4 個貴州野生花臉香蘑菌株的菌絲體生物學(xué)特性研究

張秀偉 鮑 菊 蔡甫格 牛力立 李 慧

（安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 安順 561000)

花臉香蘑（Lepistasordida）的子實體營養(yǎng)豐富[1]，風(fēng)味獨特，是一種具有較高開發(fā)價值的食用菌。野生花臉香蘑在貴州多地都有零星分布，當(dāng)?shù)厝朔Q為“米湯菌”或“毛草菌”。由于野外條件差，產(chǎn)量低、質(zhì)量參差不齊，很難滿足大眾的需求，因此人工栽培花臉香蘑具有很好的市場前景。自上世紀(jì)90 年代開始，即有關(guān)于花臉香蘑人工馴化栽培的相關(guān)報道和小規(guī)模實驗[1]，但因存在產(chǎn)量不高、品質(zhì)欠佳、穩(wěn)定性差等問題[2]，至今未見有大規(guī)模的種植。

近幾十年來，國內(nèi)外專家學(xué)者對花臉香蘑的研究也較多。肖玉珍等[2]對花臉香蘑進(jìn)行生理特性和生長條件的研究發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)時其利用培養(yǎng)料中的營養(yǎng)源的順序依次是：蔗糖、淀粉、作物秸稈中的纖維素、半纖維素。德國學(xué)者M(jìn)azur 等[3]利用花臉香蘑菌株發(fā)酵分離出兩種具有抗癌作用的二萜骨架化合物。羅心毅等[4]對人工栽培花臉香蘑子實體中的氨基酸進(jìn)行研究，結(jié)果在子實體干樣中，蛋白質(zhì)含量占比為30.03%，18 種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.37%。申慧彥等[5]對花臉香蘑的生物學(xué)特性、菌絲營養(yǎng)特性作了系統(tǒng)報道。郭勇等[1]、黃水珍[6]通過開展花臉香蘑不同栽培試驗，為野生花臉香蘑馴化研究提供了理論依據(jù)。

為充分利用貴州野生花臉香蘑資源，促進(jìn)珍稀食用菌的開發(fā)利用，本研究對來自貴州不同地區(qū)的花臉香蘑開展生物學(xué)特性研究，以期為其人工馴化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2022 年1 月在貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心實驗室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗材料

來自貴州省不同地區(qū)的4 個供試菌株分別采集于普定縣玉米地、鎮(zhèn)寧自治縣蜂糖李果園、安順市路邊草坪以及廣順鎮(zhèn)草地中，對應(yīng)編號為NK、LM、JFJ、GS。經(jīng)組織分離純化，4 個菌株均被鑒定為花臉香蘑，保存于安順市農(nóng)科院分子生物實驗室內(nèi)。

1.3 試驗方法

1.3.1 拮抗試驗

以NK、LM、JFJ、GS 為試驗材料，用直徑5 mm 的打孔器取不同菌株的菌餅，接種于直徑9 cm的PDA平板上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，菌餅間相距1.5 cm。25 ℃下培養(yǎng)7 天，觀測拮抗試驗結(jié)果。

1.3.2 環(huán)境因素對花臉香蘑菌絲體生長的影響

（1）溫度。取直徑5 mm 的菌餅，接入PDA平板培養(yǎng)基中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 天后，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3 次。

（2）pH。將PDA 培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)成5、6、7、8、9、10 和11。將直徑5 mm 的菌餅接入不同pH 的PDA 培養(yǎng)基中，25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 天，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3 次。

（3）碳、氮源。以真菌生理培養(yǎng)基[7]（碳源5 g、氮源1 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂20 g、水1 000 mL）為基礎(chǔ)，①以KNO3為氮源，分別以麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉為碳源，制作7 個不同碳源培養(yǎng)基；②以蔗糖為碳源，分別以牛肉膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨、酵母膏、硝酸鈉、蛋白胨為氮源，制作7 個不同氮源培養(yǎng)基。將直徑5 mm 的菌塊分別接入以上不同處理培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)3 次，25 ℃下培養(yǎng)10 天，采用十字交叉法測量菌落直徑。

