石菖蒲單體ɑ-細(xì)辛醚對(duì)耐藥性癲癇大鼠的作用機(jī)制研究

馮 茜,董 波,吳樹宏,韋小鳳,唐秋燕,楊慧中,楊旭紅

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075;2.成都市第七中學(xué),四川 成都 610021;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072)

癲癇(Epilepsy ,EP)是一種多種病因引起的慢性腦部疾病,主要特點(diǎn)是大腦神經(jīng)元反復(fù)、過(guò)度地同步化放電并導(dǎo)致發(fā)作性、突然性、短暫性的腦功能紊亂,表現(xiàn)為臨床各型EP發(fā)作,伴有腦電圖癇性波及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常改變[1]。其致殘率高、病程長(zhǎng),因此成為當(dāng)前世界范圍的醫(yī)療難題及社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,全世界約有7 000萬(wàn)EP患者[2]。目前我國(guó)EP總患病率為7‰,且每年以40萬(wàn)人次的速度增加[3]。盡管目前的抗癲癇藥物(Anti epileptic drugs,AEDs)如苯巴比妥(Pentobarbital,PB)、卡馬西平(Carbamazepine ,CBZ)、左乙拉西坦(Levetiracetam, LEV)等具有較好的抗癇作用,但長(zhǎng)期服用可產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肝腎功能損害、血小板降低等副作用[4]。此外,仍有約30%的患者對(duì)AEDs反映不佳,被歸類為耐藥性癲癇(Drug-resistant epilepsy, DRE)[5]。DRE的主要特征是EP患者對(duì)AEDs產(chǎn)生不同程度的耐藥性[6]。因此,仍需更多研究進(jìn)一步探索副作用小、療效更加穩(wěn)定的抗癲癇藥物。

中醫(yī)藥治療EP療效顯著、毒副作用小,在臨床中廣泛使用[7]。中醫(yī)中雖無(wú)與DRE相對(duì)應(yīng)的病名,但從病機(jī)分析可將其歸于“癇病”范疇,《醫(yī)學(xué)綱目·癲癇》曰:“癲癇者,痰邪逆上也”,《丹溪心法·癇》云:“無(wú)非痰涎壅塞,迷悶孔竅”。本病主要病機(jī)是元神失控,清竅蒙蔽,因此,DRE的治療以醒腦開竅,豁痰定癇[8]為主。石菖蒲性溫,主歸心經(jīng)和胃經(jīng),具有開竅豁痰、醒神益智的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),石菖蒲提取液、醇提物、揮發(fā)油、除去揮發(fā)油的水提取液可減少驚厥次數(shù),縮短持續(xù)時(shí)間,降低死亡率,總揮發(fā)油為其鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥的主要部位[8]。α-細(xì)辛醚作為石菖蒲的主要活性成分之一,是石菖蒲發(fā)揮醒腦開竅和鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用的主要活性成分[9],具有穿透血腦屏障的能力,對(duì)谷氨酸能神經(jīng)傳遞有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10]。能抑制 NF-κB 信號(hào)通路,減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,降低促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生[11-14],能明顯下調(diào)模型大鼠海馬與皮層中P-gp與Mdr1a1mRNA的表達(dá),扭轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的癲癇耐藥性[15],而且在臨床上得到了廣泛應(yīng)用[16]。這表明ɑ-細(xì)辛醚對(duì)于治療DRE具有明顯潛力。

然而,ɑ-細(xì)辛醚對(duì)于DRE的抗癇作用機(jī)制尚缺乏相關(guān)研究,本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)石菖蒲能通過(guò)下調(diào)PTZ癲癇模型大鼠海馬炎癥因子的表達(dá)修復(fù)血腦屏障,從而減輕癲癇發(fā)作[17]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ɑ-細(xì)辛醚能延長(zhǎng)DRE大鼠發(fā)作潛伏期,降低發(fā)作級(jí)別,縮短發(fā)作持續(xù)時(shí)間。因此,為進(jìn)一步明確ɑ-細(xì)辛醚對(duì)DRE的抗癇效果及可能存在的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠腹腔注射PTZ后灌胃CBZ建立DRE模型,擬通過(guò)觀察ɑ-細(xì)辛醚對(duì)DRE大鼠海馬內(nèi)炎性因子的表達(dá)情況,對(duì)血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)調(diào)控作用及多藥耐藥基因的調(diào)控,揭示ɑ-細(xì)辛醚治療DRE的部分作用機(jī)制,以期為ɑ-細(xì)辛醚在臨床上治療耐藥性癲癇提供理論依據(jù)和進(jìn)一步研究提供支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)

