中藥金貫藍(lán)提取物對尋常痤瘡相關(guān)致病菌的體外抑菌作用

萬春梅，石春蕊，廖蓓，魏玉輝，高軍，張劍虹

尋常痤瘡（acne vulgaris， AV）是一種常見的以毛囊皮脂腺為單位的慢性炎癥性皮膚?。?］。目前公認(rèn)四大因素與AV 致病高度相關(guān)：毛囊皮脂腺角化過度、皮脂溢出、痤瘡致病相關(guān)微生物的繁殖及繼發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)［2］。其中，痤瘡丙酸桿菌（Cuti?bacterium acnes或Propionibacteriumacnes， C. acnes或P. acnes）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermi?dis， S. epidermidis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococ?cus aureus， S. aureus）為代表的痤瘡相關(guān)致病菌的增殖，可能在AV致病中發(fā)揮重要作用［2-4］。

針對AV 致病菌及炎癥反應(yīng)，抗生素治療是重要治療手段之一。然而，抗生素的廣泛使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性形成和耐藥菌株的傳播［5］。因此，安全有效治療AV 仍然是我們亟須解決的難題，許多研究者嘗試尋找新的替代治療來解決該問題。既往相關(guān)研究報道很多中草藥具有較好的抗菌活性，它們安全無毒、價格低廉且不易產(chǎn)生耐藥性，對AV 具有潛在治療價值［6-8］。

金貫藍(lán)提取物是蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科魏玉輝主任根據(jù)中醫(yī)的“君臣佐使”配伍原則，將五味傳統(tǒng)中草藥（金銀花、貫眾、板藍(lán)根、甘草、黃芪）經(jīng)優(yōu)化配比制定的醫(yī)院協(xié)定方劑。既往已有大量文獻(xiàn)報道金銀花、板藍(lán)根、甘草、貫眾、黃芪均有不同程度抑菌活性［9-12］。我們推測金貫藍(lán)提取物可能對AV 有一定的治療價值，但目前中草藥抑菌作用相關(guān)研究多選用單味藥，復(fù)方中草藥提取物的研究較少。本研究開展體外實驗評價金貫藍(lán)提取物對AV相關(guān)病原菌的體外抗菌活性，為該新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材實驗組藥物：中藥復(fù)方“金貫藍(lán)”為蘭州大學(xué)第一醫(yī)院協(xié)定組方，由金銀花（河南，批號200601）、貫眾（吉林，批號200202）、板藍(lán)根（甘肅，批號200501）、黃芪（甘肅，批號191001）、甘草（甘肅，批號200303）五味中藥組成，以上藥材均購于甘肅隴脈藥材有限公司。金貫藍(lán)提取物是由金銀花、貫眾、板藍(lán)根、黃芪、甘草按照質(zhì)量最佳比例為1∶1∶1∶3∶1 提取組成，生藥濃度為1 g/mL，提取率為28.7%。

陽性對照藥：紅霉素（批號C11119014）、克林霉素（批號C11860980）、夫西地酸鈉（批號C12052162）均購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 菌株C. acnes標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC6919），上海富祥科技有限公司；S. epidermidis標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC12228）和S. aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株（SAU Newman）由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院菌種保藏中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備寶特ELx800 酶標(biāo)儀（濟南奧諾生物工程有限公司）；紫外線可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；真空冷凍干燥機（上海般諾生物科技有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；冷凍干燥機（上海比朗儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1金貫藍(lán)提取物溶液和對照組溶液制備 金貫藍(lán)提取物溶液：取金貫藍(lán)提取物溶解于無菌蒸餾水中，分別配置成濃度為500 g/L、250 g/L、100 g/L的溶液，0.22 μm孔徑濾菌器過濾除菌，備用。

陽性對照組：克林霉素、紅霉素、夫西地酸溶解在適當(dāng)溶劑中，得到藥物溶液，均采用0.22 μm 孔徑濾菌器過濾除菌，備用。

陰性對照組：無菌生理鹽水，備用。

1.4.2菌懸液制備 本研究用強化梭菌液體培養(yǎng)基（reinforced clostridium medium，RCM）和固體培養(yǎng)基（reinforced clostridium agar， RCA）培養(yǎng)C. acnes，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，調(diào)整菌懸液濃度為1×106CFU/mL，備用；采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptic soy agar， TSB）和胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基（tryptic soy broth， TSA）培養(yǎng)S. epidermidis、S. aureus，37 ℃需氧培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌懸液濃度為1×106CFU/mL，備用。

