miR-146a-5p對無水乙醇刺激的胃黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

魏 晴,梁珊珊*

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制學(xué)教研室,貴陽 550025;2貴州中醫(yī)藥大學(xué)大果木姜子研究中心;3貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物多糖研究中心;*通訊作者,E-mail:3113836821@qq.com)

胃潰瘍(gastric ulcer,GU)是消化系統(tǒng)常見且多發(fā)的疾病。臨床上以節(jié)律性和周期性上腹痛為特征,長期疼痛容易發(fā)展為慢性病[1,2]。研究表明,胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、胃動(dòng)力異常、遺傳、環(huán)境、飲食、飲酒和壓力等是攻擊胃黏膜的主要因素[3,4]。現(xiàn)代人在飲食、飲酒、吸煙等方面的不良習(xí)慣會(huì)對胃黏膜及其屏障造成物理性或化學(xué)性損害,進(jìn)而破壞黏膜屏障,引發(fā)胃潰瘍。MicroRNAs(miRNAs/miRs)在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究表明miR-146a可通過APLL1負(fù)向調(diào)控應(yīng)激性潰瘍的炎癥反應(yīng),對胃潰瘍有保護(hù)作用[5]。miR-146a過表達(dá)能夠抑制腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6(TRAF6)和IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)等靶基因來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。TRAF6和IRAK1在NF-κB通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器發(fā)揮作用,可以進(jìn)一步激活I(lǐng)κB激酶以響應(yīng)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[6,7]。

因此本研究以正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)為基礎(chǔ),通過無水乙醇誘導(dǎo)建立GU模型,研究miR-146a-5p是否參與到無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍中,進(jìn)一步尋找miR-146a-5p靶基因,探究miR-146a-5p和靶基因?qū)o水乙醇刺激的胃黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,以期為胃潰瘍的預(yù)防和治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,MTT試劑購自Biosharp生物技術(shù)有限公司,青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液購自北京Solarbio科技有限公司,RMPI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,蛋白裂解液購自北京Solarbio科技有限公司,IRAK1、NF-κB p65、IL-6和GAPDH一抗及相應(yīng)二抗購自武漢三鷹生物有限公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自美國伯樂公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000購自美國Sigma公司,TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。高通量RT-qPCR儀(瑞士Roche公司),Western blot系統(tǒng)(美國伯樂公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器公司),凝膠成像分析儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及胃潰瘍模型的建立 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1常規(guī)復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分為空白組和模型組?？瞻捉M給予培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。胃潰瘍模型組是將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h后,每毫升培養(yǎng)液中加入70 μl無水乙醇,培養(yǎng)8 h后,無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍模型建立[8]。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 為比較正常細(xì)胞和胃潰瘍細(xì)胞活性,采用MTT法檢測空白和模型組細(xì)胞活性。取GES-1細(xì)胞,以每孔3×104的細(xì)胞接種于96孔板中,并分為空白組和模型組(GU組)。在模型組細(xì)胞建立后,將兩組細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48 h后,每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸盡培養(yǎng)液,每孔中加入150 μl DMSO,10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm測光密度(OD)值,測定細(xì)胞活性。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表達(dá) 為比較正常細(xì)胞和胃潰瘍細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá),采用RT-qPCR檢測空白組和模型組中miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表達(dá)。miRNA試劑盒提取空白組和模型組細(xì)胞的總RNA,用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,通過熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min。

表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達(dá)水平 將兩組細(xì)胞接種于6孔板中,24 h后換液,采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白,然后采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后各取10 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE,再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入兔抗GAPDH(1∶20 000,10494-1-AP)、兔抗IRAK1(1∶1 500,10478-2-AP)、兔抗NF-κB p65(1∶1 000,10745-1-AP)、兔抗IL-6(1∶1 000,21865-1-AP)一抗,4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000,SA00001-2)室溫孵育60 min,用ECL液顯影,使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測,結(jié)果采用Image-Pro Plus 6軟件進(jìn)行分析,計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 ELISA法檢測GES-1細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平 按照說明書,通過ELISA法檢測空白和模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞消化后,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 3000試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別標(biāo)記為空白組(control)、GU組、mimic NC組、miR-146a-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic)、inhibitor NC組、miR-146a-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor)、siRNA NC組、siRNA IRAK1組(轉(zhuǎn)染siRNA IRAK1),轉(zhuǎn)染成功后,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.7 miR-146a-5p的靶基因預(yù)測 為進(jìn)一步預(yù)測miR-146a-5p的靶點(diǎn),采用預(yù)測軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)預(yù)測,物種選Human,依據(jù)context score評分,評分越低其靶基因可能性越大。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-146a-5p與IRAK1的靶向關(guān)系 依據(jù)Targetscan結(jié)果,IRAK1可能是miR-146a-5p的靶基因,為進(jìn)一步確認(rèn)二者關(guān)系,采用熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)先構(gòu)建了Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT(野生型)和Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT(突變型)報(bào)告質(zhì)粒。再通過Lipofectamine 3000使用miR-146a-5p mimic和miR-NC以及0.1 μg psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT或psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至GES-1細(xì)胞。分別建立miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-WT組、miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-MUT組、miR-NC+IRAK1 3′ UTR-WT組和miR-NC+IRAK1 3′ UTR-MUT組。采用多功能酶標(biāo)儀檢測兩組細(xì)胞中螢火蟲與海腎熒光比值,作為熒光素酶活性。進(jìn)一步通過Western blot法比較miR-146a-5p mimic、miR-NC、miR-146a-5p inhibitor和inhibitor NC組中IRAK1蛋白的表達(dá)量,以確認(rèn)miR-146a-5p和IRAK1調(diào)控關(guān)系。

