趙清揚, 張帥, 杜文靜, 徐亦豪
(河北工業(yè)大學 河北省生物電磁與神經(jīng)工程重點實驗室(籌),天津市生物電工與智能健康重點實驗室, 天津 300130)
經(jīng)顱磁聲電刺激(transcranial magneto-acoustic-electrical stimulation, TMAES)作為一種新型的無創(chuàng)神經(jīng)調(diào)控技術,具有較好的空間分辨率和刺激深度[1].TMAES通過磁場和聲場2種物理場的耦合,共同作用于神經(jīng)組織,在利用超聲改變離子通道活性、降低神經(jīng)元放電閾值的同時,通過磁聲耦合產(chǎn)生的感應電流來調(diào)節(jié)神經(jīng)組織的活動狀態(tài)[2].經(jīng)顱磁聲耦合刺激方法率先由Stephen[3]提出,并在理論上詮釋了該刺激方法的可行性.李慧雨等[4]通過實驗證實聲場與磁聲耦合感應電場之間的高度一致性,進一步驗證了TMAES對神經(jīng)組織調(diào)控作用的可行性;袁毅等[5]基于Hodgkin-Huxley神經(jīng)元模型,研究了TMAES對神經(jīng)元放電模式的影響;Wang等[6]通過采集帕金森小鼠DG區(qū)的場興奮性突觸后電位,發(fā)現(xiàn)TMAES能夠促進帕金森模型小鼠海馬突觸傳遞的長時程增強,揭示了TMAES可以通過調(diào)節(jié)突觸傳遞可塑性進而改善帕金森小鼠的學習記憶能力;本課題組[7]通過采集大鼠執(zhí)行T迷宮工作記憶任務中前額葉皮層的局部場電位信號,發(fā)現(xiàn)TMAES能夠促進前額葉皮層神經(jīng)元集群之間的信息交流與傳遞,進而改善大鼠的工作記憶.
突觸傳遞可塑性在大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡信息處理與傳遞過程中起重要的調(diào)節(jié)作用,其改變使生物體能夠?qū)W習并形成記憶[8-9],其中,突觸傳遞的短時程可塑性(short-term plasticity,STP)作為一種精確到毫秒到秒時間尺度的突觸傳遞特性,其調(diào)節(jié)的皮層神經(jīng)網(wǎng)絡持續(xù)放電活動是維持工作記憶的重要原因[10-11].突觸傳遞的短時程增強和抑制的產(chǎn)生都會影響多項目工作記憶的能力[12].Rolls等[13]表明突觸傳遞的短時程增強增加了工作記憶的容量;Li等[14]研究了突觸傳遞的STP對連續(xù)吸引子神經(jīng)網(wǎng)絡的影響,揭示了“動態(tài)擾動”通過STP原理改變了工作記憶項目的突觸效率,并導致其相對記憶強度發(fā)生變化.大量研究表明,突觸傳遞的短時程增強和抑制是突觸前神經(jīng)元鈣積累的結(jié)果[15].突觸傳遞效能可以通過殘余鈣的積累促進神經(jīng)軸突末梢囊泡釋放量而增加,或者通過囊泡耗竭而降低[16].最近研究顯示,低強度低頻超聲可以通過激活星形細胞的TRPA1通道,打開鈣離子通道促進谷氨酸的釋放,從而引起突觸傳遞效能的增加[17].劉亮等[18]提出,經(jīng)顱超聲刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)可以通過調(diào)節(jié)谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放影響突觸間的信息傳遞,是多種神經(jīng)退行性疾病緩解和治療的潛在方法.