1.4.3抑菌活性測定（瓊脂打孔法） 本實驗采用國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS 2020）推薦的瓊脂打孔法［13］測抑菌圈直徑。將濃度為1×106CFU/mL的三種菌懸液分別均勻涂布在相應(yīng)固體平板上，將80 μL 不同濃度金貫藍(lán)提取物（終濃度分別為500 g/L、250 g/L 和100 g/L）加至預(yù)先制備好的瓊脂孔內(nèi)，加入80 μL 生理鹽水作為陰性對照組，蓋好皿蓋。S. epidermidis、S. aureus正置于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h 后觀察結(jié)果；C. acnes正置于厭氧盒中，放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后觀察結(jié)果。同一濃度平行重復(fù)3 次，測量每組抑菌圈直徑取平均值。

1.4.4最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定 本實驗由NCCLs 推薦的微量稀釋法［13］改進而來，采用96 孔板測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory con?centration，MIC）。在96 孔板第1 列孔中分別加入180 μL 菌液，20 μL 相應(yīng)藥物，使金貫藍(lán)提取物終濃度為100 g/L，抗生素組為1 mg/L，第2~10 列孔分別加入100 μL 菌液。吹打混勻后吸取第1 列每孔100 μL 液體至第2 列，以此類推，連續(xù)倍比稀釋9個濃度。使金貫藍(lán)提取物濃度分別為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3、0.390 6 和0.195 3 g/L，紅霉素、克林霉素及夫西地酸濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8、0.003 9 和0.002 mg/L，設(shè)置陽性對照組（僅含菌液）及陰性對照組（空白培養(yǎng)液），如圖1 所示。S.epidermidis、S. aureus于37 ℃培養(yǎng)16 h，C. acnes厭氧條件下培養(yǎng)48 h，孔內(nèi)液體清亮則判讀為MIC。將≥MIC 藥物濃度的含菌培養(yǎng)液涂板，再將平板于37 ℃培養(yǎng)24 h（C. acnes厭氧條件下培養(yǎng)48 h），觀察有無細(xì)菌生長，以平板中計數(shù)≤5 個菌落作為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

圖1 金貫藍(lán)提取物分別對痤瘡丙酸桿菌（A）、表皮葡萄球菌（B）和金黃色葡萄球菌（C）的抑菌圈平板圖

1.4.5抑菌曲線的測定 將濃度分別為MIC、0.8 MIC、0.5 MIC 藥物組和不加藥的空白對照組振蕩培養(yǎng)后，每隔2 小時用酶標(biāo)儀測定S. epidermidis、S. au?reus在630 nm 的光密度（optical density， OD）值，每隔4 h測定C. acnes的OD 值。實驗平行測定3次，繪制生長曲線。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。服從正態(tài)分布的不同組間計量資料相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；不服從正態(tài)分布或不同組間的等級資料相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 抑菌活性測定藥敏結(jié)果顯示，空白組無抑菌圈產(chǎn)生，不同濃度的實驗組均有抑菌圈。500 g/L 金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直徑分別為（27.67±2.52）mm、（23.33±1.53）mm、（22.00±1.00）mm；濃度為250 g/L 金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直徑分別為（22.33±0.58）mm、（20.67±1.53）mm、（20.11±1.20）mm；濃度為100 g/L 金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的抑菌圈直徑分別為（13.30±0.75）mm、（10.67±1.53）mm、（10.67±0.58）mm。通過Pearson 相關(guān)分析，說明抑菌圈直徑與金貫藍(lán)提取物濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r>0.90，P<0.001），見圖1，表1。

表1 金貫藍(lán)提取物對三種菌的抑菌圈直徑

2.2 MIC 和MBC金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S.epidermidis、S. aureus的MIC均為25 g/L；MBC分別為50 g/L、50 g/L、25g/L。陽性對照紅霉素對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 分別為0.125 mg/L、0.125 mg/L、0.25 mg/L；MBC 分別為0.25 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L；克林霉素對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 為0.031 mg/L、0.031 mg/L、0.063 mg/L；MBC 為0.063 mg/L、0.125 mg/L、0.125 mg/L；夫西地酸對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 為0.625 mg/L、5 mg/L、5 mg/L；MBC 為2.5 mg/L、10 mg/L、10 mg/L，見表2。