1.2.9 過表達(dá)miR-146a-5p或敲減IRAK1后對胃潰瘍細(xì)胞的影響 為進(jìn)一步確認(rèn)miR-146a-5p是否能夠通過IRAK1調(diào)控胃潰瘍的產(chǎn)生,采用過表達(dá)miR-146a-5p和敲減其相關(guān)靶點(diǎn)IRAK1蛋白,觀察胃潰瘍相關(guān)蛋白和炎癥因子變化。取對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞消化后,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 3000試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別標(biāo)記為空白組(control)、GU組、mimic NC組、miR-146a-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic)、siRNA NC組和siRNA IRAK1組(轉(zhuǎn)染siRNA IRAK1),轉(zhuǎn)染成功后,每毫升培養(yǎng)液中加入70 μl無水乙醇,培養(yǎng)8 h,建立無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍模型。進(jìn)一步通過Western blot檢測GES-1細(xì)胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達(dá)水平,ELISA法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 無水乙醇刺激后對GES-1細(xì)胞的影響

MTT結(jié)果表明,在24 h和48 h時(shí),與空白組相比,GU組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01,見圖1)?？瞻捉MGES-1細(xì)胞生長旺盛,呈長梭形均貼壁生長,有絲分裂細(xì)胞數(shù)較多;當(dāng)用無水乙醇造模后GES-1細(xì)胞貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞變圓懸浮,部分細(xì)胞核濃縮(見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01

空白組 模型組

RT-qPCR結(jié)果表明,與空白組相比,GU組miR-146a-5p表達(dá)顯著降低(P<0.01),IRAK1、NF-κBp65和IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01,見表2)。Western blot結(jié)果表明,與空白組相比,GU組IRAK1、NF-κB p65和IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01,見圖3)。ELISA結(jié)果表明,與空白組相比,GU組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著升高,IL-10表達(dá)顯著降低(均P<0.01,見表3)。以上結(jié)果表明無水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍能夠顯著升高miR-146a-5p和相關(guān)蛋白以及炎癥因子的表達(dá)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

表2 兩組細(xì)胞中miR-146a-5p及IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA水平比較

表3 兩組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)結(jié)果 (n=6,

2.2 miR-146a-5p與IRAK1靶向關(guān)系驗(yàn)證

靶基因在線軟件Targetscan預(yù)測顯示miR-146a-5p與IRAK1存在靶向關(guān)系,結(jié)合位點(diǎn)見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,與IRAK1-WT+mimic NC組相比,IRAK1-WT+miR-146a-5p mimic組GES-1細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而IRAK1-MUT+miR-146a-5p mimic組和IRAK1-MUT+mimic NC組GES-1細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05,見圖4B),說明miR-146a-5p與IRAK1存在靶向關(guān)系。與mimic NC組相比,miR-146a-5p mimic組IRAK1表達(dá)顯著降低(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-146a-5p inhibitor組IRAK1表達(dá)顯著升高(P<0.01,見圖5)。由以上結(jié)果進(jìn)一步可知miR-146-5p可負(fù)向調(diào)控IRAK1蛋白的表達(dá)。

與mimic NC比較,**P<0.01

與mimic NC比較,**P<0.01;與inhibitor NC比較,##P<0.01

2.3 過表達(dá)miR-146a-5p對無水乙醇刺激的GES-1細(xì)胞的影響

與mimic NC組相比,miR-146a-5p mimic組GES-1細(xì)胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01,見圖6)。進(jìn)一步ELISA結(jié)果表明,與GU組或GU+mimic NC組相比,GU+miR-146a-5p-mimic組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著降低,IL-10表達(dá)顯著升高(P<0.05,見表4)。以上結(jié)果表明miR-146a-5p參與到無水乙醇刺激的GES-1細(xì)胞的保護(hù)中,并能夠減少炎癥因子的釋放。

與mimic NC組比較,*P<0.05,**P<0.01

表4 過表達(dá)miR-146a-5p對細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)的影響

2.4 敲減IRAK1對無水乙醇刺激的GES-1細(xì)胞的影響

Western blot結(jié)果表明,與siRNA NC組相比,siRNA IRAK1組IRAK1、NF-κB p65和IL-6表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01,見圖7)。

與siRNA NC組比較,**P<0.01

ELISA結(jié)果表明,與GU組或GU+siRNA NC組相比,GU+siRNA IRAK1組TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著降低,IL-10的表達(dá)顯著升高(均P<0.05,見表5)。

