蘋果MdPYL9基因?qū)μO果組培苗耐鹽性的影響

劉銘瀟 井俊麗 李曉涵 孫曄 徐繼忠 周莎莎

摘要：以MdPYL9過表達的和未轉(zhuǎn)基因（對照）的GL-3蘋果組培苗為試驗材料，在含有0、100、150mmol/LNaCl的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d，通過觀察鹽脅迫下過表達、未轉(zhuǎn)基因組培苗表型的變化，測定相對電導(dǎo)率（REL）、保護酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）］活性、丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子（O-2·）含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性蛋白）含量等生理指標及蘋果抗鹽相關(guān)基因表達量的變化，旨在探究MdPYL9基因?qū)μO果組培苗耐鹽性的影響。結(jié)果表明，處理15d后，對照、轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗在100、150mmol/LNaCl處理下均出現(xiàn)鹽脅迫癥狀，但轉(zhuǎn)基因組培苗的癥狀較輕，對照植株的癥狀較重。鹽處理后轉(zhuǎn)基因組培苗中的MDA含量、相對電導(dǎo)率、超氧陰離子（O-2·）含量總體呈上升趨勢，且顯著低于對照。轉(zhuǎn)基因組培苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白在100mmol/LNaCl處理下最高，脯氨酸含量逐漸上升，并且顯著高于對照。轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗中SOD、POD、CAT活性在100mmol/LNaCl處理下最高，顯著高于對照中的SOD、POD、CAT活性。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，鹽處理后，蘋果抗鹽相關(guān)基因MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1在轉(zhuǎn)基因組培苗中表達量顯著高于對照。由研究結(jié)果可以看出，MdPYL9基因的過表達可在一定程度上提高組培蘋果苗的耐鹽性。

關(guān)鍵詞：蘋果；MdPYL9基因；組培苗；耐鹽性

中圖分類號：S661.101文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0149-06

蘋果（MalusdomesicaBorkh.）是世界主栽果樹之一，我國的蘋果種植面積和產(chǎn)量占世界的一半以上，居世界首位［1］。土壤鹽漬化可造成果樹樹體營養(yǎng)不良、葉片發(fā)黃和產(chǎn)量下降等問題，是限制蘋果產(chǎn)量的一個重要因素［2］，已被認為是干旱、半干旱地區(qū)和廣大灌區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展中的一個重要阻礙，并且已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注［3］，全球已有約7%陸地遭受到鹽堿化的脅迫，而且這個比例依然在不斷提高。我國是土壤鹽堿化問題嚴重的國家，鹽堿化土壤面積一望無垠、分布廣泛，不利于區(qū)域農(nóng)業(yè)的發(fā)展［4］。由于蘋果的遺傳背景較為復(fù)雜，并且育種周期較長，通過傳統(tǒng)雜交方法很難獲得結(jié)合所有最佳品質(zhì)的品種［5］。因此，盡快探索挖掘蘋果脅迫基因，提高蘋果的抗逆性，確保其在惡劣環(huán)境下也能增產(chǎn)，對于加快我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義［6］。

脫落酸（ABA）作為植物激素，在植物生長發(fā)育的任何階段都有舉足輕重的地位，也與植物中干旱、鹽分和其他逆境脅迫反應(yīng)有關(guān)，因而被稱為逆境激素［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過基因工程提升ABA含量或加強ABA信號通路，可以提升植物對干旱、高濃度鹽等非生物脅迫的抵抗力［8］。2009年，利用基因篩選和酵母雙雜交的方法在擬南芥細胞中發(fā)現(xiàn)ABA受體PYR/PYL/RCAR（簡稱PYLs）［9-11］，其主要功能是辨別ABA信號和傳輸啟動信號［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，AtPYL9與擬南芥抗旱有關(guān)［13］，OsPYL9在水稻胚乳中特異性表達，提高了對ABA的敏感［14］。小麥TaPYL9對脫落酸敏感，可能參與了小麥對高鹽、干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控［15］。本研究對前期獲得的MdPYL9基因過量表達的蘋果GL-3組培苗進行抗鹽性研究，分析MdPYL9對蘋果抗鹽性的調(diào)控機制，以期為蘋果抗逆育種研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗于2022年4月2日至5月30日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)實驗室進行，試驗材料為繼代25d且生長良好、長勢均一致的MdPYL9基因過表達蘋果組培苗和非轉(zhuǎn)基因GL-3組培苗。

1.2試驗方法

1.2.1試驗處理選擇生長、長勢一致的組培苗，每瓶2株，每個處理接種12瓶，設(shè)置3次重復(fù)，分別接種于含有0、100、150mmol/LNaCl的繼代培養(yǎng)基中，于24℃光照培養(yǎng)。處理15d后觀察表型并拍照、收集葉片，用液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱中存儲待測。

