激素刺激降香黃檀心材類物質形成分析

何文杰 張 賽 祝遠靜 李佳文 楊 云 孟 慧

（1.中國醫(yī)學科學院 北京 100193；2.北京協(xié)和醫(yī)學院/藥用植物研究所海南分所/海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室 海南萬寧 571533）

降香黃檀（Dalbergia odorifera T.Chen）是海南特有的珍稀瀕危樹種， 莖干和根部干燥心材為名貴中藥材“降香”，其性味辛、溫，兼有行氣活血、止痛止血功效[1-3]。 降香黃檀在自然條件下成材極緩慢，主干分枝較多，直立挺拔者少，一般種植7～10 年才開始形成心材，30～40 年方可成材， 且相同樹齡的降香黃檀心材直徑和含油量差異也較大。

隨著植物次生代謝物形成和積累研究發(fā)現(xiàn)，次生代謝物產生與激素脅迫等相關，人們在研究心邊材時也發(fā)現(xiàn)心材形成與激素相關，Shigo L.和Hillis W.E.[4]早在1973 年就發(fā)現(xiàn)乙烯利促進輻射松心材內多酚成分的產生；Davison 和Young[5]研究蘋果樹、桃樹、楓樹、 柳樹等樹木邊材時發(fā)現(xiàn)其內含有一定量的脫落酸；張仲偉等[6]研究土魯香割脂試驗時，采用乙烯利處理后采收香脂， 發(fā)現(xiàn)處理后比火烙刺激及對照更快結香， 證明樹脂產生速度與刺激物及溫度等外界因素呈正相關；林勵等[7]研究發(fā)現(xiàn)激素及風害等外界刺激能促使檀香心材形成；林奇藝等[8]對幾種激素刺激檀香心材形成研究發(fā)現(xiàn)，2%乙烯利對心材的形成及揮發(fā)油含量有促進作用。 在生物力學、水力學[9]及分子生物學[10]等方向研究心材形成也獲得較大突破，均發(fā)現(xiàn)心材的形成與激素相關，認為木質部邊材向心材轉變的過程中， 有一種或幾種激素類物質發(fā)揮著關鍵作用，是樹木的一個發(fā)育過程，而不是由木薄壁細胞死亡引起的[11]，只是心材形成后的一個結果[12-14]。

為了闡述上述問題， 本研究主要針對心材發(fā)育特點，開展外施激素和物理傷害等手段，篩選促進心材形成的誘導因子，以探索加速心材形成的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 選取3 齡尚未形成心材的降香黃檀幼樹為試驗樣品，30 齡降香黃檀樹邊材為陰性對照，均種植在興隆南藥園實驗地，長勢良好；天然降香黃檀莖干部心材為標準品，依據(jù)2020 版《中國藥典》鑒定為正品。

1.1.2 儀器 AO860 滑走切片機、KH-3000 型薄層色譜掃描儀、GOODLOOK-1000 型薄層色譜成像系統(tǒng)、SP-II 型薄層電動點樣器。

1.1.3 試劑 降香揮發(fā)油對照品購于中國藥品生物制品檢定所，批號為111579-200201；激素購于SIGMA 公司；其他化學試劑為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 激素篩選 設3 種激素（乙烯利、赤霉素、水楊酸）、3 種劑量（1%、2%、4%）、3 種施藥方法（刮皮法：為莖干刮去表皮，涂藥封口；砍傷法：為莖干砍傷至木質部，涂藥封口；鉆洞法：為莖干鉆洞，藥液注入洞中）進行處理，并設蒸餾水為對照、不處理正常植株為空白對照。 共31 個處理， 每個處理6 株樹，共3 次重復；每年施藥4 次，連續(xù)處理1 年。 心材形成觀察： 施藥前及施藥后定期于原處理處觀察木材顏色變化，處理后截取傷口至上方20 cm 處莖干，觀察木材色澤、氣味、木材顯微特征、導管堵塞率。

1.2.2 薄層色譜分析

（1）樣品溶液制備：取上述人工樣品各2.0 g，加乙醚20 mL， 置水浴上加熱回流25 min（水溫設置為42℃），過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀除去乙醚后加無水乙醇定容于5 mL 容量瓶內，待用。

（2）對照品溶液制備：取天然降香心材粉末及邊材粉末各2.0 g，方法同上。

（3）橙花叔醇溶液制備：橙花叔醇標準品與無水乙醇按1∶10 的體積比配成溶液，待用。

（4）顯色劑香草醛硫酸溶液制備：香蘭素1 g 與濃硫酸100 mL 配成香草醛硫酸溶液，再與無水乙醇按1∶9 的比例配成混合溶液，待用。

按照2020 年版《中國藥典》中介紹的降香薄層色譜鑒定法，用微量進樣器分別吸取人工樣品溶液、對照品溶液、橙花叔醇溶液各30 μL，點于同一塊硅膠G 薄層板上（20 cm×20 cm），點樣直徑為1～2 mm，以甲苯-乙醚-氯仿（7∶2∶3.5）為展開劑，展開，取出，晾干，通過薄層色譜成像系統(tǒng)分別在254 nm 和365 nm的光源下成像觀察。