表5 敲減IRAK1對細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)的影響

3 討論

消化性潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,包括胃潰瘍和十二指腸潰瘍,其中胃潰瘍是最常見的一種,其主要臨床表現(xiàn)為餐后上腹痛,伴有噯氣、反酸、燒心等癥狀,甚至出現(xiàn)胃穿孔和胃出血[9]。隨著潰瘍的反復(fù)發(fā)作,胃黏膜的損傷加重,最終導(dǎo)致癌變,胃癌的預(yù)后極差,甚至危及生命。研究表明,導(dǎo)致胃潰瘍形成的因素很多,包括酗酒、不良生活習(xí)慣、生活壓力過大、Hp感染、長期使用藥物等[10]。因此,積極預(yù)防和治療胃潰瘍具有重要意義。

miRNA由內(nèi)源基因編碼,在多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,被認(rèn)為廣泛參與基因表達(dá)和RNA沉默的調(diào)控[11,12]。綜合以前的文獻(xiàn)和現(xiàn)代研究進(jìn)展,本研究選擇了與胃潰瘍相關(guān)的miR-146a-5p進(jìn)行進(jìn)一步研究。尹斌[5]研究表明miR-146a可通過APLL1負(fù)向調(diào)控應(yīng)激性潰瘍的炎癥反應(yīng),對胃潰瘍有保護(hù)作用。過表達(dá)miR-146a后可降低NF-kB p65的蛋白和mRNA水平,同時(shí)還能夠降低炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)[5]。本研究結(jié)果表明在無水乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中miR-146a-5p的表達(dá)顯著降低,伴隨著各炎癥因子含量也發(fā)生改變,而過表達(dá)miR-146a-5p后,各炎癥因子含量逐步恢復(fù),提示miR-146a-5p在胃潰瘍發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

為進(jìn)一步研究無水乙醇刺激的GES-1細(xì)胞中miR-146a-5p的作用機(jī)制,通過雙熒光素酶結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-146a-5p可與IRAK1靶向結(jié)合,且miR-146-5p可負(fù)向調(diào)控IRAK1蛋白的表達(dá)。作為一個(gè)絲氨酸-蘇氨酸激酶,IRAK1可以介導(dǎo)Toll樣受體(TLR)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)信號(hào)通路,因此在先天免疫性疾病包括自身免疫性疾病、癌癥、糖尿病或神經(jīng)性疼痛中起著關(guān)鍵作用[13-16]。Li等[17]研究表明,在幽門螺旋桿菌所致胃潰瘍中,過表達(dá)miR-146a能夠抑制IRAK1和TRAF6表達(dá)水平,減輕胃黏膜損傷。Zhang等[18]研究表明,miR-146a缺陷的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎,通過TRAF6、IRAK1和NALP3引起炎癥體失調(diào)。本研究進(jìn)一步表明miR-146-5p可負(fù)向調(diào)控IRAK1蛋白的表達(dá),并參與到炎癥因子的釋放中,保護(hù)胃黏膜。

IRAK1存在于NF-κB、IL-17等通路中,而研究表明NF-κB通路能夠調(diào)節(jié)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[19]。進(jìn)一步對下游通路研究表明,當(dāng)IRAK1表達(dá)被抑制后,NF-κB p65和IL-6蛋白的表達(dá)降低,下游炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)降低,IL-10的表達(dá)升高,提示miR-146a-5p靶向調(diào)控IRAK1后可以進(jìn)一步抑制炎癥相關(guān)反應(yīng)。TNF-α、IL-6和IL-10是重要的炎癥細(xì)胞因子,它們參與了炎癥和胃潰瘍的發(fā)展。TNF-α是一種由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的內(nèi)源性多向性炎癥細(xì)胞因子[20,21]。TNF-α也是一種重要的炎癥介質(zhì),會(huì)導(dǎo)致潰瘍的形成。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí),TNF-α?xí)鹌渌装Y因子的二次釋放,如IL-2、IL-6、IL-10等,TNF-α還可激活中性粒細(xì)胞并釋放氧自由基,產(chǎn)生急性期蛋白,阻礙胃黏膜的血液微循環(huán),加重胃黏膜損傷[22]。本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,GU組細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量明顯增加,而IL-10的含量則顯著下降,說明胃潰瘍造模后大量的炎癥因子TNF-α和IL-6相繼釋放,IL-10的產(chǎn)生受到抑制,促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與GU組相比,GU+miR-146a-5p mimic或GU+siRNA IRAK1組,細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量顯著下降,IL-10的含量顯著上升,表明miR-146a-5p可以通過抑制IRAK1的表達(dá)抑制炎癥因子的釋放,減少對胃腸道的損害,從而發(fā)揮對胃黏膜的保護(hù)作用。

綜上所述,在無水乙醇刺激的GES-1細(xì)胞中,miR-146a-5p高表達(dá)能夠起到保護(hù)胃黏膜的作用,其作用機(jī)制可能是通過miR-146a-5p靶向抑制IRAK1,進(jìn)一步抑制炎癥因子的釋放,保護(hù)胃黏膜。本研究為miR-146a-5p靶向保護(hù)胃黏膜提供了新的思路和依據(jù)。