大型真菌有性孢子的細(xì)胞核數(shù)量與羊肚菌的生活史簡(jiǎn)述

賀新生 張銳杰 賀亞寧 趙櫟棋 羅友梅

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

大型真菌是指真菌界擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)中能夠形成大型子實(shí)體的種類，全球有3 萬(wàn)種以上，中國(guó)有11 000 多種[1]。擔(dān)子菌門(mén)的物種形成的有性孢子是擔(dān)孢子，子囊菌門(mén)的物種形成的有性孢子是子囊孢子。如表1 所示，大型真菌中絕大多數(shù)種類的有性孢子都是單核體（單倍體），少數(shù)種類是雙核異核體或雙核同核體，極少數(shù)種類可能是多核異核體、多核同核體，出現(xiàn)二倍體的情況極為罕見(jiàn)[2-7]。本文系統(tǒng)分析大型真菌的有性孢子中不同數(shù)量和類型的細(xì)胞核的形成過(guò)程，討論不同類型的孢子進(jìn)行雜交育種的可能性，結(jié)合羊肚菌多核異核體子囊孢子的情況，全面介紹羊肚菌的生活史和育種、用種策略。

表1 大型真菌有性孢子單孢中細(xì)胞核的數(shù)量與類型

1 單核孢子

通常所說(shuō)的單核體都是單倍體，擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)中大多數(shù)物種的有性孢子都是這種單核體[2-8]。擔(dān)子菌菌絲的隔膜是桶狀隔膜，隔膜中央孔兩側(cè)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍，不允許細(xì)胞核在細(xì)胞間進(jìn)行流動(dòng)、交換，每一個(gè)細(xì)胞都是雙核異核菌絲；子囊菌菌絲的隔膜上有中央孔，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核都可以在細(xì)胞之間流動(dòng)，每一個(gè)細(xì)胞都可能是多核異核。子實(shí)體的子實(shí)層中形成擔(dān)子母細(xì)胞、子囊母細(xì)胞時(shí)，這個(gè)母細(xì)胞都是雙核異核體，其中一個(gè)核為（+）、一個(gè)核為（-），分別攜帶了該物種各1/2 的基因組[2-8]。

1.1 擔(dān)子菌中二極性的種類

在擔(dān)子菌門(mén)中，如大肥菇Agaricusbitorquis、巴氏蘑菇A.blazei、雙孢蘑菇布氏變種A.bisporusvar.burnettii[=A.bisporus]、雙孢蘑菇A.bisporus、木耳屬Auricularia、鱗傘屬Pholiota、草菇Volvariellavolvacea中的4 孢擔(dān)子等異宗結(jié)合類物種的每個(gè)擔(dān)子細(xì)胞上產(chǎn)生4 個(gè)擔(dān)孢子[2-14]。在擔(dān)子母細(xì)胞中2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核融合，形成一個(gè)暫時(shí)的二倍體細(xì)胞核（+/-, 2n），發(fā)生減數(shù)分裂I，形成2 個(gè)核，再發(fā)生減數(shù)分裂II，形成4 個(gè)細(xì)胞核，分別是2 個(gè)（+）核、2 個(gè)（-）核，每一個(gè)核分別進(jìn)入到一個(gè)擔(dān)孢子細(xì)胞中，形成4 個(gè)單核擔(dān)孢子。這4 個(gè)擔(dān)孢子的核分別為2 個(gè)（+）、2 個(gè)（-），單孢不出菇。任意一個(gè)（+）核萌發(fā)的單核菌絲都可以與任意一個(gè)（-）核萌發(fā)的單核菌絲融合，形成具有鎖狀聯(lián)合的雙核異核菌絲，可進(jìn)一步形成擔(dān)子果，再在擔(dān)子果上形成擔(dān)孢子，完成生活史。

這種類型的擔(dān)孢子自交結(jié)實(shí)率為50%。雜交育種方法有兩種：一是單單雜交，即選擇來(lái)源不同的擔(dān)子果獲得單孢菌株，進(jìn)行1+1 的配對(duì)組合，得到有鎖狀聯(lián)合的菌絲，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，優(yōu)選目標(biāo)菌株，擴(kuò)大試驗(yàn)和進(jìn)行多地區(qū)品比試驗(yàn)后，選擇優(yōu)良菌株進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)；二是多孢雜交，即將兩個(gè)品種的孢子按照相同濃度進(jìn)行混合后，按照一定濃度涂布于平板，后續(xù)挑取菌落進(jìn)行出菇篩選、擴(kuò)大試驗(yàn)和規(guī)?；a(chǎn)。