2 結果與分析

2.1 不同激素間誘導效果比較

比較3 種激素處理方法， 其中刮傷樹皮涂抹激素后木材顏色沒變化，說明心材的形成主要與木質部相關， 而砍傷涂抹激素和鉆洞注射激素的處理方法均誘導形成變色木材，且鉆洞注射效果更佳（圖1）。同時對比乙烯利、赤霉素、水楊酸3 種激素誘導心材的形成效果， 乙烯利處理的影響范圍及強度明顯大于赤霉素、水楊酸和蒸餾水對照，處理1 個月后木材顏色發(fā)生變化，6 個月后傷口縱向形成紅褐色至紫紅色的變色木材。 從導管堵塞率看（表1），誘導面積最廣，平均延伸距離在14 cm 以上，且燃燒時有中藥降香氣味；赤霉素處理組在洞口處誘導效果最好，但延伸距離短；水楊酸處理組在0～5 cm 范圍內導管堵塞率與乙烯處理組類似， 但變色木材顏色為灰黑色壞死狀，經檢測其阻塞物質不同于其他處理組；蒸餾水對照株僅傷口處形成淺黃色的少量變色木材。 隨著激素濃度升高對植物營養(yǎng)生長抑制作用明顯加大，激素4%濃度時3 齡降香黃檀均出現(xiàn)落葉現(xiàn)象，僅1%濃度處理的樹木能正常生長。

表1 1%濃度激素處理后導管堵塞率

圖1 不同激素誘導效果

2.2 天然心材與誘導心材宏觀比較

通過降香黃檀道地產區(qū)的走訪調查和栽培過程觀察可知，正常生長的降香黃檀樹7～10 齡開始形成心材，之后植株生長即變得極其緩慢。30 齡左右的降香黃檀樹，心邊材比例為1∶4（圖2 A）；降香黃檀樹受到機械創(chuàng)傷或蟲蛀，會在創(chuàng)傷面、蟲道周圍形成心材類物質 （圖2 B 是斷枝后傷口受到蟲蛀形成的心材類物質， 圖2 C 是外施乙烯利6 個月觀察到心材類物質產生）。

圖2 降香黃檀天然心材與誘導心材形成情況

2.3 天然心材與乙烯利后木材顯微特征觀察

在光學顯微鏡下觀察30 齡降香黃檀心材和乙烯利處理3 齡降香黃檀變色木材顯微切片， 發(fā)現(xiàn)處理后變色木材中部分導管及周圍薄壁細胞被紅褐色至紫褐色的心材類物質填充， 其顯微特征與天然心材相同（圖3）。

圖3 降香黃檀木材顯微結構

2.4 薄層色譜鑒定

采用GOODLOOK-1000 型薄層色譜成像系統(tǒng)對圖4 中各樣品的RF 值進行相似度比對，發(fā)現(xiàn)經過激素處理樣品中都含有標準品（降香揮發(fā)油）中所有的點外，還含有一個特有的淺紫色點；蒸餾水對照也有該點，且比標準品少一個粉紅點；根部心材比標準品少一個紅點； 降香黃檀邊材沒有相應的點。 各點的RF 值見表2。

表2 薄層色譜圖各點RF 值

圖4 薄層色譜圖

4 討論與結論

乙烯作為一種植物脅迫的信號傳導分子， 已有眾多誘導心材形成的研究報道。 乙烯利促進降香黃檀心材形成的研究發(fā)現(xiàn)， 各種植物激素誘導6～7 齡左右降香黃檀樹，乙烯利誘導心材比例最大[15-16]；且乙烯利處理誘導合成心材物質種類最全、 含量最高且最接近自然心材[17]，其中4%[15]、2%[16，18]、0.5%[19]的乙烯利均能有效誘導降香黃檀心材的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，2～3 齡降香黃檀幼樹即可被乙烯利誘導形成心材類物質， 且乙烯利的影響范圍和強度都明顯大于赤霉素、水楊酸。 在對激素處理的樣品進行分析時發(fā)現(xiàn)， 其心材類物質積累的顯微結構與天然心材一致， 僅薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)處理組樣品含有一個特殊點。 差異可能來源于：①人工樣品選取的是尚未形成心材的降香黃檀幼樹， 而天然心材樣品來源于數(shù)十年以上的大樹， 不同樹齡的樹木代謝物存在一定差異； ②天然心材樣品來源于木材加工的邊角料，從心材經過了漫長的時間及加工儲藏過程，會造成部分次生代謝產物發(fā)生變化， 而處理組樣品來源于3 齡幼樹激素處理（1 年后又經低溫干燥）。后續(xù)也對樣品進行GC-MS 氣質聯(lián)用分析，各種激素誘導后的產物均比天然心材復雜，成分聚類發(fā)現(xiàn)乙烯利處理后產生的心材類物質與天然降香主要成分相似度最高在96%以上（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。 研究表明，當降香黃檀樹體受到生物或非生物脅迫時，均會啟動心材的形成，且心材的形成與乙烯信號相關。 乙烯利誘導降香黃檀心材效果最佳，具有很好的開發(fā)前景，但誘導心材是否可以替代天然心材得以產業(yè)化應用， 還需從成分、藥效及產量質量上進行綜合評估。