60只SD大鼠,SPF級(jí),雄性,6～8周,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自成都恩斯維爾生物科技有限公司(批號(hào):SCXK川2019-028),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證(SYXK川2020-225),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食,室溫20～22℃,相對(duì)濕度40%～45%,明暗交替12h,符合中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 藥物及試劑

卡馬西平片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號(hào):200911)、戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑廠,批號(hào):20111123)、戊四氮(上海一基實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):P312752);ɑ-細(xì)辛醚(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):Z30M9N57243,純度:99.9%);蛋白酶和磷酸化酶抑制劑混合物(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P1050)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0010)、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0013B)、PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):ST506)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)抗體(英國(guó)abcam,貨號(hào):ab179695)、磷酸化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2(phospho-Smad2,P-smad2)抗體(英國(guó)abcam,貨號(hào):ab188334)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1beta,IL-1β)試劑盒(上海酶聯(lián),貨號(hào)ml037361-J)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(上海酶聯(lián),貨號(hào)ml037361-J)、多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-P糖蛋白(P-glycoprptein, P-gp)試劑盒(上海酶聯(lián),貨號(hào)ml654884-J)、812環(huán)氧樹脂包埋套裝(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,貨號(hào) GP18010)、醋酸雙氧鈾(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,貨號(hào)GS02624);檸檬酸鉛染液(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,貨號(hào) GZ02616,);四氧化鋨(德國(guó)徠卡,貨號(hào) GP18456)。

1.3 儀器

DW-2000腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)、RM6240C型多道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)、JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡(日本電子JEOL)、EMTP徠卡組織處理機(jī)(德國(guó)徠卡)、EM KMR3玻璃制刀機(jī)(德國(guó)徠卡)、EM UC7超薄切片機(jī)(德國(guó)徠卡)、G50組織研磨器(卡尤迪生物科技宜興有限公司)、SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、H1850R冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、K30干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、MULTISKAN GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific,美國(guó))、MINI-P4/MT-BLOT MOD/PP BAS垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BIO-RAD,美國(guó))、Champ Chemi 610全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

2 方法

2.1 造模方法

60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后,按照隨機(jī)數(shù)表法選取50只大鼠隔日1次腹腔注射亞劑量PTZ 40mg·kg-1[18-19],按照Racine[20]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行分級(jí):Ⅰ級(jí),濕狗樣顫動(dòng),面部肌肉痙攣及抽動(dòng)(包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性咀嚼等);Ⅱ級(jí),Ⅰ級(jí)基礎(chǔ)上加頸部肌肉痙攣(如節(jié)律性點(diǎn)頭);Ⅲ級(jí),Ⅱ級(jí)基礎(chǔ)上加前肢痙攣; Ⅳ級(jí),站立并伴有雙側(cè)前肢痙攣; Ⅴ級(jí),Ⅳ級(jí)基礎(chǔ)上加身體向后倒下、失去平衡、四肢抽動(dòng)、持續(xù)站立、傾倒。其中,大鼠若出現(xiàn)持續(xù)Ⅴ級(jí)EP發(fā)作,給予2%戊巴比妥鈉0.5mL緩解發(fā)作,連續(xù)3次或3次以上到V級(jí)發(fā)作即被認(rèn)定為達(dá)到EP點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn),腹腔注射PTZ 15次,共造模30d。耐藥性篩選參考國(guó)外報(bào)道[21]并結(jié)合本課題研究需要進(jìn)行改良,對(duì)一種抗癲癇藥無(wú)效的患者可能即是DRE,即對(duì)PB 耐藥的患者對(duì)苯妥英鈉(Phentoin,PHT)及 CBZ 也耐藥,PB、PHT 或 CBZ 是作用機(jī)制完全不同的一線抗癲癇藥,提示耐藥性可延伸到其他不同作用機(jī)制的藥物[22],故本實(shí)驗(yàn)采CBZ對(duì)PTZ點(diǎn)燃模型進(jìn)行耐藥性篩選。采用CBZ 0.125g·kg-1灌胃,灌胃后1h腹腔注射PTZ進(jìn)行耐藥性篩選,連續(xù)出現(xiàn)3次V級(jí)發(fā)作被認(rèn)定為DRE大鼠模型,耐藥性篩選試驗(yàn)持續(xù)7d。造模過(guò)程中有19只大鼠因驚厥過(guò)度死亡,有3只大鼠未達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn),棄用。

