基于中醫(yī)藥整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機(jī)制

潘賜明，任 雪，韋姍姍，曹蓓苓，王 維，楊 艷，陳文慧，徐宏喜

基于中醫(yī)藥整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機(jī)制

潘賜明1, 2，任 雪2, 3，韋姍姍1*，曹蓓苓1，王 維1，楊 艷1，陳文慧1，徐宏喜2

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203 3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

基于中醫(yī)藥整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機(jī)制。采用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)v2.0，檢索并獲取丹梔逍遙散的活性成分及靶標(biāo)、焦慮肝郁化火證靶標(biāo)信息，構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。將交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以確定最終需要驗(yàn)證的靶標(biāo)。利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)驗(yàn)證整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，同時(shí)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。共篩選出與焦慮肝郁化火證相關(guān)的靶標(biāo)13個(gè)，丹梔逍遙散活性成分430種。整合藥理學(xué)結(jié)果顯示，丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證主要通過調(diào)控α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor，AMPAR）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、-甲基--天冬氨酸（-methyl--aspartic acid，NMDA）受體的激活及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號(hào)通路。GEO微陣列芯片GSE4035數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)鍵靶標(biāo)雌激素受體α（estrogen receptor 1，）、腺苷酸環(huán)化酶 5（adenylate cyclase 5，）、谷氨酸離子型受體NMDA型亞基2A（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，）基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因（differential gene expression，DEGs）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）結(jié)果顯示，mRNA表達(dá)上調(diào)和mRNA表達(dá)下調(diào)。丹梔逍遙散可能是通過上調(diào)mRNA表達(dá)和下調(diào)mRNA表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）與其受體的結(jié)合和谷氨酸神經(jīng)傳遞介導(dǎo)，進(jìn)一步改善神經(jīng)元生長(zhǎng)、突觸傳導(dǎo)與突觸的可塑性，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

丹梔逍遙散；焦慮；肝郁化火證；整合藥理學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)

焦慮癥（anxiety）是以廣泛和持續(xù)性焦慮或反復(fù)發(fā)作的驚恐不安為主要特征，常伴有自主神經(jīng)紊亂及運(yùn)動(dòng)性不安的疾病。臨床常分為廣泛性焦慮與驚恐障礙2種主要形式。廣泛性焦慮包括精神性焦慮、軀體性焦慮、心理性警覺、運(yùn)動(dòng)性不安和睡眠障礙；驚恐障礙患者主要在日?；顒?dòng)中，突然出現(xiàn)強(qiáng)烈恐懼的典型表現(xiàn)[1]。中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生與健康調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在2012—2013年我國(guó)城市廣泛性焦慮障礙（36 086例焦慮患者）的發(fā)病率為5.3%[2]。在新型冠狀病毒肺炎流行期間，醫(yī)護(hù)人員的焦慮患病率高達(dá)40%[3]。在后疫情時(shí)代，新型冠狀病毒疫情對(duì)人們的生活、出行、學(xué)習(xí)以及自由活動(dòng)產(chǎn)生了較大影響，從而產(chǎn)生負(fù)面情緒[4]。因此，對(duì)于焦慮癥的研究，特別是尋找中醫(yī)藥防治焦慮癥的有效方藥并闡明其機(jī)制是當(dāng)前的關(guān)鍵和熱點(diǎn)，甚至在未來(lái)幾年將會(huì)是研究熱點(diǎn)。