（4）光照。將接種好的培養(yǎng)皿分別置于全光照（24 h 光照）、全黑暗（24 h 黑暗）、半光照（12 h 光照、12 h 黑暗）三種條件下，于25 ℃下培養(yǎng)10 天，采用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel、DPS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株間的拮抗性

對4 個野生花臉香蘑菌株共設(shè)計6 個拮抗組合，培養(yǎng)結(jié)果（圖1）表明：拮抗現(xiàn)象不明顯的有1 組，為采自普定縣玉米地的NK 和鎮(zhèn)寧自治縣蜂糖李果園的LM；其他5 組間的拮抗現(xiàn)象較明顯。表明NK 與LM 親緣關(guān)系較近，其他菌株間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 不同菌株間的拮抗試驗表現(xiàn)

2.2 培養(yǎng)環(huán)境因素對花臉香蘑菌絲生長的影響

2.2.1 溫度

4 個花臉香蘑菌株在不同溫度下分別培養(yǎng)10天的結(jié)果（圖2）表明，4 個菌株的菌絲生長隨溫度升高呈先快后慢的變化趨勢。NK、LM、JFJ 三個菌株在25 ℃和30 ℃下的菌落直徑最大，且在這兩個溫度處理間的菌落直徑差異均不顯著，但都顯著大于其他溫度處理；當(dāng)溫度達(dá)35 ℃時，3 個菌株菌落均停止生長。GS 菌株在25 ℃時菌絲生長最快，菌落直徑達(dá)7.07 cm，與其他4 個溫度處理相比，差異達(dá)顯著水平，且其在35 ℃下菌絲還能萌發(fā)生長，表明該菌株較其他3 個菌株的耐高溫性強。在相同培養(yǎng)溫度下，不同菌株的菌絲生長存在較大差異。在各菌株的最適溫度下，NK、LM、GS、JFJ的菌落直徑分別為6.0 cm、5.93 cm、7.07 cm、4.47 cm。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下4 個花臉香蘑菌株的菌落直徑

2.2.2 pH

4 個花臉香蘑菌株在不同pH 培養(yǎng)基25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 天的結(jié)果（圖3）顯示：4 個菌株菌絲在pH 5～10 范圍內(nèi)均能生長，隨著培養(yǎng)基pH 增大，菌落直徑整體呈先增大后減小趨勢。4 個菌株均在pH 為6 時菌落直徑最大，其中NK 的菌落直徑為5.30 cm。GS 菌株的菌落直徑在pH 6 和pH 7 的培養(yǎng)基上無顯著性差異，但均顯著大于其他處理；在pH 8 和pH 9 的培養(yǎng)基上居次，兩處理間差異不顯著。LM 菌株的菌落直徑以pH 6、pH 7 和pH 8 處理的較大，且差異不顯著。培養(yǎng)基pH 對菌落顏色及菌絲濃密度也會產(chǎn)生一定影響，pH 偏堿性時菌落多呈淡紫色，菌絲較濃密至濃密；pH 偏酸性時菌落白色，表現(xiàn)菌絲稀疏。

圖3 不同pH 培養(yǎng)基中4 個花臉香蘑菌株的菌落直徑

2.2.3 氮源

4 個花臉香蘑菌株在不同氮源培養(yǎng)基25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 天的結(jié)果（圖4）顯示：GS、JFJ 菌株菌絲在供試的7 種氮源培養(yǎng)基上均能生長，而NK、LM 菌株在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上菌絲無法生長。4 個菌株在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基菌落直徑最大，分別達(dá)到4.65 cm、4.78 cm、5.07 cm、4.53 cm，相較其他處理，差異達(dá)顯著水平，且均表現(xiàn)菌絲濃密。GS 在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基、JFJ 在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上長勢最差，表現(xiàn)菌絲稀疏，菌落直徑分別僅0.77 cm 和1.1 cm，顯著弱于其他處理；NK、LM 菌株的菌絲在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上長勢較差。4 個菌株在不同氮源培養(yǎng)基上，菌落均呈圓形、白色。