2.2 分組及干預(yù)

造模成功后,SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為3組:模型組(10只)、ɑ-細(xì)辛醚(50mg/kg)高劑量組(9只)、ɑ-細(xì)辛醚(25mg/kg)低劑量組(9只),另取10只SD大鼠為正常組。為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)一致,正常組、模型組各棄用一只大鼠。實(shí)驗(yàn)中模型動(dòng)物對(duì)AEDs耐受,故受試藥物不采用西藥對(duì)照組?？瞻捉M和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,ɑ-細(xì)辛醚高劑量和ɑ-細(xì)辛醚低劑量組給予ɑ-細(xì)辛醚溶液灌胃,每日1次,連續(xù)給藥3周。在給受試藥期間每7d給予PTZ維持點(diǎn)燃。3周后處死大鼠。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 各組大鼠腦電圖測(cè)量[23]造模后7d,每組隨機(jī)選取4只大鼠進(jìn)行腦電圖測(cè)量,以2%戊巴比妥45mg·kg-1麻醉后,固定于腦立體定位儀上,備皮,消毒頭皮,按《大鼠腦立體定位圖譜》定位。植入電極:記錄電極(海馬CA1區(qū)):后囟門(3.3～3.7mm),旁側(cè)(2.5mm),硬膜下(3.0～3.5mm);參考電極:前囟門4.0mm,旁側(cè)2.0mm;頸部肌肉作為接地電極,縫合固定。將記錄電極、參考電極和接地線連接到小型三針插頭上,牙科水及牙科水泥固定。腹腔注射PTZ后,使用鱷魚夾將電極連接到RM6240C多通道生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng),記錄皮層腦電圖,走紙速度為30mm/s,濾波器為35Hz,增益為10μV/mm,時(shí)間常數(shù)為0.1s,使用每組腦電圖的描記,每只大鼠腦電記錄時(shí)間為30min。

2.3.2 樣本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以2%戊巴比妥45mg·kg-1麻醉后解剖,通過(guò)下腔靜脈快速灌注生理鹽水,待灌洗液清澈后,開顱取出大腦,取大鼠雙側(cè)海馬組織,置于-80℃冷凍管中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3透視電鏡觀察各組大鼠海馬組織BBB改變[24]大鼠海馬用3%戊二醛預(yù)固定,1%四氧化鋨再固定,丙酮逐級(jí)脫水,Ep812包埋超薄切片,乙酸鈾和檸檬酸鉛染色,JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡觀察。

2.3.4 Elisa檢測(cè)各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、P-gp蛋白表達(dá)情況[25]取出保存在-80℃的海馬組織樣品,在4℃的冰箱中解凍。嚴(yán)格按照TNF-α、IL-1β、P-gp Elisa試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.3.5 WB檢測(cè)各組大鼠海馬組織中TGF-β1、P-samd2蛋白表達(dá)情況[26]取100mg大鼠海馬組織,加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的RIPA混合裂解液,冰上勻漿,4℃裂解1h后離心(12 000r/min,5min),收集上清液;BCA法測(cè)定總蛋白濃度;每孔以20μg蛋白上樣,100V電泳,100V濕轉(zhuǎn);5%脫脂牛奶封閉2h,加入TGF-β1、P-samd2一抗(1∶1 000)在4℃下孵育過(guò)夜;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1h;ECL顯影,用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)捕捉圖像。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦電圖檢測(cè)及癲癇發(fā)作情況