焦慮癥實(shí)證層面的發(fā)病機(jī)制在于久郁化火，誠(chéng)如朱丹溪在《丹溪心法·六郁》中所言：“氣血沖和，萬(wàn)病不生，一有怫郁，諸病生焉”“凡郁病必先氣病”；劉河間曰：“六氣皆從火化……五志所傷皆化為熱”?？梢姟皻?郁-火”是焦慮癥發(fā)生發(fā)展的病理過程，焦慮癥實(shí)證患者臨床癥狀表現(xiàn)為一派陽(yáng)亢行為，在精神上表現(xiàn)為提心吊膽、主觀過慮，但不能控制；行為上表現(xiàn)為患者軀體性主觀和客觀不適，如心悸、眩暈、多汗、呼吸困難等，以及運(yùn)動(dòng)性不安；除此之外，還有睡眠障礙和心理警覺等[5]。焦慮癥患者從臨床表現(xiàn)來(lái)看更符合“陰不制陽(yáng)”的機(jī)制，“郁”則是發(fā)病的一個(gè)不可或缺的樞紐環(huán)節(jié)。焦慮癥虛證為主層面的發(fā)病機(jī)制在于心神耗損，久病必虛，《靈樞邪客》云：“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也?！苯箲]患者長(zhǎng)期的急躁易怒暗損人體的津液，其中心陰首當(dāng)其沖，《靈樞經(jīng)·口問》亦指出：“悲哀愁憂則心動(dòng)，心動(dòng)則五臟六腑皆搖”。心血不足、心陰虧耗則心失所養(yǎng)，陰不制陽(yáng)，陰陽(yáng)皆損，表現(xiàn)出心情郁悶、心慌多夢(mèng)等。

焦慮證初期主要以肝郁氣滯為主，漸則痰凝、血郁、化熱，后期以氣血不足、陰虛火旺為主，病位主要在心、肝、腎，尤以肝為甚，氣機(jī)失調(diào)是發(fā)病的關(guān)鍵。有研究顯示焦慮證候要素頻率高于5%的有火熱、氣滯、陰虛[6]。丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、茯苓、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、甘草和柴胡組成，出自明代薛己《內(nèi)科摘要·卷下十一·各癥方藥》，具有清熱瀉火、建中補(bǔ)脾、養(yǎng)血柔肝和疏肝調(diào)達(dá)的功效，臨床上丹梔逍遙散已經(jīng)廣泛運(yùn)用在肝郁化火型廣泛性焦慮癥（障礙）的治療中，研究結(jié)果顯示可有效改善患者的焦慮癥狀[7-8]。

1 材料與方法

1.1 丹梔逍遙散化學(xué)成分庫(kù)的建立

利用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)[9]（http://www. tcmip.cn/，TCMIP v2.0）的中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)和中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，檢索“牡丹皮”“梔子”“柴胡”“白芍”“白術(shù)”“茯苓”“當(dāng)歸”“甘草”所包含的化學(xué)成分信息，并建立“丹梔逍遙散化學(xué)成分庫(kù)”。

1.2 藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)

利用TCMIP v2.0，設(shè)置Tanimoto Score為0.8（高準(zhǔn)確度），提取“丹梔逍遙散化學(xué)成分庫(kù)”中藥物成分的化學(xué)分子指紋，預(yù)測(cè)化學(xué)成分的候選靶點(diǎn)譜，并將其與Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的抗焦慮藥物指紋進(jìn)行比對(duì)，將選定評(píng)分＞0.8相似性藥物靶點(diǎn)作為丹梔逍遙散藥物組合的候選靶點(diǎn)[10]。

1.3 疾病、證候靶標(biāo)確定

在TCMIP v2.0的“疾病相關(guān)分子庫(kù)”中，以“anxiety”作為疾病關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，檢索出的所有靶點(diǎn)作為焦慮癥的候選靶點(diǎn)集。

2020年《國(guó)際中醫(yī)臨床實(shí)踐指南·焦慮癥》將肝郁化火證臨床表現(xiàn)定義為情緒不寧、郁悶煩躁、胸脅脹痛、脘悶噯氣、不思飲食、大便不調(diào)，或見急躁易怒、口苦而干，或頭痛、目赤、耳鳴，或嘈雜吞酸、大便秘結(jié)，舌質(zhì)紅、苔黃，脈弦或弦數(shù)[11]?！稄V泛性焦慮障礙中醫(yī)證候辨證分型及量化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)》將肝郁化火證臨床表現(xiàn)定義為主癥煩躁易怒，善太息，咽中不適，如物梗阻，敏感多疑；次癥為頭痛，面紅目赤，口苦咽干，兩肋脹滿，脘腹不適，痞滿納差，失眠多夢(mèng)，女子月經(jīng)不調(diào)，舌質(zhì)紅或淡紅、苔黃或苔白，脈弦數(shù)[12]?？偨Y(jié)以上指南和專家共識(shí)，最后確定肝郁化火證臨床表型為煩躁、易怒、恐慌、緊張、擔(dān)憂、緊張性頭痛、頭暈、呼吸急促、心動(dòng)過速、坐臥不寧、出汗、上腹不適、注意力困難。在TCMIP v2.0平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，以irritation、anger、panic、nervousness、worry、tension headache、dizziness、shortness of breath、tachycardia、restlessness、sweating、upper abdominal discomfort、difficulty paying attention為關(guān)鍵詞，獲取肝郁化火證證候相關(guān)靶標(biāo)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析與可視化