1.2.2生理生化指標的測定用氮藍四唑（NBT）法［16］測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，用紫外吸收法［16］測定過氧化氫酶（CAT）活性，用愈創(chuàng)木酚法［16］測定過氧化物酶（POD）活性，用考馬斯亮藍G-250染色法［17］測定可溶性蛋白含量，用硫代巴比妥酸法［17］測定丙二醛（MDA）含量，用酸性茚三酮染色法［17］測定脯氨酸含量。相對電導(dǎo)率參考李銀峰的方法［18］測定。

1.2.3RNA提取和qRT-PCR表達的定量分析植物總RNA的提取使用聚合美RNA分離試劑盒（M5PlantRNeasyComplexMiniKit，北京，中國），按照說明書進行操作。測定反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA核酸樣品濃度后，用ddH2O將cDNA全部稀釋成200ng/μL。用LightCycler96熒光定量儀進行qRT-PCR分析，分析抗鹽相關(guān)基因MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1表達量的變化。本研究所用引物序列見表1。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與分析用Excel對數(shù)據(jù)進行處理，用IBMSPSSStatistics23.0進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析（ANOVA）方法進行Duncans多重比較檢驗，α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫下對照和轉(zhuǎn)基因組培苗表型的變化

如圖1-a所示，在0mmol/LNaCl處理下，轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗和對照植株生長情況基本一致。用100mmol/LNaCl處理15d后，轉(zhuǎn)基因組培苗和對照植株都出現(xiàn)鹽脅迫癥狀，但轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗葉片的褐斑數(shù)量比對照少。用150mmol/LNaCl處理15d后，轉(zhuǎn)基因組培苗癥狀較輕，對照植株的癥狀更加嚴重。隨著鹽處理濃度的增加，各株系的MDA含量均在100mmol/LNaCl處理下達到最高，在150mmol/LNaCl處理下有所下降，總體呈上升趨勢，但上升程度不同，0mmol/LNaCl處理轉(zhuǎn)基因植株與對照株系的MDA含量沒有顯著差異，但是在用100、150mmol/LNaCl處理后對照MDA含量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，并且差異顯著（圖1-b）。由圖1-c可以看出，隨著鹽濃度的增加，植株的相對電導(dǎo)率（REL）逐漸上升，并且不同處理間差異顯著。

2.2超氧陰離子（O-2·）含量、保護酶活性的變化

由圖2-a可以看出，用0mmol/LNaCl處理15d后，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的超氧陰離子含量無顯著差異，鹽脅迫處理后，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗中超氧陰離子含量均有不同程度的上升，在150mmol/LNaCl處理下含量達到最高，對照組培苗中超氧陰離子含量顯著高于轉(zhuǎn)基因組培苗。從圖2-b、圖2-c中可發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫15d后，在0mmol/LNaCl處理下，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的SOD、POD活性無顯著差異，100mmol/LNaCl處理組的SOD、POD活性最高，并且轉(zhuǎn)基因組培苗的SOD、POD活性顯著高于對照。由圖2-d可知，鹽脅迫15d后，對照、轉(zhuǎn)基因組培苗的CAT活性在100mmol/LNaCl處理下最高，在150mmol/LNaCl處理下，CAT活性有所下降，在0mmol/LNaCl處理下，轉(zhuǎn)基因組培苗的CAT活性顯著低于對照，但鹽脅迫處理后CAT活性顯著高于對照。

2.3滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

從圖3-a可以看出，用0mmol/LNaCl處理15d后，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的可溶性蛋白含量差異不顯著，但在100mmol/LNaCl鹽脅迫下，對照和轉(zhuǎn)基因幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量增加，轉(zhuǎn)基因組培苗的可溶蛋白含量顯著高于對照。在150mmol/LNaCl處理下，對照和轉(zhuǎn)基因幼苗的可溶性蛋白含量較0mmol/L處理也增加，但對照和處理組兩者之間沒有顯著差異。從圖3-b可以看出，處理15d后，0mmol/LNaCl處理的對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的脯氨酸含量無顯著差異，鹽脅迫處理后，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗中的脯氨酸含量均有不同程度的上升，在150mmol/LNaCl處理下最高，并且轉(zhuǎn)基因組培苗中

的脯氨酸含量顯著高于對照。

2.4蘋果抗鹽相關(guān)基因表達量的變化

由圖4-a至圖4-d可以看出，用150mmol/LNaCl處理15d后，MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1基因的相對表達量在各轉(zhuǎn)基因組培苗中顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)基因組培苗內(nèi)各基因的相對表達量顯著高于對照。