1.2 擔(dān)子菌中四極性的種類

在擔(dān)子菌中，如雞腿菇Coprinuscomatus、靈芝屬Ganoderma、金針菇屬Flammulina、膜褶傘屬Hymenopellis、翹鱗斗菇Lentinussquarrosulus、香菇Lentinulaedodes、巨蓋傘Macrocybegigantean、豬苓Polyporusumbellatus、側(cè)耳屬Pleurotus、裂褶菌Schizophyllumcommune、繡球菌Sparassiscrispa、大球蓋菇Strophariarugosoannulata、栓孔菌屬Tametes等，其子實(shí)體的擔(dān)子細(xì)胞形成A1B1、A2B2、A1B2、A2B1共4 種單核擔(dān)孢子，單孢不出菇[2-14]，只有A1B1×A2B2 和A1B2×A2B1 這2 種組合，才能形成具有鎖狀聯(lián)合的雙核異核菌絲，產(chǎn)生擔(dān)子果和擔(dān)孢子，完成生活史。

這種類型的擔(dān)孢子自交結(jié)實(shí)率為25%。自交育種方法有兩種，一種是單單自交，同1.1；另一種是多孢自交，可將孢子按照一定濃度涂布于平板，后續(xù)挑取菌落進(jìn)行出菇篩選、擴(kuò)大試驗(yàn)和規(guī)?；a(chǎn)。

1.3 雙倍單核體

在擔(dān)子菌中有個(gè)別的種類，擔(dān)孢子是單核體，但不是單倍體，而是雙倍體（+/-,2n），如雙孢蘑菇的一個(gè)變種：Agaricusbisporusvar.eurotetrasporus[2-4,6]。在擔(dān)子母細(xì)胞中2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核融合，形成一個(gè)暫時(shí)的二倍體細(xì)胞核（+/-,2n），可能沒(méi)有繼續(xù)發(fā)生減數(shù)分裂，而是直接進(jìn)行有絲分裂，形成2 個(gè)新的二倍體細(xì)胞核，分別進(jìn)入到2 個(gè)擔(dān)孢子細(xì)胞中，成為單核二倍體的孢子。

這種孢子萌發(fā)出菌絲后，形成雙核異核菌絲，可以直接出菇，單孢之間不能夠進(jìn)行雜交。

1.4 子囊菌中的8 孢種類

在絕大多數(shù)子囊菌中，如蟲(chóng)草菌屬Cordyceps、炭輪菌屬Daldinia、脈孢霉屬Neurospora、線蟲(chóng)草菌屬Ophiocordyceps、盤(pán)菌屬Peziza、假子盤(pán)菌屬Pseudascozonus、炭角菌屬Xylaria等的全部或部分種類，每個(gè)子囊中只有8 個(gè)單核子囊孢子[15-23]。子囊母細(xì)胞中2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核融合，形成一個(gè)暫時(shí)的二倍體細(xì)胞核（+/-,2n），然后減數(shù)分裂形成4 個(gè)細(xì)胞核，再進(jìn)行一次有絲分裂，形成8 個(gè)細(xì)胞核，分別是4 個(gè)（+）核、4 個(gè)（-）核，每一個(gè)核分別進(jìn)入到一個(gè)子囊孢子細(xì)胞中，形成8 個(gè)單倍單核體的子囊孢子。即這8 個(gè)單核子囊孢子的核4 個(gè)為（+）、4 個(gè)為（-），單孢不出菇。

雜交育種方法是：選擇來(lái)源不同的子囊果獲得單孢菌株，進(jìn)行1+1 的配對(duì)組合，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，優(yōu)選出目標(biāo)菌株，擴(kuò)大試驗(yàn)后，選擇優(yōu)良菌株進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。

1.5 子囊菌中的多孢種類

另有一些子囊菌可以形成16、32、64、128、256 個(gè)甚至更多的單核子囊孢子，如子盤(pán)菌屬Ascozonus、毛殼菌屬Coniochaeta、柄孢殼屬Podospora、污盤(pán)殼屬Rhypophila、寡囊盤(pán)菌屬Thelebolus等[15-23]。子囊母細(xì)胞中2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核進(jìn)行融合，減數(shù)分裂后形成4 個(gè)細(xì)胞核，再發(fā)生1 次及以上的有絲分裂，產(chǎn)生8、16、32、64、128、256 或更多的細(xì)胞核，分別隨機(jī)進(jìn)入到對(duì)應(yīng)數(shù)量的子囊孢子中，形成單核體孢子。這些孢子萌發(fā)后形成同核體菌絲，單孢不出菇，可雜交育種，也有可能形成多核異核體的機(jī)會(huì)。