通過TCMIP v2.0的“網(wǎng)絡(luò)分析模塊”對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取中藥靶點(diǎn)-疾病基因的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（hubs）作為丹梔逍遙散活性成分的候選靶點(diǎn)，然后對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通路富集分析，選取值（＜0.05）排名前20的通路[13]，構(gòu)建完整的“中藥-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化數(shù)據(jù)分析[13]。

1.5 核心靶點(diǎn)的微陣列芯片驗(yàn)證

為檢驗(yàn)中醫(yī)藥整合藥理學(xué)得到的核心靶點(diǎn)的可靠性，以“anxiety”為關(guān)鍵詞，檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/），篩選anxiety相關(guān)的微陣列芯片數(shù)據(jù)集。采用R軟件（3.6.3版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化：利用GEOquery包（2.54.1版本）[14]下載數(shù)據(jù)，limma包（3.42.2版本）[15]進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，umap包（0.2.7.0版本）進(jìn)行UMAP（uniform manifold approximation and projection）分析，ggplot2包（3.3.3版本）進(jìn)行可視化，ComplexHeatmap包（2.2.0版本）[16]繪制熱圖。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9只雄性SFP級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，11周齡。動(dòng)物來(lái)源于北京斯貝福生物技術(shù)科技有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2019-0010。在云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲水和攝取食物（普通飼料來(lái)源于云南楚商科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20210711）。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前1 d搬至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)24 h，保持與動(dòng)物房相同的溫度（25 ℃）和濕度（60%～70%）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)R-062021G106。

1.7 藥物

丹梔逍遙散組成藥物的飲片購(gòu)買于云南中醫(yī)藥大學(xué)匯賢中醫(yī)醫(yī)院，由主管中藥師閆永啟主任鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。8味中藥，每付共計(jì)78 g，見表1。將全部飲片浸泡在10倍體積的純水中，浸泡1 h，先武火煮開，后改用文火，煮1 h后濾過藥液。然后加入10倍體積的純水繼續(xù)二煎，1 h后混合2次濾過后的藥液。最后再將藥物濃縮成含生藥1.56 g/mL的水煎液，將煮好的水煎液放置冰箱保鮮層，每天給藥前2 h取出當(dāng)天劑量，放置常溫環(huán)境待用。

表1 丹梔逍遙散藥物信息

1.8 動(dòng)物分組、給藥及模型制備

9只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為丹梔逍遙散組、模型組和對(duì)照組，每組3只。3組均給予正常普通飼料和自由飲水，每天10:00時(shí)，丹梔逍遙散組大鼠給予丹梔逍遙散水提物（生藥15.6 g/kg），對(duì)照組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水（10 mL/kg），共2周。除了對(duì)照組外，每天下午隨機(jī)時(shí)間開始對(duì)丹梔逍遙散組和模型組大鼠連續(xù)2周給予隨機(jī)慢性束縛應(yīng)激（每天隨機(jī)使用特制束縛架將模型組和丹梔逍遙散組大鼠固定在內(nèi)不能活動(dòng)，束縛架如圓筒狀，大鼠頭部和四肢從圓筒孔中暴露出來(lái)，每天1次，每次2 h）進(jìn)行造模。每隔3 d測(cè)1次體質(zhì)量。第14天19:00時(shí)開始進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，每只大鼠5 min，按時(shí)間順序進(jìn)行。

