指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價馬鞭草質(zhì)量的方法學(xué)研究

王 諍,劉松照,劉叢彬,王國凱,3,謝冬梅,3,4*

(1.寧國市市場監(jiān)督管理局,安徽 寧國 242300;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護與開發(fā)研究所,安徽 合肥 230012)

馬鞭草(Verbenae Herba)為馬鞭草科(Verbenaceae)植物馬鞭草的干燥地上部分,始載于《名醫(yī)別錄》,原產(chǎn)于熱帶美洲[1],其味苦、性涼,具有活血散瘀、利水退黃、解毒、截瘧的功效[2-3]。馬鞭草中主要指標性成分包括環(huán)烯醚萜苷類的馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷以及苯丙素類的毛蕊花糖苷[4-6]。目前有關(guān)馬鞭草環(huán)烯醚萜苷類及苯丙素苷類成分含量測定的報道較少,難以全面控制并評價馬鞭草藥材的質(zhì)量。中藥指紋圖譜能夠較全面地反映中藥的質(zhì)量特性,近年來常被用于中藥的質(zhì)量評價[7]。本研究通過建立馬鞭草的指紋圖譜,結(jié)合主成分分析、聚類分析等方法對試驗數(shù)據(jù)進行處理,旨在為馬鞭草的質(zhì)量評價提供科學(xué)理論依據(jù)。同時由于多指標成分的含量測定中對照品的需求較高,本研究建立了馬鞭草中3種指標性成分的一測多評法[8],并與外標法進行比較,證明所建立的方法簡便、可靠,可節(jié)省大量對照品[9],提高檢測效率,現(xiàn)將研究過程報道如下。

1 儀器及材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀(LC-10ATVP泵,SPD-10AVP紫外檢測器,SIL-10ADVP自動進樣器,LC-Solution色譜工作站,日本島津),Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),十萬分之一電子天平AB135-S(瑞士梅特勒托利多)。

1.2 材料

甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水;馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對照品均由本實驗室自制,純度均達98%以上。不同來源的馬鞭草藥材16 批,見表1。

表1 馬鞭草樣品16批的產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷對照品7.16、11.62、15.47mg,置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻;取1mL對照品溶液置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1mL含0.071 6mg戟葉馬鞭草苷、0.116 2mg馬鞭草苷和0.154 7mg毛蕊花糖苷的對照品儲備液。

2.2 供試品溶液制備

取藥材粉碎過80目篩,取粉末約0.5g,精密稱定,加80%甲醇25mL,置具塞錐形瓶中,稱定重量,超聲(功率100W,頻率40kHz)提取30min,冷卻至室溫。80%甲醇補足重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),檢測波長為238nm,柱溫30℃;流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),體積流量1mL/min,進樣量10μL,洗脫程序見表2。在上述色譜條件下,戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷色譜峰分離效果較好,見圖1。

注:1.戟葉馬鞭草苷;2.馬鞭草苷;3.毛蕊花苷。

表2 梯度洗脫程序

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗 取S1號樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,連續(xù)進樣6次,以2號色譜峰(馬鞭草苷)的保留時間和峰面積作為參考,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,結(jié)果其RSD值均<1.5%,6次采集的指紋圖譜的相似度>0.98,表明該儀器和所用方法的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S1號樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測,以2號色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,并計算RSD值。結(jié)果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取S1號樣品6份,按上述方法制備6份供試品溶液,并按照“2.3”項下色譜條件測定,以2號色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積,并計算RSD值。結(jié)果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 特征指紋圖譜的建立 應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對16批馬鞭草藥材的色譜進行分析,色譜見圖2,相似度評價結(jié)果見表3。共確定11個共有峰,其中1號峰為戟葉馬鞭草苷、2號峰為馬鞭草苷、6號峰為毛蕊花苷。經(jīng)分析可知,11個共有峰保留時間的RSD均<1%,峰面積RSD值在18.33%～81.22%之間。結(jié)果顯示不同批次的馬鞭草化學(xué)成分種類相似,但部分成分的含量存在較大差異,見表4、表5。