目前已發(fā)現(xiàn)TMAES對嚙齒類動物工作記憶能力有明顯的改善作用[7],但尚不清楚其如何調(diào)節(jié)突觸傳遞進而影響工作記憶相關信息編碼.為了探究TMAES對皮層鈣信號及突觸傳遞特性的影響,本文通過搭建基于磁聲電效應改進的皮層錐體神經(jīng)元模型,引入鈣依賴神經(jīng)遞質(zhì)釋放的計算方法來計算TMAES不同磁場強度和超聲功率強度引起的興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),隨后以EPSP作為評價指標來評估不同TMAES參數(shù)下突觸傳遞的STP.最后使用光纖光度檢測實驗驗證TMAES對前額葉皮層神經(jīng)元集群鈣信號的調(diào)控作用,以揭示TMAES下鈣依賴突觸傳遞機制.該研究有助于進一步探究TMAES對工作記憶的深層調(diào)控機理,理解TMAES下工作記憶相關的皮層神經(jīng)網(wǎng)絡信息編碼機制.
經(jīng)顱磁聲電刺激對神經(jīng)組織的調(diào)控機制主要包括磁聲耦合效應和超聲波機械效應.磁聲耦合效應是指超聲機械振動引起組織中帶電粒子產(chǎn)生位移[2],在靜磁場的作用下,帶電粒子受到洛倫茲力的作用發(fā)生偏轉(zhuǎn),從而產(chǎn)生感應電流施加在神經(jīng)元上[5].TMAES原理如圖1所示.感應電流
圖1 TMAES原理Fig.1 Principles of TMAES
(1)
其中,σ為組織電導率,B為磁場強度,W為超聲功率強度,ρ為生物組織密度,c0為超聲在組織中的傳播速度.
超聲波機械效應是指在磁聲電刺激過程中,超聲波機械振動引起細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.在空泡動力學Rayleigh-Plesset方程的基礎上求解修正的動力學壓力平衡方程,得到單位面積膜電容Cm的近似推導[3]
Cm=Cm0+CAmpsin(2πft),
(2)
其中,Cm為膜電容,Cm0為靜息狀態(tài)膜電容,CAmp為在超聲波刺激下神經(jīng)元細胞膜電容變化量,f是超聲頻率.
基于皮層錐體神經(jīng)元模型進行了一系列改進,增加了磁聲耦合刺激項和隨超聲頻率變化的膜電容[19-20],并引入皮層錐體神經(jīng)元鈣濃度計算公式,以進一步計算鈣依賴神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[21].改進的皮層錐體神經(jīng)元計算模型如下:
(3)
其中,V表示膜電位,INa、IK、ICa、IL分別為鈉、鉀、鈣、漏電流,τc是鈣濃度的衰減時間常數(shù),C(Ca2+)是Ca2+濃度,C(Ca)是初始鈣濃度,KCa為平均鈣增益,是將鈣電流轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)鈣濃度的參數(shù).
(4)
其中,gNa、gK、gCa、gL分別表示Na+、K+、Ca2+和漏電流離子通道最大電導,其取值分別為20、20、40、2 ms/cm2,ENa、EK、ECa、EL分別表示Na+、K+、Ca2+、Cl-反轉(zhuǎn)電位,分別為50、-100、120、-55 mV.m、h、n、w是相應的離子通道門控變量.各離子通道門控變量如下:
(5)
其中,β∞、γm分別為-1.2、18 mV,φw=0.15,τh、τn是時間常數(shù),分別為15、80 ms.
突觸傳遞的生化過程如圖2所示.刺激后,ICa內(nèi)流引起局部鈣濃度急劇上升,鈣濃度的上升是誘導胞吐及神經(jīng)遞質(zhì)釋放的必要條件[9].研究表明:Munc18、SNARE蛋白、突觸小泡蛋白、突觸結(jié)合蛋白-1等突觸前蛋白分子可以介導囊泡的融合和鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[22-23].突觸前鈣依賴性囊泡釋放概率P計算方程如下:
圖2 突觸傳遞生化過程Fig.2 Biochemical processes of synaptic transmission
(6)
其中,Pmax=1表示最大釋放概率,希爾系數(shù)nH= 4,Kr,1/2是鈣緩沖敏感度.
刺激期間可釋放囊泡比率R的時間過程取決于釋放位點恢復速率和胞吐率之間的差異.R隨時間變化過程如下:
(7)
其中,k表示釋放位點恢復速率,R反映了TMAES下突觸前神經(jīng)元囊泡實際釋放情況.