1.9 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試動(dòng)物焦慮程度。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)器材由2個(gè)開放臂（0.35 m×0.60 m）、2個(gè)封閉臂（0.35 m×0.60 m）以及交叉連接部（0.05 m×0.05 m）的開闊平臺(tái)組成。封閉臂有0.15 m高的黑色擋板，十字迷宮平臺(tái)離地面0.5 m。保持晝夜節(jié)律的光暗調(diào)整，實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)過程中保持無(wú)燈光狀態(tài)，開始將大鼠面向開臂放在高架十字迷宮的交叉連接部中央，同時(shí)開始軟件記錄大鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)軌跡以及在不同部位的時(shí)間和次數(shù)。①進(jìn)入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）：即進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠4只爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途1只爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動(dòng)完成。②進(jìn)入開放臂時(shí)間（open arm time，OT）：即進(jìn)入開放臂的時(shí)間（s）。③進(jìn)入封閉臂次數(shù)（close arm entry，CE）：即進(jìn)入任一封閉臂的次數(shù)，以大鼠4只爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)。④進(jìn)入封閉臂時(shí)間（close arm time，CT）：即進(jìn)入封閉臂的時(shí)間（s）。由以上指標(biāo)計(jì)算進(jìn)入開放臂次數(shù)比例（OE%）、開放臂停留時(shí)間比例（OT%）。上述記錄由SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)完成，以排除測(cè)試過程的人為干擾因素。每次測(cè)試結(jié)束后清除糞便，并用75%乙醇清理迷宮，以掩蓋氣味。待乙醇蒸發(fā)后方可開始下1只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

OE%＝OE/(OE＋CE)

OT%＝OT/(OT＋CT)

1.10 qRT-PCR驗(yàn)證

1.10.1 主要儀器和材料 CFX Connect Real-Time System熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad），D3024R型離心機(jī)（美國(guó)SCILOGEX），Analytikjena-Easycycler普通PCR儀（德國(guó)Analytik Jena），Scandrop100型超微量核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Analytik Jena），移液器（美國(guó)Bio-rad），M2全自動(dòng)加樣儀（四川科勁生物科技有限公司）。TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，貨號(hào)pc70）；2×SYBR?Green預(yù)混液（成都丹鳳科技有限公司，貨號(hào)DF001）。

1.10.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 各組大鼠麻醉后取腦組織，在冰塊上分離海馬組織和前額葉皮質(zhì)，然后將海馬組織、前額葉皮質(zhì)和剩余腦組織分別裝于1.5 mL離心管，迅速在液氮中凍存，放置于?80 ℃冰箱保存，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成測(cè)序驗(yàn)證。

提取對(duì)照組、丹梔逍遙散組和模型組大鼠海馬組織的總RNA，采用SYBR GREEN I檢測(cè)對(duì)照組、模型組和丹梔逍遙散組大鼠海馬組織RNA樣品3個(gè)目的基因腺苷酸環(huán)化酶5（adenylate cyclase 5，）、谷氨酸離子型受體NMDA型亞基2A（GRIN2A-glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A Gene，）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，）的mRNA表達(dá)量，用2?ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，）為內(nèi)參基因，所有實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次，引物合成信息見表2。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 丹梔逍遙散成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)及分析

通過TCMIPV2.0平臺(tái)對(duì)丹梔逍遙散化學(xué)成分的分析結(jié)果可知，共包含430種成分，候選靶標(biāo)520個(gè)。對(duì)候選靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析和通路富集分析，發(fā)現(xiàn)其功能大多與谷氨酸受體信號(hào)通路、谷氨酸代謝過程、離子型谷氨酸受體信號(hào)通路、視黃醇代謝過程、-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、興奮性突觸后電位、γ-氨基丁酸信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)密切相關(guān)，排名前20的功能和通路如圖1所示。