2 雙核孢子

在擔(dān)子菌、子囊菌中，所謂的雙核體，其2 個(gè)細(xì)胞核都是單倍體，有雙核同核體、雙核異核體兩種類型。目前尚未發(fā)現(xiàn)是二倍體的雙核體。

雙孢蘑菇Agaricusbisporus、草菇Volvariellavolvacea等種類的多數(shù)擔(dān)子只產(chǎn)生2 個(gè)擔(dān)孢子[4,6,8,10-14]。當(dāng)2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核在擔(dān)子母細(xì)胞中融合，然后發(fā)生減數(shù)分裂，形成2（+）、2（-）4 個(gè)細(xì)胞核，因?yàn)殡S機(jī)性的存在，其有兩種組合可能：一是2 個(gè)同性別的核進(jìn)入到一個(gè)擔(dān)孢子細(xì)胞中，形成雙核同核的擔(dān)孢子[4,6,8,10-14]，即核為（+,+）、（-,-），單孢不出菇，2 個(gè)不同性別的孢子萌發(fā)的菌絲可以親和，形成雙核異核菌絲，產(chǎn)生子實(shí)體和擔(dān)孢子，完成生活史，這種類型的擔(dān)孢子自交結(jié)實(shí)率為50%，雜交育種方法同1.1 節(jié)；二是2 個(gè)不同性別的核分別進(jìn)入到一個(gè)擔(dān)孢子細(xì)胞中，形成2 個(gè)雙核異核的擔(dān)孢子[4,6,8,10-14]，核都為（+,-），雙核異核的單孢可出菇，單孢結(jié)實(shí)率為100%，無(wú)法進(jìn)行雜交育種，育種路徑是從大量單孢菌株中選擇優(yōu)良菌株，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，選擇高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌株。

理論上講，母細(xì)胞中的二倍體不發(fā)生減數(shù)分裂，繼續(xù)有絲分裂，有2 個(gè)二倍體核分裝到孢子中，形成二倍體雙核體，單孢可以出菇。但這種情況尚未觀察到。

3 多核孢子

如表2 所示，在擔(dān)子菌、子囊菌中細(xì)胞核數(shù)量超過(guò)2 個(gè)的多核體，每個(gè)細(xì)胞核都是單倍體，尚未發(fā)現(xiàn)是二倍體的多核體[40-43]。

表2 多核異核孢子形成的可能機(jī)制

3.1 多核同核體

在擔(dān)子母細(xì)胞、子囊母細(xì)胞中的2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核融合，減數(shù)分裂后形成4 個(gè)細(xì)胞核，分別進(jìn)入到4 個(gè)或8 個(gè)孢子中，在孢子中細(xì)胞核再發(fā)生1 次及以上的有絲分裂，形成多核同核體孢子[24,42-43]，萌發(fā)后形成多核同核體菌絲，單孢菌株不出菇，可以進(jìn)行雜交育種。這種情況還有待發(fā)現(xiàn)。

3.2 多核異核體

擔(dān)子母細(xì)胞中的2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核進(jìn)行融合，減數(shù)分裂后形成4 個(gè)細(xì)胞核，再發(fā)生1 次及以上的有絲分裂，產(chǎn)生8、16 或更多的細(xì)胞核，分別隨機(jī)進(jìn)入到4 個(gè)擔(dān)孢子中，形成多核異核體孢子[24,42-43]，萌發(fā)后形成多核異核體菌絲，單孢可以出菇，不能進(jìn)行雜交育種。這種情況還有待發(fā)現(xiàn)。

在子囊菌中，子囊母細(xì)胞中的2 個(gè)不同性別的細(xì)胞核融合、減數(shù)分裂后形成4 個(gè)細(xì)胞核，1 次有絲分裂后形成8 個(gè)細(xì)胞核，再發(fā)生1 次及其以上的有絲分裂，形成16、32、64 或更多數(shù)量的細(xì)胞核，再隨機(jī)進(jìn)入到8 個(gè)孢子中，形成多核異核體孢子，萌發(fā)后形成多核異核體菌絲。單孢可以出菇，無(wú)法進(jìn)行雜交育種[24-26]。這種情況可能發(fā)生在羊肚菌屬中，羊肚菌的子囊孢子為典型的多核異核體[27-31,40]。