谷氨酸(Glutamate, Glu)釋放通量
FGlu=nNrPICa=nNRPICa,
(8)
其中,Nr是實際可釋放囊泡數(shù),由可釋放囊泡比率R和可釋放囊泡的總數(shù)N決定.
由于N在幾秒鐘的時間內(nèi)大致保持不變.式(8)表明FGlu由2個關鍵變量R和P決定.初始狀態(tài)時,假設所有囊泡首先被完全填充,則R=1.
EPSP的時間過程計算方法如式(9)所示.
(9)
其中,KGlu是單位Glu通量與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor, AMPAR)結(jié)合產(chǎn)生的EPSP增益,VE是EPSP幅值,τE是EPSP衰減時間常數(shù),為40 ms.模型中各參數(shù)取值參考文獻[20-21,24].
EPSP反映了TMAES作用下突觸后響應大小隨時間的變化情況,而鈣依賴的囊泡釋放概率P和可利用囊泡比率R共同影響了EPSP的變化.為了探究TMAES不同磁場強度對突觸傳遞過程及EPSP的影響,設置W為2.6 W/cm2不變,B分別為0.1、0.3、1 T時,皮層錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度、R-P變化曲線、EPSP分別如圖3~5所示.由圖3可知,隨著磁場強度B的增加,皮層錐體神經(jīng)元鈣濃度幅值和頻率均明顯提高.圖4可知,P的變化趨勢與TMAES作用下鈣濃度變化趨勢一致.隨著P的增大,R產(chǎn)生衰減,當P達到最大時,R衰減到最小,隨后P隨著鈣濃度的下降而減小,R上升.磁場強度B的增大引起鈣濃度增加進而導致P上升,當P大于R時,產(chǎn)生囊泡耗竭現(xiàn)象.
P1、R1:B=0.1T,W=2.6 W/cm2;P2、R2:B=0.3T,W=2.6 W/cm2;P3、R3:B=1T,W=2.6 W/cm2圖4 不同磁場強度下R/P變化曲線Fig.4 R/P curves at different magnetic field strengths
B=0.1 T時,如圖4中P1與R1所示,P1遠遠小于R1,未產(chǎn)生囊泡耗竭,結(jié)合圖5可以看出EPSP幅值持續(xù)增長未產(chǎn)生衰減;B=0.3 T時,如圖4中P2與R2所示,P2在220 ms時大于R2,此時產(chǎn)生囊泡耗竭現(xiàn)象,結(jié)合圖5可知EPSP幅值增長速率減緩;B=1 T時,如圖4中P3與R3所示,P3在180 ms時大于R3,且P3與R3的差值持續(xù)增大,在約275 ms時達到最大,結(jié)合圖5可知EPSP幅值在180 ms時增長速度減緩,在190 ms時產(chǎn)生幅度抑制.結(jié)果顯示:隨著TMAES磁場強度增大而產(chǎn)生的囊泡耗竭達到一定程度時,EPSP幅度才可以產(chǎn)生抑制現(xiàn)象.圖5中,隨著B的增加,EPSP最大幅值顯著增大,但在不同的時間尺度上會產(chǎn)生幅度增長速率的減緩甚至抑制,這反映了突觸作為信號過濾器的基本功能[15].超聲功率不變的情況下,單獨改變磁場強度可以通過調(diào)節(jié)鈣依賴性囊泡釋放進而影響EPSP,且當磁場強度較大時,EPSP幅度產(chǎn)生抑制,這種幅度抑制是由于TMAES較高磁場強度下高鈣濃度引起的囊泡耗竭造成的.