表2 引物信息

圖1 丹梔逍遙散成分候選靶標(biāo)的功能和通路分析氣泡圖

2.2 焦慮疾病靶標(biāo)及相關(guān)基因

對(duì)全疾病相關(guān)潛在靶標(biāo)合并去重后，共獲得209個(gè)，其中與丹梔逍遙散密切相關(guān)的共同靶基因共13個(gè)，分別是長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A合成酶4（Acyl-CoA synthetase long chain family member 4，）、醛脫氫酶5家族成員A1（aldehyde dehydrogenase 5 family member A1，）、ATP酶Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)亞基α3（ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 3，）、鈣敏感受體（calcium sensing receptor，）、兒茶酚--甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-methyltransferase，）、-氨基酸氧化酶（-amino acid oxidase，）、、（GNAS complex locus）、PI3K催化亞基p110alpha的編碼基因（）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體2（transforming growth factor beta receptor 2，）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，）、核受體亞家族3 C組成員1（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，）。

2.3 潛在靶點(diǎn)PPI分析

通過對(duì)13個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，、、與其他靶標(biāo)無(wú)關(guān)聯(lián)性。其他10個(gè)靶標(biāo)體現(xiàn)出較高的中心度，其中以為主，見圖2。故在后續(xù)的驗(yàn)證中優(yōu)先驗(yàn)證、、、、、、、、、。

2.4 丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

TCMIP v2.0平臺(tái)采用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計(jì)算及可視化等方法和技術(shù)，形成7大整合藥理學(xué)分析模塊，包括疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘、證候相關(guān)分子挖掘及功能分析、中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測(cè)及功能分析、中藥藥性相關(guān)分子挖掘及功能分析、組方用藥規(guī)律分析、中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘和反向查找中藥（含方劑）。丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)圖是基于“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”構(gòu)建，根據(jù)中藥方劑、中藥材、中藥成分、核心靶標(biāo)、通路、疾病和證候之間的關(guān)聯(lián)性，可任意選擇不同類型的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)[17]。

圖2 13種關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的PPI分析

如圖3所示，圖中五角星表示方劑丹梔逍遙散，正方形表示中藥，圓形表示靶標(biāo)，橢圓形表示肝郁化火證臨床表型，三角形表示丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的相關(guān)通路。通過網(wǎng)絡(luò)圖可以一目了然地發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)及其作用機(jī)制，有助于揭示其科學(xué)內(nèi)涵。

2.5 核心靶點(diǎn)微陣列芯片驗(yàn)證結(jié)果

最終選定微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE4035。該數(shù)據(jù)集基于GPL1261 [Mouse430_2] Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array陣列平臺(tái)，包含12例焦慮RNA樣本（組2）和12例健康RNA樣本（組1）。由圖4可見，基因表達(dá)譜區(qū)分度良好，保證了后續(xù)差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。去掉空值后的ID總數(shù)為20 814個(gè)，滿足|log2(FC)|＞1和adj＜0.05閾值的ID有972個(gè)，在這閾值下，組2中高表達(dá)（log2FC為正）的數(shù)目有501個(gè)，組1中高表達(dá)（log2FC為負(fù)）的數(shù)目有471個(gè)；組間差異基因火山圖見圖5，熱圖見圖6。

圖3 丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

GSE4035數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因與、、、、、、、、、得到3個(gè)交集基因，分別是、和，證明了上述分析的可靠性。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.6.1 一般情況和體質(zhì)量 造模期間，丹梔逍遙散組與對(duì)照組的大鼠皮毛光澤順滑，二便正常，日?；顒?dòng)靈敏。模型組大鼠變得較為暴躁，皮毛光澤暗淡。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，丹梔逍遙散組和模型組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)較緩，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

2.6.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 如圖7所示，在OT%方面，模型組低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；丹梔逍遙散組高于模型組，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.069）。在OE%方面，模型組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；丹梔逍遙散組低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。

圖4 焦慮數(shù)據(jù)集主成分分析

上調(diào)基因用紅色標(biāo)記，下調(diào)基因用藍(lán)色標(biāo)記，無(wú)差異的基因用灰色標(biāo)記

2.6.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣品中mRNA表達(dá)豐度低，有些樣本沒有t值，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。與對(duì)照組比較，模型組mRNA表達(dá)量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.056 7），mRNA表達(dá)量顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，丹梔逍遙散組mRNA表達(dá)量顯著降低（＜0.05），mRNA表達(dá)量顯著升高（＜0.001）（圖8）。表明這2個(gè)核心靶點(diǎn)基因的相對(duì)定量值與整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致，證明整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和GEO數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果的可靠且重復(fù)性好。

