、CGRP（1∶1 000）、TNF-α（1∶5 000）、IL-1β（1∶2 500）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 清洗5 min×3次。加入二抗（1∶15 000）在室溫下反應(yīng)2 h，ECL 顯色，凝膠成像儀觀察蛋白條帶。Image J軟件分析條帶灰度值，并以β-actin 為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均符合正態(tài)分布表示為±s，單因素方差分析和SNK-q檢驗用于三組及以上的組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)對照組大鼠精力充沛，活動靈活，飲食正常；模型組大鼠活動減少，毛發(fā)枯黃無光澤，呈多飲、多食、多尿癥狀；彌可保組大鼠飲食及排泄均正常，活動較多，與對照組相似；柴胡疏肝散組大鼠較模型組“三多”癥狀減輕，飲食逐漸恢復(fù)，劑量越高狀態(tài)越好。

2.2 各組大鼠擺尾溫度閾值及MNCV 的比較與對照組相比，模型組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 升高，MNCV、AMP 降低（P<0.05）；與模型組相比，彌可保組、低中高劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 降低，MNCV、AMP 升高（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT升高，MNCV、AMP降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠擺尾溫度閾值、MNCV、AMP、LAT的比較/± s

表2 各組大鼠擺尾溫度閾值、MNCV、AMP、LAT的比較/± s

注：MNCV為運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度，AMP為肌復(fù)合運動動作電位的波幅，LAT為潛伏期。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)病理變化正常組大鼠坐骨神經(jīng)纖維及髓鞘排列緊密，厚度均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠神經(jīng)細胞周圍觀察到大量浸潤性巨噬細胞和單核細胞，并伴有廣泛的軸突脫髓鞘。彌可保組大鼠神經(jīng)內(nèi)膜和髓鞘的廣泛軸突腫脹和水腫較少，中性粒細胞浸潤較少，并且沒有可觀察到的脫髓鞘。低劑量柴胡疏肝散組髓鞘腫脹，巨噬細胞周圍有單核細胞浸潤以及程度較輕的脫髓鞘。中劑量柴胡疏肝散組神經(jīng)外膜周圍輕度水腫，血管周圍浸潤性中性粒細胞減少以及神經(jīng)纖維僅輕微腫脹。高劑量柴胡疏肝散組神經(jīng)纖維形態(tài)恢復(fù)正常，但周圍伴有少量中性粒細胞浸潤。見圖1。

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1βmRNA 水平的檢測與對照組相比，模型組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，彌可保組及低中高劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平均降低（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平的檢測/± s

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平的檢測/± s

注：TRPV1為瞬時受體電位香草酸亞型1，CGRP為降鈣素基因相關(guān)肽，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β，GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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2.5 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織TRPV1、CGRP、TNFα及IL-1β蛋白表達水平與對照組相比，模型組TRPV1、CGRP、TNF-α 及IL-1β 蛋白水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，彌可保組及低中高劑量柴胡疏肝散組上述蛋白水平均降低（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組上述蛋白水平均升高（P<0.05）。見表4，圖2。

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平/± s

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平/± s

注：TRPV1為瞬時受體電位香草酸亞型1，CGRP為降鈣素基因相關(guān)肽，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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3 討論

DM已成為全球公共衛(wèi)生危機，國際糖尿病聯(lián)合會估計，2017 年全球DM 病人為4.51 億（18~99歲）［13］。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和工業(yè)化進程的加快，生活方式的改變和人口老齡化，我國DM的患病率持續(xù)上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2005—2015年，中國因DM及相關(guān)心血管疾病造成的經(jīng)濟損失達5 577億美元［14］。DPN是DM常見的慢性并發(fā)癥，最常見的表現(xiàn)是伴有感覺喪失的遠端退行性多發(fā)性神經(jīng)病變，約20%~30%的病人可能會出現(xiàn)神經(jīng)性疼痛，由于疼痛、感覺喪失、步態(tài)不穩(wěn)、足部潰瘍甚至截肢，很多DPN 病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降［15］。此外，這些并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展會導(dǎo)致視力和神經(jīng)功能喪失，活動和認(rèn)知能力受損，生活質(zhì)量下降，如果不進行控制或治療，可能會造成不可逆的損害甚至死亡。

中醫(yī)將DPN 歸屬于“消渴”繼發(fā)的痹癥、麻木、痛癥、痿癥等范疇，是病久失治、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過度所致，參照《糖尿病中醫(yī)防治指南》中對DPN 的描述，可將很多DPN 病人歸于肝腎虧虛型，這類病人伴有肢體麻木、疼痛，肌肉萎縮、腰膝酸軟、頭暈耳鳴等癥狀。柴胡疏肝散包含多種中藥材，其中柴胡善疏泄肝氣而解郁，具有抗炎和鎮(zhèn)痛的作用。此外，香附有疏肝理氣止痛的功效；陳皮性辛、苦，可理氣健脾、燥濕化痰；川芎具有鎮(zhèn)痛、抗血栓、擴血管等作用［16］。張鵬翔等［17］發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散能改善DPN 病人血液流變學(xué)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，清除氧自由基，提高感覺和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度，降低血糖。研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的DM大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘損傷明顯，MNCV 降低［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后大鼠活動減少，毛發(fā)枯黃無光澤，呈多飲、多食、多尿的“三多”癥狀；與對照組相比，低中高劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 升高，MNCV、AMP 降低。提示DM 大鼠造模成功，用藥后大鼠對熱敏度及運動神經(jīng)功能均有所提高，且改善效果呈劑量依賴性。

神經(jīng)肽是近年來發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物活性的神經(jīng)遞質(zhì)，其中CGRP 備受關(guān)注，CGRP 具有很強的生物活性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。CGRP 通過偶聯(lián)G 蛋白將信號通過第二信使環(huán)磷酸腺苷傳遞到細胞中，是許多生理效應(yīng)的關(guān)鍵，使其成為DM、疼痛、炎癥和其他疾病或疾病相關(guān)癥狀的發(fā)展和進展的積極參與者，但目前對CGRP 在DPN 中的作用及其機制的研究卻很少。CGRP 的釋放依賴于神經(jīng)元感覺神經(jīng)末梢或膜上TRPV 的存在。TRPV1是TRPV 家族的重要成員，也是與神經(jīng)源性炎癥相關(guān)的重要傷害感受器［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1 還可通過降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，下調(diào)TNF-α、IL-1β水平，從而抑制小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)［20］。研究顯示，小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致坐骨神經(jīng)損傷，而坐骨神經(jīng)損傷則導(dǎo)致坐骨神經(jīng)功能下降和電生理的改變，這也被視為慢性神經(jīng)性疼痛的主要原因［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較低中高劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 及蛋白水平均降低。提示DPN 與TRPV1、CGRP 信號通路的異常表達及炎癥水平有關(guān)，猜測在病理狀態(tài)下，由于柴胡疏肝散抑制了TRPV1 表達，引起CGRP 及TNF-α、IL-1β 等炎性因子表達水平降低，從而減輕大鼠坐骨神經(jīng)的炎癥反應(yīng)，最終改善DPN癥狀。

綜上所述，柴胡疏肝散可能通過抑制TRPV1，降低CGRP 及TNF-α、IL-1β 等炎性因子表達水平，提高大鼠坐骨神經(jīng)功能，達到改善DPN 的作用。但本研究也存在未檢測神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)因子等試驗，有待后續(xù)深入研究。

（本文圖1見插圖7-1）