圖5 不同磁場強度下的EPSPFig.5 EPSP at different magnetic field strengths
為了探究TMAES不同超聲功率強度對突觸傳遞過程及EPSP的影響,設置B為0.3 T不變,超聲功率強度W分別為1.2、2.6、5 W/cm2時,皮層錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度、R-P變化曲線、EPSP分別如圖6~8所示.不同超聲功率下皮層錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度變化如圖6所示.隨著W的增加,胞內(nèi)鈣濃度幅值和頻率均明顯提高.不同超聲功率下R-P變化曲線如圖7所示.W=1.2 W/cm2時,參照圖7中P4與R4,P4遠遠小于R4,未產(chǎn)生囊泡耗竭,結(jié)合圖8可以看出,EPSP幅值持續(xù)增長未產(chǎn)生衰減;W=2.6 W/cm2時,P5在220 ms時大于R5,產(chǎn)生較小的囊泡耗竭,結(jié)合圖8可看出,EPSP幅值在220 ms時增長速率減緩;W=5 W/cm2時,參照圖7中P6與R6,P6在170 ms時大于R6,且P6與R6的差值持續(xù)增大,在約270 ms時達到最大,結(jié)合圖8可以看出,EPSP幅值在170 ms時增長速度減緩,增長速率減緩對應的時間提前,但未產(chǎn)生幅度抑制,這是由于囊泡耗竭程度,即P與R的差值較小未達到產(chǎn)生抑制的條件.圖8中,隨著超聲波功率強度的增大,EPSP最大幅值增加,W=2.6 W/cm2時,EPSP在220 ms時增長速度減緩,W=5 W/cm2時,EPSP幅值增長速率減緩的時間提前,但沒有產(chǎn)生抑制.同樣地,在磁場強度不變的情況下,單獨改變超聲功率可以通過調(diào)節(jié)鈣依賴性囊泡釋放進而影響EPSP.TMAES不同超聲功率強度下高鈣濃度產(chǎn)生的囊泡耗竭是造成EPSP幅度增長速率減緩甚至產(chǎn)生抑制的原因,只有囊泡耗竭程度較大時,EPSP幅度才會產(chǎn)生抑制.綜上,TMAES對突觸后響應大小的調(diào)節(jié)作用是雙向的,磁場強度和超聲功率的持續(xù)增大也會引起EPSP抑制產(chǎn)生.相關研究表明,用于維持神經(jīng)網(wǎng)絡的持續(xù)放電活動的突觸傳遞的短時程增強和抑制是維持工作記憶的重要原因,而短時程增強減少了神經(jīng)網(wǎng)絡系統(tǒng)的固有漂移,從而延長記憶存儲時間[11].因此,可以根據(jù)治療需求,通過同時改變B和W來得到TMAES的對STP的最佳調(diào)控效果.
圖6 不同超聲功率強度下皮層錐體神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度隨時間變化曲線Fig.6 Intracellular calcium concentration curve of cortical pyramidal neurons with different ultrasonic power intensity
P4、R4:W=1.2 W/cm2,B=0.3 T;P5、R5:W=2.4 W/cm2, B=0.3 T;P6、R6:W=5 W/cm2,B=0.3 T圖7 不同超聲功率強度下R/P變化曲線Fig.7 R/P curves at different ultrasonic power intensity
圖8 不同超聲功率強度下的EPSPFig.8 EPSP at different ultrasonic power intensity
為了驗證TMAES能夠通過調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)集群鈣信號從而影響神經(jīng)突觸傳遞過程,本節(jié)使用光纖光度檢測技術采集刺激前后小鼠前額葉皮層神經(jīng)集群的鈣信號,對其進行幅值、頻率分析,從實驗的角度探究TMAES對突觸傳遞相關鈣信號的影響.實驗過程均遵循國際實驗動物委員會和河北省實驗動物管理辦法的規(guī)定.
將15只KM小鼠(雄性,體質(zhì)量(36±3) g,購于北京華阜康生物科技有限公司)隨機分為3組,即假刺激組、TUS組和TMAES組.實驗開始前使用體積分數(shù)4%的異氟烷對小鼠進行氣體麻醉,隨后將小鼠固定在與麻醉機相連的立體定位儀后,將異氟烷體積分數(shù)改為1%,待小鼠穩(wěn)定麻醉后,分別在每只小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(ML:0.3 mm; AP:1.94 mm; DV:-1.6 mm)注入鈣熒光蛋白rAAV-CaMKIIa-GCaMp6m-WPRE-hGH-polyA(武漢舒密腦科學技術有限公司),隨后植入光纖.手術恢復14 d后,利用本課題組已搭建的磁聲電刺激平臺,使用超聲功率強度為2.6 W/cm2的超聲信號、磁場強度為0.3 T的永磁鐵對TMAES組前額葉皮層進行刺激,TUS組開啟超聲,超聲功率仍為2.6 W/cm2,去除磁鐵,假刺激組不開啟超聲,去除磁鐵.刺激過程持續(xù)120 s,使用光纖光度檢測系統(tǒng)(南京千奧星科有限公司)對每只實驗對象采集刺激前10 s和刺激后20 s內(nèi)的鈣信號數(shù)據(jù).實驗過程如圖9所示.