表2 金貫藍(lán)提取物對三種菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度

2.3 抑菌曲線結(jié)果不同濃度金貫藍(lán)提取物對C.acnes生長情況測定結(jié)果如圖2A 所示，不加藥物的空白對照組在第16 小時進入對數(shù)生長期，第44 小時進入穩(wěn)定生長期；加入0.5 倍MIC 濃度的藥物后，C. acnes在第24 小時進入對數(shù)生長期，第64 小時進入穩(wěn)定生長期；加入0.8 倍MIC 濃度的藥物后，C.acnes在第28 小時進入對數(shù)生長期，0.5 MIC 及0.8 MIC兩組OD值明顯低于空白對照組，且隨藥物濃度增大OD值降低越明顯；MIC濃度的藥物中細(xì)菌未見生長；這組數(shù)據(jù)表明金貫藍(lán)提取物能明顯抑制C.acnes的生長，延長C. acnes遲緩期，并隨著藥物濃度增加抑菌效果越明顯。

圖2 金貫藍(lán)提取物分別對痤瘡丙酸桿菌（A）、表皮葡萄球菌（B）和金黃色葡萄球菌（C）的抑菌曲線

不同濃度金貫藍(lán)提取物對S. epidermidis生長情況測定結(jié)果如圖2B 所示，空白對照組S. epidermidis在第4 小時進入對數(shù)生長期，第16 小時進入穩(wěn)定生長期；加入0.5 倍MIC 濃度的藥物后，S. epidermidis在第8 小時進入對數(shù)生長期，第20 小時進入穩(wěn)定生長期；加入0.8倍MIC 濃度的藥物后，細(xì)菌在第16小時進入對數(shù)生長期，并且通過OD 值測定，這兩組細(xì)菌量較空白組明顯減少；MIC 濃度的藥物細(xì)菌未見生長；這組數(shù)據(jù)表明金貫藍(lán)提取物能明顯延長S.epidermidis的遲緩期，抑制S. epidermidis的生長，且隨藥物濃度增加抑菌效果越明顯。

不同濃度金貫藍(lán)提取物對S. aureus的生長情況測定結(jié)果如圖2C 所示，空白對照組S. aureus在第2 小時進入對數(shù)生長期，第12 小時進入穩(wěn)定生長期。加入0.5 倍MIC 濃度的藥物時，S. aureus在第4小時進入對數(shù)生長期，第20 小時進入穩(wěn)定生長期；加入0.8 倍MIC 濃度的藥物時，細(xì)菌在第8 小時進入對數(shù)生長期，第20 小時進入穩(wěn)定生長期，OD 值結(jié)果示0.5 MIC 及0.8 MIC 兩組OD 值明顯低于空白對照組，且隨藥物濃度增大，OD 值降低越明顯。加入MIC 濃度的藥物時，細(xì)菌未見生長。這組數(shù)據(jù)表明金貫藍(lán)提取物能明顯延長S. aureus的遲緩期，抑制S. aureus生長，且隨藥物濃度增加抑菌效果越明顯。

3 討論

雖然AV 的發(fā)病機制尚未完全闡明，但現(xiàn)階段普遍認(rèn)為AV 除了與性激素水平異常、皮脂分泌過多以及皮脂腺導(dǎo)管過度角化有關(guān)外，C. acnes導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在AV 發(fā)生發(fā)展中也起重要作用［14］。此外，皮膚微生物組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AV發(fā)病還與S. epider?midis、S. aureus等需氧菌混合感染相關(guān)［15-17］。因此，抑制AV 相關(guān)致病菌成為治療AV 的重要手段?？股厥侵委烝V 的常規(guī)藥物，然而全球范圍內(nèi)抗生素長期且頻繁使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加［18］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)中藥治療AV 不良反應(yīng)小、耐藥性發(fā)生率低［19］，引起眾多學(xué)者關(guān)注。