圖2 馬鞭草16批的指紋圖譜

表3 相似度計算結(jié)果

表4 馬鞭草共有峰的保留時間 (min)

表5 馬鞭草共有峰的峰面積

2.4.5 特征指紋圖譜的結(jié)果分析 應(yīng)用SPSS 23.0分析軟件對16批馬鞭草進行主成分分析(表6、表7、圖3),以特征值>1為標準,選取前3個作為主成分,其方差累積貢獻率達到84.233%。第一主成分特征值及方差貢獻率均大于第二主成分,說明第一主成分包含信息最多。由旋轉(zhuǎn)前后因子載荷矩陣可知,1號色譜峰、2號色譜峰和6號色譜峰在第一成分中有明顯的正相負荷,表明戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花苷可作為馬鞭草的指標性成分,反映樣品特性。

圖3 樣品主成分三維得分

表6 旋轉(zhuǎn)前后的特征值及方差貢獻率

表7 因子載荷矩陣

將16批馬鞭草樣品特征圖譜中11個共有峰的峰面積經(jīng)均一化數(shù)據(jù)處理后作為變量,應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件,采用中位數(shù)聚類法,區(qū)間選取平方Euclidean距離,進行聚類分析(圖4)。當(dāng)類間距為10時,16批藥材可分為兩大類,S3、S8、S9和S10分為一類,其余分為一類,與相似度評價結(jié)果較為一致。

圖4 聚類分析結(jié)果

2.5 指標性成分含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察 配制一系列含有戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的混合對照品溶液,按“2.3”項下條件進樣測定,以進樣濃度和峰面積分別為橫、縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線:Y=1.0×106X+925.81,r=0.999 8;Y=1.0×106X+18 654,r=0.999 6;Y=956 465X+28 464,r=0.999 5。結(jié)果表明,戟葉馬鞭草苷在0.143～3.580μg、馬鞭草苷在0.232～5.810μg、毛蕊花糖苷在0.309～7.735μg范圍內(nèi)的進樣量,與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.2 方法學(xué)考察 精密度試驗。取“2.2”項下供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定,連續(xù)進樣6次,測得峰面積,并計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,3種成分的RSD值分別為1.03%、1.23%和1.16%,表明所用方法的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗。取“2.2”項下供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測,測得峰面積,并計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.00%、0.63%和1.11%,表明所用方法的穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗。取藥材(S3)粉末約0.5g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液6份,并按“2.3”項下色譜條件測定峰面積,計算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.70%、1.12%和1.71%,表明所用方法的重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗。稱取同一藥材(S11)粉末6份,每份約0.1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入戟葉馬鞭草苷(0.628mg/mL)、馬鞭草苷(0.828mg/mL)及毛蕊花糖苷(0.518mg/mL)3種對照品溶液1mL,按“2.3”項下色譜條件測定峰面積,計算樣品中戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和測定量,3種指標性成分平均回收率分別為97.83%、98.67%和97.76%,其RSD值分別為0.89%、0.87%和1.18%,見表8。

表8 3種指標性成分的加樣回收率 (n=6)

2.5.3 含量測定 取藥材粉末0.5g,精密稱定,依照“2.2”項下方法制備供試品溶液并測定,按外標法計算樣品中各成分的含量,結(jié)果見表9。

表9 指標性成分含量測定結(jié)果 (%)

不同批次馬鞭草藥材中戟葉馬鞭草苷含量在0.32%～0.63%,馬鞭草苷含量在0.25%～1.89%,毛蕊花糖苷含量在0.26%～2.40%。研究結(jié)果表明,不同產(chǎn)地不同批次馬鞭草藥材中各成分含量差異明顯。

2.6 一測多評法測定藥材中3種指標性成分的含量

2.6.1 相對校正因子的計算 在線性范圍內(nèi),各成分的量與峰面積成正比關(guān)系,即W=fA,相對校正因子f(k/m)=fk/fm=(Wm×Ak)/(Wk×Am),其中Ak為內(nèi)參物峰面積,Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度,Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的質(zhì)量或濃度。以馬鞭草苷為內(nèi)參物,測定結(jié)果計算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.11,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.46,RSD分別為0.88%、2.68%,見表10。