圖8 qRT-PCR檢測(cè)大腦海馬組織中ADCY5和GRIN2A的mRNA表達(dá)量()

3 討論

3.1 焦慮肝郁化火證中醫(yī)病機(jī)與治療策略

焦慮屬于中醫(yī)“郁”的范疇。南宋的陳言提出“臟氣不行，郁而生涎……皆七氣所生所成”，郁是疾病發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)?，郁既有病的概念，也是證的范疇；明清時(shí)期，“郁”多被單列一門，《醫(yī)學(xué)正傳》首用“郁證”作為病名進(jìn)行論述[5]。但對(duì)于“郁”的治療不僅是疏散之法，有研究顯示古代醫(yī)家治療郁多以“培土”為基礎(chǔ)，輔以疏肝，酌用清熱、行氣、安神之品[6]。

通過焦慮肝郁化火證的臨床證候表型可以看出，焦慮肝郁化火證患者實(shí)際臨床中往往呈現(xiàn)虛實(shí)夾雜，本虛標(biāo)實(shí)，陰虛陽(yáng)亢的病機(jī)，譬如運(yùn)動(dòng)性緊張、坐臥不寧、緊張性頭痛、顫抖、心動(dòng)過速或呼吸急促、無(wú)法放松屬于虛陽(yáng)外亢的臨床表現(xiàn)；擔(dān)憂、注意困難、頭重腳輕、出汗、頭暈、口干屬于正虛的臨床表現(xiàn)。丹梔逍遙散組方和功效劃分恰好符合焦慮肝郁化火證的整體病機(jī)，其中丹皮、梔子清熱瀉火治療陽(yáng)亢于外，茯苓、炒白術(shù)、炙甘草建中補(bǔ)脾治療脾氣虧虛，當(dāng)歸、白芍、柴胡養(yǎng)血柔肝補(bǔ)肝體而疏肝用。總體而言，焦慮肝郁化火證涉及主要病位在肝、脾，主要病性虛、實(shí)，丹梔逍遙散的組方符合焦慮肝郁化火證的發(fā)病機(jī)制。本研究借助TCMIP v2.0平臺(tái)，從中藥成分、證候要素、疾病靶點(diǎn)的多層次研究以及從藥物自身出發(fā)，較為全面地展現(xiàn)了中藥-證候-疾病-靶標(biāo)-通路的銜接性研究，形成中醫(yī)藥現(xiàn)代研發(fā)體系，從分子角度解釋了中醫(yī)藥療效內(nèi)涵[18]。

3.2 整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析

丹梔逍遙散化學(xué)成分分析，谷氨酸受體包括離子型受體和代謝性受體，離子型谷氨酸受體包括-甲基--天冬氨酸（-methyl--aspartic acid，NMDA）受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受體和Kainate受體；應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，NMDARs會(huì)被過度激活，Ca2+通道反復(fù)開放，過多的Ca2+內(nèi)流使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[19]。應(yīng)激狀態(tài)下，上調(diào)的AMPAR增加了腦內(nèi)谷氨酸興奮性毒性，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣累積，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的破壞和腦組織的結(jié)構(gòu)損傷[20]。代謝型谷氨酸2型受體和γ-氨基丁酸B受體屬于C家族G蛋白偶聯(lián)受體，分別是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的代謝型受體，γ-氨基丁酸B受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)緩慢的抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)和突觸可塑性調(diào)控，其活性的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、損傷甚至細(xì)胞凋亡[21]。

“中藥-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析顯示，丹梔逍遙散通過調(diào)控AMPA受體、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)、胰高血糖素信號(hào)中的PKA激活、NMDA受體激活、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號(hào)通路，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等通路進(jìn)行干預(yù)。