圖4 不同氮源下4 個花臉香蘑菌株的菌落直徑

2.2.4 碳源

4 個花臉香蘑菌株在不同碳源培養(yǎng)基25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 天的結(jié)果（圖5）顯示：4 個菌株在供試的7 種碳源培養(yǎng)基上均能生長，同一菌株在不同碳源培養(yǎng)基，以及不同菌株在同一碳源培養(yǎng)基上的菌絲生長情況存在一定差異。其中，NK、GS 在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大，分別達(dá)到6.45 cm、7.37 cm，菌落呈圓形、白色、濃密，顯著優(yōu)于其他處理；在以麥芽糖、甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上長勢居次；在乳糖培養(yǎng)基上長勢最差，與其他處理差異達(dá)顯著性水平。LM 菌株在以可溶性淀粉和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑大，兩個處理間差異不顯著；其次是在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長較好；而以乳糖為碳源時生長較差，較其他處理差異達(dá)顯著水平。JFJ 菌株在以可溶性淀粉和甘露醇為碳源時，菌落直徑大，但以甘露醇為碳源時菌絲長勢弱且稀疏；其次是果糖和葡萄糖培養(yǎng)基，兩個處理間無顯著性差異。

圖5 不同碳源下4 個花臉香蘑菌株的菌落直徑

2.2.5 光照

不同光照條件下，4 個花臉香蘑菌株25 ℃下恒溫培養(yǎng)10 天的結(jié)果（表1）顯示：光照對菌絲生長產(chǎn)生一定影響，4 個菌株在不同光照處理下均能生長，LM、GS 在不同處理間的菌落直徑差異顯著，LM 以半光照條件下菌落直徑最大；NK、JFJ、GS 在全黑暗培養(yǎng)條件下菌落直徑顯著大于其他2個處理。在不同光照處理下，4 個菌株的菌落均呈圓形、淡紫色，菌落濃密度差異不大。

表1 光照對4 個野生花臉香蘑菌株菌絲生長的影響

3 討論與結(jié)論

根據(jù)拮抗試驗結(jié)果，除采自普定縣玉米地的NK 和鎮(zhèn)寧自治縣蜂糖李果園的LM 兩個菌株之間的拮抗現(xiàn)象不明顯外，其他5 組間均有較明顯的拮抗線，表明除NK 與LM 外，其他菌株間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，不同區(qū)域間的花臉香蘑野生菌資源可能存在一定差異，有待開展ITS 序列或SSR 標(biāo)記分析，以進(jìn)一步對資源進(jìn)行分類。

本試驗以GS、NK、LM、JFJ 等4 個野生花臉香蘑菌株為試驗材料，進(jìn)行菌絲體生物學(xué)特性的初步研究結(jié)果：4 個菌株的菌絲生長溫度與pH 范圍較寬，25 ℃時菌絲生長快、菌落濃密，除GS 菌株外，其他3 個菌株在35 ℃下停止生長，表明GS較其他菌株的耐高溫性強；在pH 6 的培養(yǎng)基上菌絲長勢最好，這與周會明等[8]、曲偉東[9]的研究結(jié)果不盡相同，可能原因是存在菌株間的差異。

本研究4 個菌株的最佳氮源均為酵母粉，與鄭煥春等[10]、周會明等[8]的研究結(jié)果存在差異。菌株在有機氮源上的生長均優(yōu)于無機氮源，可能是因為有機氮源培養(yǎng)基除含氮以外，還能提供碳源及其他生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，且有機氮中的氮源主要是蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，可以被菌絲直接吸收利用。

4 個菌株在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長，最佳碳源為可溶性淀粉，其次為麥芽糖、葡萄糖，該結(jié)果與前人的研究也存在一定差異。

本研究顯示光照對菌絲生長具有一定影響，與周會明等[8]的結(jié)論一致，而與張洪海等[11]的研究結(jié)果不同，這可能是由于菌株之間存在一定的差異。

綜上，對4 個貴州野生花臉香蘑菌株菌絲體生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，花臉香蘑菌絲體最適生長溫度為25 ℃，pH 為6，最適碳、氮源為可溶性淀粉和酵母粉；拮抗試驗表明不同區(qū)域的花臉香蘑資源具有一定差異性，為獲得優(yōu)良菌株，可利用不同資源進(jìn)行雜交選育，為花臉香蘑規(guī)模化種植奠定基礎(chǔ)。