4 羊肚菌多核異核子囊孢子

已經(jīng)知道羊肚菌的菌絲是多核異核體[33-34]。羊肚菌子囊細(xì)胞在未形成孢子之前是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)8 個(gè)核的多核異核體[24-26,28-29,32-33]，其多核異核體子囊孢子形成的機(jī)制很有可能是子囊母細(xì)胞發(fā)生了多次減數(shù)分裂，形成遠(yuǎn)超過(guò)8 的倍數(shù)的細(xì)胞核，再隨機(jī)裝入8 個(gè)子囊孢子中而形成[24-26,28-29,32-33]。形成多核同核體或單核體的幾率很低，但是有一定的可能性。

證明羊肚菌孢子是多核異核體的方法有：

（1）單孢菌株出菇試驗(yàn)。已經(jīng)有超過(guò)數(shù)十萬(wàn)畝的生產(chǎn)成功案例證實(shí)，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、Mes-21、秋天羊肚菌、粗柄羊肚菌等物種完全可以單孢出菇[24-26,28-29,32-33,37-41]。當(dāng)然人為或自然原因也會(huì)得到完全不出菇的結(jié)果，不能夠斷然得出不出菇的結(jié)論。

（2）同種多孢混播出菇試驗(yàn)。同種內(nèi)2 個(gè)及以上的菌株混合播種，可以出菇，但是會(huì)減產(chǎn)[27-28,34,38-41]。需要說(shuō)明的是，很多生產(chǎn)者所謂的多孢菌株其實(shí)都是單孢菌株，因?yàn)椴僮髡咴诓僮鲿r(shí)實(shí)際上只取到菌落邊緣的單叢菌絲，屬于單孢菌絲。

（3）異種多孢出菇試驗(yàn)。2 個(gè)不同的物種的單孢菌株混合播種，如六妹羊肚菌與梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌與梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌與七妹羊肚菌等不同種間的任意組合，都可以在不同的時(shí)間長(zhǎng)出2 種不同的子囊果。在現(xiàn)實(shí)的羊肚菌生產(chǎn)過(guò)程中，很多菌種生產(chǎn)者害怕單個(gè)菌株不出菇，常常把不同的菌株賣(mài)給羊肚菌生產(chǎn)者進(jìn)行大田生產(chǎn)，在田間同時(shí)或不同時(shí)間段出現(xiàn)了不同形態(tài)的子實(shí)體，表明只要是孢子分離的菌種都可以形成子實(shí)體。

5 羊肚菌的生活史

根據(jù)以上分析，羊肚菌的生活史為：?jiǎn)蝹€(gè)子囊孢子→菌絲體→（分生孢子、菌核）→子囊果→子囊孢子[27-29,34,40]。實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化栽培的幾個(gè)羊肚菌物種的子囊孢子是多核異核體，具有該物種全部的基因組，萌發(fā)后形成多核異核的菌絲[24,41-43]，可以進(jìn)行無(wú)限的無(wú)性繁殖，在瓊脂培養(yǎng)基、麥粒培養(yǎng)基、土壤/砂礫等基質(zhì)上可以形成分生孢子和菌核，按照特定的方法培養(yǎng)后，可以形成子囊果，在子囊果上形成子囊和子囊孢子[33,37-41]。

圖1 羊肚菌的生活史

羊肚菌的菌核能夠萌發(fā)形成新的菌絲，可以進(jìn)行無(wú)數(shù)次循環(huán)。但羊肚菌的分生孢子重新長(zhǎng)出菌絲的試驗(yàn)，目前還沒(méi)有完全實(shí)現(xiàn)。羊肚菌的育種路線是：在大量單孢菌株中，選擇優(yōu)良菌株進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。規(guī)模化生產(chǎn)的用種路線是：每個(gè)生產(chǎn)者選擇10 個(gè)以上的優(yōu)良單孢菌株，每個(gè)菌株播種總面積的1/10，降低僅僅使用1 個(gè)菌株的低產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

羊肚菌的單孢菌株間親和數(shù)量非常少，不同孢子萌發(fā)的菌絲之間發(fā)生真正的細(xì)胞融合較為罕見(jiàn)，不能夠進(jìn)行雜交育種[29,32-33,40]。當(dāng)然，如果能夠找到完全不出菇的多核同核體，就可以實(shí)現(xiàn)雜交育種。