本研究中藥方劑由金銀花、貫眾、板藍(lán)根、黃芪、甘草五味中藥按一定比例配伍而成。金銀花為君藥，性寒，除清熱解毒外［20］，還具有較強抗菌效果，臨床上已用于治療多種感染性疾?。?1］。板藍(lán)根、貫眾共為臣藥，板藍(lán)根味苦性寒，具有涼血、清熱解毒之功［22］，常與金銀花配合，用于治療細(xì)菌感染性疾病［23］。有研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根水提物對S. epider?midis、S. aureus等多種細(xì)菌具有抑制作用［24］。貫眾性微寒，主要功效為清熱解毒、涼血止血，在抑制S.epidermidis、S. aureus活性方面與頭孢西丁效果相當(dāng)［25］。黃芪為佐藥，性溫，有益衛(wèi)固表、托瘡生肌等功效［26］，有助于AV 皮損的修復(fù)。由于金銀花、板藍(lán)根、貫眾藥性寒涼，黃芪性溫，故在此方中用量大，一溫一寒，兼可調(diào)和藥性，以達(dá)到互補的治療作用，符合中醫(yī)理論。甘草為使藥，味甘性平，益氣健脾，調(diào)和諸藥，古有“國老”之稱［27］。綜上，金貫藍(lán)提取物全方謹(jǐn)遵君臣佐使配伍原則，主從有序，各司其職，陰陽平衡，配伍合理；又切合AV 發(fā)病機制，推測其對AV具有一定的治療意義。

本實驗得出500 g/L、250 g/L、100 g/L 的金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epidermidis、S. aureus均有抑制作用，且藥物濃度越高，抑菌圈直徑越大，相關(guān)性分析示r>0.90，P<0.001，說明抑菌效果與藥物濃度具有顯著相關(guān)性。500 g/L、250 g/L 金貫藍(lán)提取物的抑菌圈直徑均大于20 mm，表明金貫藍(lán)提取物對AV 致病菌具有較強抑制作用，而100 g/L 金貫藍(lán)提取物的抑菌圈直徑大于10 mm，進一步提示較低濃度提取物對AV 相關(guān)致病菌也具有一定抑制作用。該實驗結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)中草藥抑菌實驗結(jié)果相一致［28-29］?？瞻讓φ战M固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基清亮，未受到污染，說明實驗結(jié)果可信；每組實驗設(shè)置3 次重復(fù)，證明了實驗的可重復(fù)性，實驗結(jié)果偏差小。

通過肉湯微量稀釋法測定該提取物對三種菌的MIC 和MBC 值。結(jié)果為金貫藍(lán)提取物對C.acnes、S. epidermidis、S. aureus的MIC 值均為25 g/L，說明金貫藍(lán)提取物對三種菌的抑制效果相當(dāng)。金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epidermidis兩種細(xì)菌的MBC 值高于MIC 值，進一步提示金貫藍(lán)提取物可能對C. acnes、S. epidermidis這兩種細(xì)菌僅具有抑菌作用；而對S. aureus的MIC 和MBC 值相同，表示金貫藍(lán)提取物可能對S. aureus有殺菌作用。此外，金貫藍(lán)提取物抑菌作用弱于抗生素組，這與其他具有抑制C. acnes作用的中草藥提取物結(jié)果一致［30］。它們對AV 相關(guān)致病菌的MIC 等級為g/L，少數(shù)為mg/L。雖然這些抑菌實驗受到提取物、菌株、培養(yǎng)條件等因素的影響，但我國中草藥抑菌實驗大多數(shù)選用提取物，實驗條件基本相同，本實驗與國內(nèi)實驗數(shù)據(jù)具有一定可比性。

繪制細(xì)菌生長曲線能直觀看出菌群的生長規(guī)律，藥物對菌群生長的影響，以及療效隨時間的變化。結(jié)果表明金貫藍(lán)提取物能抑制細(xì)菌生長，細(xì)菌遲緩期持續(xù)時間比對照組長，且隨藥物濃度增加抑制作用增強。

本實驗得出金貫藍(lán)提取物對C. acnes、S. epider?midis、S. aureus具有一定抑菌效果，且與藥物濃度存在顯著相關(guān)性，具有進一步研究和開發(fā)的價值；但受時間、經(jīng)費等條件限制，本研究未進行抑菌機制的深入探索；該藥物療效也需相關(guān)臨床試驗數(shù)據(jù)支持，以上是我們進一步的研究方向。