ADCY5是一種腺苷酸環(huán)化酶，通過合成第2信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）來(lái)介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)傳導(dǎo)。此外，cAMP也是一種典型的第2信使，其通過濃度的變化響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶和非酶蛋白的活性，激活依賴于cAMP的PKA表達(dá)增加磷酸化水平，并調(diào)節(jié)等基因的表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[22]。

GRIN2A是重要的谷氨酸離子向受體NMDA型亞基，焦慮樣行為與海馬中GRIN2A的上調(diào)有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)與Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium-calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的結(jié)合來(lái)影響突觸的可塑性[23]。DAO是一種降解-絲氨酸的酶，是NMDAR的主要內(nèi)源性共激動(dòng)劑，滅活或缺失DAO將會(huì)加劇焦慮[24]。

雌激素受體1（estrogen receptor 1，）二核苷酸重復(fù)等位基因與90項(xiàng)癥狀清單（symptom check list 90，SCL-90）9個(gè)亞分?jǐn)?shù)和總分之間的關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示，其與SCL-90評(píng)分中焦慮、恐懼焦慮和總癥狀有顯著關(guān)聯(lián)[25]。已有的研究表明，變異與認(rèn)知結(jié)果之間具有密切關(guān)系，初步證據(jù)表明基因在某些情緒中的作用，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與焦慮或抑郁癥狀關(guān)聯(lián)顯著[26]。

本研究旨在探討丹梔逍遙散治療焦慮的本質(zhì)，完善和補(bǔ)充現(xiàn)有的研究。目前有諸多學(xué)者對(duì)丹梔逍遙散治療焦慮展開了深入研究，在生物學(xué)機(jī)制方面丹梔逍遙散可以顯著降低焦慮大鼠炎癥反應(yīng)、機(jī)制細(xì)胞凋亡和和減輕護(hù)神經(jīng)元損傷以及提高線粒體功能、提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和蛋白激酶蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌，從而改善焦慮樣行為。初步闡明了丹梔逍遙散治療焦慮癥的作用機(jī)制和主要成分協(xié)同作用的機(jī)制，同時(shí)支撐了丹梔逍遙散在防治療焦慮癥方面的應(yīng)用。

3.3 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果分析

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)錄組學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，、、與焦慮肝郁化火證密切相關(guān)。雌激素在很大程度上通過其主要的ESR1和ESR2的細(xì)胞內(nèi)激活來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用。因此，雌激素受體的遺傳變異可能會(huì)改變雌激素信號(hào)，從而影響女性患者抑郁癥的易感性[27]。也有研究顯示，5-羥色胺基因與基因多態(tài)交互作用可能增加女性圍絕經(jīng)期抑郁障礙患病的風(fēng)險(xiǎn)[28]。進(jìn)一步驗(yàn)證了基因是核心靶點(diǎn)基因之一。

可以通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)進(jìn)而對(duì)谷氨酸損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，BDNF可增加谷氨酸損傷皮層神經(jīng)元NMDAR1 mRNA及蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)其NMDA受體活性。同時(shí)GRIN2A是谷氨酸離子向受體NMDA型重要亞基，亦影響著NMDA受體的活性。因此，推測(cè)丹梔逍遙散可能是通過下調(diào)和上調(diào)基因的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)BDNF表達(dá)和增加NMDA活性，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果分析

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OT%方面，雖然丹梔逍遙散組高于模型組，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.069），但通過統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出具有明顯的趨勢(shì)，其原因可能與樣本量少有關(guān)。在OE%方面，丹梔逍遙散組與模型組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明丹梔逍遙散能改善焦慮模型大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)。

核心靶點(diǎn)基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，和mRNA表達(dá)量模型組與對(duì)照組、丹梔逍遙散組與模型組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；核心靶點(diǎn)經(jīng)qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，丹梔逍遙散能降低mRNA表達(dá)（＜0.05），升高mRNA的表達(dá)（＜0.001）。