a.TMAES及鈣信號采集;b.TMAES刺激系統(tǒng)圖9 TMAES與光纖光度檢測實驗Fig.9 TMAES and fiber optic photometric detection experiments
首先采用ΔF/F0作為鈣信號幅度的相對變化指標,對不同刺激模式下前額葉皮層神經(jīng)集群鈣信號濃度的影響進行分析;隨后對各組信號進行統(tǒng)計學分析,進一步驗證TMAES對鈣信號幅度影響的顯著性;最后使用短時傅里葉變換對各組采集到的鈣信號進行時頻分析,探究TMAES對前額葉神經(jīng)元集群鈣信號代謝頻率的影響.ΔF/F0的計算如下:
ΔF/F0=(Vsig-F0)/(F0-Voff),
(10)
其中,Vsig為實時記錄到的鈣信號,F0表示參考時間內(nèi)鈣信號的時間平均值,Voff表示當前分析鈣信號通道的系統(tǒng)偏置數(shù)據(jù),每次實驗前需進行測定.
對鈣信號的時頻分析方法如下:
(11)
其中,X(ω)為鈣信號的頻率分布,ω是原始鈣信號角頻率,x(τ)是原始鈣信號,t為信號時刻,gt,ω(τ-t)為對稱的窗函數(shù),窗函數(shù)采用步長為128的漢明窗.
假刺激組、TUS組和TMAES組鈣信號幅度相對變化量ΔF/F0隨時間變化情況及鈣瞬變信號熱度圖如圖10所示,各組ΔF/F0如表2所示.圖10a中ΔF/F0在刺激前10 s到刺激后20 s間,ΔF/F0在0上下不斷振蕩,刺激前后未產(chǎn)生明顯的變化,圖10b中ΔF/F0在TUS刺激后10 s顯著上升,圖10c中ΔF/F0在TMAES刺激后5 s顯著上升.其中,黑色實線表示各組小鼠ΔF/F0的平均值,紫色部分為樣本均值的標準差范圍.結(jié)合熱度圖可以看出,假刺激組單個樣本的ΔF/F0在刺激前后均未產(chǎn)生明顯的上升或下降,TUS組和TMAES組單個樣本的ΔF/F0在刺激后均明顯提升,相比于TUS組,TMAES組鈣信號幅度相對變化量的上升時間提前,增長幅度明顯提高.將表2中3組數(shù)據(jù)的均值進行統(tǒng)計學分析,如圖10d所示,可以發(fā)現(xiàn),假刺激組、TUS組與TMAES組的ΔF/F0具有顯著性差異(P<0.01).TMAES組平均ΔF/F0及標準差(2.406±2.457)明顯大于假刺激組(0.205±0.987)和TUS組(0.762±1.767),均值差異反映了總體趨勢,樣本標準差的顯著提高說明TMAES下鈣信號幅度對均值的偏離程度更大,因此TMAES下鈣信號幅度振蕩的不確定性更高,TMAES可以顯著提高前額葉皮層神經(jīng)集群突觸傳遞相關鈣信號的濃度,且相比于TUS組調(diào)節(jié)效果更加明顯.