表10 3種成分的相對校正因子

2.6.2 相對校正因子重復(fù)性考察 精密吸取混合對照品溶液2、4、10、20、50μL,在確定的色譜條件下進樣測定,計算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.15,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.44,RSD分別為2.69%、1.10%,結(jié)果顯示,各成分的f值重復(fù)性良好。

2.6.3 不同色譜儀和色譜柱考察 取對照品溶液,選擇Shimadzu LC-10A型和Agilent 1200型高效液相色譜儀,選定色譜柱Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)、Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm)進行色譜分析,計算f值。結(jié)果表明,不同高效液相和色譜柱對馬鞭草3種指標性成分f值的影響無明顯差異,見表11。

表11 儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.4 不同流速考察 同等色譜條件下,分別設(shè)定流速為0.8、0.9、1.0mL/min,取混合對照品溶液進樣測定,計算f值,RSD分別為0.53%、0.40%。表明流速對各成分f值的影響無明顯差異。

2.6.5 不同柱溫考察 在同等色譜條件下,分別設(shè)定柱溫為25、30、35℃,取混合對照品溶液進樣測定并計算f值,結(jié)果RSD為0.92%、0.40%。表明柱溫對各成分f值的影響無明顯差異。

2.6.6 待測成分色譜峰定位標準 以馬鞭草苷為內(nèi)參物,定位標準設(shè)置為保留時間差和相對保留值。由表10、表11 結(jié)果可知,保留時間差波動較大,RSD>2%。相對保留值波動較小,RSD均<2%,無明顯差異。因此,選擇相對保留值作為最終定位標準,見表12。

表12 相對保留值考察結(jié)果

2.7 一測多評法與外標法的比較

取藥材粉末0.5g,制備供試品溶液進行測定,分別采用外標法和一測多評法計算各成分的含量。

由實驗結(jié)果可知,戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對馬鞭草苷的保留時間相對校正因子平均值分別為0.75、0.80。因此戟葉馬鞭草苷保留時間T1=0.75×ts,毛蕊花糖苷保留時間T2=0.80×ts,其中ts為馬鞭草苷的保留時間。戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對馬鞭草苷的相對校正因子為1.11和1.22。根據(jù)研究結(jié)果得出含量計算公式:

戟葉馬鞭草苷:lgCi=1.11×(lgCs×lgAi)/lgAs

毛蕊花糖苷:lgCi=1.22×(lgCs×lgAii)/lgAs

其中As為內(nèi)標物馬鞭草苷的峰面積,Cs為內(nèi)標物馬鞭草苷的濃度,Ai和Aii分別為戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷的實測峰面積。測定結(jié)果見表13。

表13 外標法和一測多評法測定3種指標性成分的含量 (%)

3 討論

建立馬鞭草指紋圖譜與主成分分析、聚類分析相結(jié)合的方法,可合理評價該藥材質(zhì)量,為建立科學(xué)的馬鞭草藥材質(zhì)量控制方法提供依據(jù)[10]。

一測多評法可作為中藥飲片、配方顆粒、中成藥等中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段[11]。本研究首次將一測多評法應(yīng)用于馬鞭草藥材的質(zhì)量評價體系中,具有快速、簡便、低成本等優(yōu)點,可有效應(yīng)對大量分離純化難度較高的化學(xué)對照品稀缺以及價格昂貴的局面,并提高檢測效率,對馬鞭草藥材的評價標準的完善具有重大意義,也將進一步推動一測多評法在藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

本研究通過建立馬鞭草指紋圖譜,同時運用一測多評法對16批馬鞭草中3種指標性成分進行含量測定,不同批次間戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷的含量差異不大。兩種方法測定結(jié)果無明顯差異,相對校正因子重復(fù)性良好。通過馬鞭草苷可實現(xiàn)對其余兩種指標性成分的定量分析,方法簡單準確,并且能節(jié)省大量對照品,經(jīng)濟實用,具有一定的推廣價值。