4 結(jié)論

本研究對(duì)丹梔逍遙散組方候選靶標(biāo)與焦慮癥進(jìn)行關(guān)聯(lián)并以網(wǎng)絡(luò)可視化形式展現(xiàn)，并預(yù)測(cè)其可能靶標(biāo)和分子信號(hào)通路。丹梔逍遙散調(diào)控的主要通路有AMPA受體的激活、PKA激活、胰高血糖素信號(hào)中的PKA激活、NMDA受體激活、PI3K/Akt等。中醫(yī)藥整合藥理學(xué)和GEO數(shù)據(jù)集獲取交集基因，包括、、基因；丹梔逍遙散可能通過上調(diào)mRNA表達(dá)和下調(diào)mRNA表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)和NMDA活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)BDNF與其受體的結(jié)合和NMDA活性，從而調(diào)節(jié)BDNF與其受體結(jié)合，進(jìn)一步改善神經(jīng)元生長(zhǎng)、突觸傳導(dǎo)與突觸的可塑性，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Discussion on mechanism of Danzhi Xiaoyao Powder in prevention and treatment of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome based on integrative pharmacology of traditional Chinese medicine and transcriptomics

PAN Ci-ming1, 2, REN Xue2, 3, WEI Shan-shan1, CAO Bei-ling1, WANG Wei1, YANG Yan1, CHEN Wen-hui1, XU Hong-xi2

1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To explore the mechanism of Danzhi Xiaoyao Powder (丹梔逍遙散) in the prevention and treatment of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome based on integrated pharmacology of traditional Chinese medicine and transcriptomics.The integrated pharmacology research platform of traditional Chinese medicine v2.0 was used to retrieve and obtain the active ingredients and target information of Danzhi Xiaoyao Powder, and the target information of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome, and construct the network of traditional Chinese medicine-component-target-pathway. The intersection genes were imported into the String database, and the protein interaction network of intersection targets was constructed to determine the target that needed to be verified. The transcriptomic of GEO database were used to verify the integrated network pharmacology results, and animal experiments were used to verify the results.A total of 13 targets related to anxiety with liver depression transforming into fire syndrome and 430 kinds of active ingredients of Danzhi Xiaoyao Powder were screened out, and the integrated pharmacological results showed that Danzhi Xiaoyao Powder prevented and treated anxiety with liver depression transforming into fire syndrome by mainly regulating the activation of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor (AMPAR), protein kinase A (PKA),-methyl--aspartic acid (NMDA) receptor, phosphatidylinositide 3-kinases (PI3K) of protein kinase B (Akt) and other signal pathways of anxiety liver depression and fire syndrome. The GEO microarray GSE4035 data set, the key targets of transcriptomics estrogen receptor 1 (), adenylate cyclase 5 () and glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A () genes were differential gene expression (DEGs). Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) results showed thatmRNA expression was up-regulated andmRNA expression was down-regulated.Danzhi Xiaoxiao Powder may regulate brain-derived neurotrophic factor (BDNF) by up-regulating the expression ofmRNA and down-regulating the expression ofmRNA, thus regulating the binding of BDNF and its receptors and the neurotransmission of glutamate, further improve neuron growth, synaptic conduction and synaptic plasticity, so as to exert its biological effects.

Danzhi Xiaoyao Powder; anxiety; liver depression transforming into fire syndrome; integrative pharmacology; transcriptomics

R285

A

0253 - 2670(2023)12 - 3911 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.018

2023-02-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81703964）；云南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（202101AZ070001-021）；云南省教育廳基金項(xiàng)目：基于GC-NLRP3炎癥小體通路研究丹梔逍遙散干預(yù)肝郁化火型焦慮行為大鼠的作用機(jī)制（2022Y332）；云南省科技廳科技人才與平臺(tái)計(jì)劃—云南省中醫(yī)藥學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[2019DG016BK-基于整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究丹梔逍遙散防治郁化火型焦慮行為的作用機(jī)制（30172110174），BK-丹梔逍遙散通過GC-NLRP3信號(hào)通路干預(yù)焦慮行為大鼠的機(jī)制研究（30172110179）]

潘賜明（1993—），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治肝膽及腫瘤疾病的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail: panciming@ynutcm.edu.cn

通信作者：韋姍姍（1987—），女，云南昆明人，副教授，博士學(xué)位，主要從事證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究工作。E-mail: weiss814@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]