表2 各組ΔF/F0值(x±s)
a.假刺激組;b.TUS組;c.TMAES組;d.統(tǒng)計學分析,***P<0.001圖10 各組刺激前后鈣信號幅度變化、熱度圖及統(tǒng)計學分析Fig.10 Analysis of calcium signal amplitude changes,thermogram and statistical analysis before and after stimulation in each group
圖11a-c分別為假刺激組、TUS組和TMAES組刺激后400 s內(nèi)鈣信號頻率的能量分布.假刺激組和TUS組鈣信號頻率主要集中分布于0~5 Hz,而TMAES鈣信號頻率主要分布于0~10 Hz,TMAES組分布于高頻段的能量相對上升,這說明TMAES對前額葉皮層神經(jīng)集群的鈣信號代謝頻率有一定的提升作用.動作電位的產(chǎn)生和突觸囊泡的轉(zhuǎn)運均依賴于電壓門控鈣通道的開閉以及細胞內(nèi)鈣離子復雜的代謝過程,因此TMAES可以通過調(diào)節(jié)前額葉皮層神經(jīng)集群鈣信號的代謝頻率進而影響神經(jīng)突觸傳遞.
a.假刺激組;b.TUS組;c.TMAES組圖11 刺激后各組鈣信號時頻分析Fig.11 Frequency analysis of calcium signal in each group after stimulation
通過仿真與實驗相結(jié)合的方法,分析TMAES對皮層神經(jīng)元鈣信號及突觸傳遞特性的影響.首先通過搭建改進的皮層錐體神經(jīng)元模型,引入鈣依賴神經(jīng)遞質(zhì)釋放的計算方法以計算TMAES不同參數(shù)引起的EPSP,以EPSP作為評價指標來評估不同TMAES磁場強度和超聲功率強度下突觸傳遞的STP.隨后使用光纖光度檢測實驗驗證TMAES對前額葉皮層神經(jīng)元集群突觸傳遞相關鈣信號的調(diào)控作用,以揭示TMAES下鈣依賴突觸傳遞機制.仿真結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同磁場強度和超聲波功率強度均可影響EPSP,且TMAES對突觸后響應的大小具有雙向調(diào)節(jié)作用.TMAES不同磁場強度和超聲強度均能提高胞內(nèi)鈣信號幅度和頻率,其中,突觸傳遞產(chǎn)生的短時程增強是由于TMAES下胞內(nèi)鈣濃度上升引起的囊泡釋放概率的增加,而短時程抑制是由于TMAES較高的磁場強度和超聲功率強度下胞內(nèi)高鈣濃度引起的囊泡耗竭造成的.實驗結(jié)果表明,TMAES對前額葉皮層神經(jīng)元集群鈣信號幅度和頻率均有明顯的提高,TMAES可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)鈣濃度來影響突觸傳遞.
計算了TMAES不同參數(shù)下細胞鈣濃度、鈣依賴囊泡釋放及EPSP的變化情況,并探討了TMAES下突觸傳遞的生化過程,發(fā)現(xiàn)TMAES對STP具有雙向調(diào)節(jié)作用,TMAES參數(shù)的增大可以在提高突觸傳遞效能的同時,在不同時間尺度對突觸傳遞效能產(chǎn)生抑制.因此,可以通過改變刺激參數(shù)來獲得相應的突觸傳遞效能的增強和抑制以達到治療需求,從而實現(xiàn)對學習記憶的改善效果.此外,本文考慮到超聲參數(shù)對動作電位的調(diào)節(jié)效果,對皮層錐體神經(jīng)元模型進行了一系列改進,增加了磁聲刺激項和隨超聲變化的膜電容,隨后引入皮層錐體神經(jīng)元鈣濃度計算公式以計算由鈣依賴神經(jīng)遞質(zhì)釋放引起的EPSP.但最近的一些研究表明,超聲作為一種物理刺激,超聲機械力對動作電位相關電壓門控離子通道的激活、突觸囊泡轉(zhuǎn)運相關SNARE蛋白活性均具有積極作用[17,23,25].因此,未來應當將隨超聲聲壓變化的離子通道門控變量、TMAES對突觸轉(zhuǎn)運相關蛋白的影響納入研究,更深入地了解TMAES細胞作用機制.本研究為進一步探究TMAES對工作記憶的調(diào)控機理、TMAES下工作記憶相關的皮層神經(jīng)網(wǎng)絡信息編碼機制提供了理論支撐.