3討論與結(jié)論

鹽脅迫會抑制植物的生長和發(fā)育，改變植株形態(tài)、影響植株生理生化和代謝特征，對植物生長不利［19］。本研究結(jié)果表明，在0mmol/LNaCl處理下，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的表型差異不明顯，在鹽脅迫后都出現(xiàn)了受損害的現(xiàn)象。與100mmol/LNaCl處理相比，在150mmol/LNaCl處理后受傷害特征更加明顯。但是在相同脅迫時間內(nèi)，對照植株葉面褐斑和壞死現(xiàn)象比轉(zhuǎn)基因更多。細胞中的MDA含量反映了膜脂過氧化的程度，相對電導(dǎo)率反映了細胞膜的通透性。相對電導(dǎo)率和MDA含量的變化都會在一定程度上影響植物細胞膜的完整性及對不利脅迫的反應(yīng)損傷程度［6］。用100、150mmol/LNaCl處理后，植株中MDA含量和相對電導(dǎo)率顯著提高，表明MdPYL9基因過表達緩解了鹽脅迫下生物膜的受損傷程度。

鹽脅迫會使植物體內(nèi)活性氧含量增加，使植物體中細胞的結(jié)構(gòu)受到損害［20］。本研究中，在0mmol/LNaCl處理中對照和轉(zhuǎn)基因組培苗超氧陰離子含量沒有顯著性差異，鹽脅迫后都有不同程度上升，但對照植株中超氧陰離子含量更多，表明對照植株受到的氧化脅迫更加嚴重，轉(zhuǎn)基因在一定程度上緩解了由鹽脅迫引起的氧化脅迫。植物可以觸發(fā)抗氧化防御系統(tǒng)來清除過量的活性氧，并保護細胞不受到氧化脅迫［21］。有試驗表明，鹽脅迫下植物體內(nèi)的SOD、POD活性升高，高鹽害下植物體內(nèi)的SOD、POD活性反而降低［22］。本研究結(jié)果顯示，用100mmol/LNaCl處理后，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性都有所升高，但是轉(zhuǎn)基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性顯著高于對照株系。在150mmol/LNaCl處理下，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗中的SOD、POD、CAT活性都有所下降，轉(zhuǎn)基因組培苗中的SOD、CAT活性顯著高于對照，POD活性沒有顯著差異。酶活性在100mmol/LNaCl處理下最高，在150mmol/LNaCl處理下有所下降，可能由于植物在中、低鹽濃度條件下的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)為酶活性的升高，鹽濃度過高會對植物組織產(chǎn)生過強的迫害。

在鹽脅迫條件下，植物細胞中的蛋白質(zhì)合成代謝活性增強，使植物自身能夠合成更多的蛋白質(zhì)參與滲透壓調(diào)節(jié)，從而提高植物對鹽脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力［23-24］。閻艷霞等在對棗的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽處理后棗葉中可溶性蛋白含量隨著NaCl濃度的增加而增加［25］。八棱海棠可溶性蛋白含量隨鹽含量的增加表現(xiàn)為先上升后下降最后上升的趨勢［26］。在本試驗中，對照和轉(zhuǎn)基因組培苗的可溶性蛋白質(zhì)含量在0mmol/LNaCl處理下沒有顯著差異，鹽處理后表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。轉(zhuǎn)基因組培苗中的可溶性蛋白含量的增幅大于對照，說明轉(zhuǎn)基因組培苗具有更強的抑制細胞失水的能力，有較高的耐鹽能力。眾多研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)的脯氨酸含量均隨外界鹽濃度的增加而升高［27-29］。ZmHDZ10轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量的增加提高了其對干旱和鹽脅迫的耐受性［30］。在本試驗中，未添加NaCl處理的對照和轉(zhuǎn)基因組培苗中脯氨酸含量沒有顯著差異，鹽脅迫后脯氨酸含量上升，轉(zhuǎn)基因組培苗中的脯氨酸含量高于對照。研究結(jié)果表明，MdPYL9通過調(diào)節(jié)脯氨酸的積累來調(diào)節(jié)蘋果植株的耐鹽性。在本試驗中，通過分析從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可知，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性更強。前人研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會導(dǎo)致植物滲透調(diào)節(jié)失衡和產(chǎn)生離子毒害，擬南芥細胞膜上的SOS1轉(zhuǎn)運蛋白是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，NHX為液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，過表達該基因會增強植物的抗鹽性［31］。SOS2、SOS3能夠調(diào)控SOS1的表達，也能夠響應(yīng)鹽脅迫［32］。在150mmol/LNaCl處理下，轉(zhuǎn)基因組培苗中MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1基因的表達量顯著高于對照，因此推測MdPYL9可能參與了調(diào)控MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3和MdNHX1的表達來調(diào)節(jié)植物耐鹽性。以上研究結(jié)果表明，MdPYL9基因在提高蘋果植株的抗鹽性方面發(fā)揮著一定作用，過表達MdPYL9基因后蘋果植株對鹽脅迫的耐受性增強。

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