正常組腦電圖無(wú)尖峰波和棘波出現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠腦電圖出現(xiàn)典型癲癇波,以尖峰波和棘波為主,波幅明顯上升,且EP發(fā)作潛伏期短(P<0.05);與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚配伍高劑量組與ɑ-細(xì)辛醚低劑量組腦電圖波幅明顯降低,潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05);ɑ-細(xì)辛醚配伍高劑量組與ɑ-細(xì)辛醚低劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1,圖2,表1。

注:A:正常組;B:模型組;C:ɑ-細(xì)辛醚高劑量組;D:ɑ-細(xì)辛醚低劑量組。

注:A:Ⅱ級(jí):面陣攣伴節(jié)律性點(diǎn)頭;B級(jí):Ⅲ級(jí):面陣攣伴前肢陣攣;C:Ⅳ級(jí):前肢陣攣、后肢站立;D:Ⅴ級(jí):全身緊張伴跌倒發(fā)作。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作總時(shí)間和發(fā)作等級(jí)比較

3.2 透視電鏡觀察各組大鼠海馬組織BBB變化

正常組大鼠BBB結(jié)構(gòu)完整清晰,可見神經(jīng)細(xì)胞,神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓,核仁、細(xì)胞膜清楚,BBB微血管內(nèi)皮細(xì)胞層、基底層結(jié)構(gòu)正常;與正常組相比,模型組大鼠BBB微血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體腫脹,其嵴有斷裂、溶解;血管腔內(nèi)有紅血球堵塞,血管周隙增寬,細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白成分松散、丟失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體腫脹,部分溶解;與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組與ɑ-細(xì)辛醚低劑量組BBB微血管內(nèi)皮細(xì)胞中各細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常,僅見少量線粒體有輕度腫脹,血管內(nèi)皮細(xì)胞間見完整的緊密連接結(jié)構(gòu),血管周隙輕度增寬。詳見圖3。

注:A:正常組;B:模型組;C:ɑ-細(xì)辛醚高劑量組;D:ɑ-細(xì)辛醚低劑量組。

3.3 Elisa檢測(cè)各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)比較

與正常組相比,模型組TNF-α、IL-1β蛋白標(biāo)示量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組、ɑ-細(xì)辛醚低劑量組TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著降低(P<0.05),ɑ-細(xì)辛醚高劑量組較ɑ-細(xì)辛醚低劑量組TNF-α、IL-1β表達(dá)稍有下降(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05,nsP>0.05)。詳見圖4。

注:模型組與正常組相比,P<0.05;ɑ-細(xì)辛醚高劑量組、ɑ-細(xì)辛醚低劑量組與模型組相比P<0.05;ɑ-細(xì)辛醚高劑量組與ɑ-細(xì)辛醚低劑量組相比,P>0.05。

細(xì)胞核(Nucleus,N);線粒體(Mitochondria,Mi);粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Rough Endoplasmic Reticulum,RER)。

3.4 WB檢測(cè)各組大鼠海馬組織TGF-β1、P-smad2蛋白表達(dá)比較

與正常組相比,模型組TGF-β1、P-smad2蛋白標(biāo)示量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組、ɑ-細(xì)辛醚低劑量組TGF-β1、P-smad2表達(dá)顯著降低(P<0.05),ɑ-細(xì)辛醚高劑量組較ɑ-細(xì)辛醚低劑量組TGF-β1、P-smad2表達(dá)稍有下降(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖5、表2。

圖5 WB檢測(cè)各組大鼠海馬組織TGF-β1、P-smad2蛋白表達(dá)水平

表2 WB檢測(cè)各組大鼠海馬組織TGF-β1、P-smad2蛋白表達(dá)比較

3.5 Elisa檢測(cè)各組大鼠海馬組織P-gp蛋白表達(dá)結(jié)果

與正常組相比,模型組P-gp蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組、ɑ-細(xì)辛醚低劑量組P-gp表達(dá)顯著降低(P<0.05),ɑ-細(xì)辛醚高劑量組較ɑ-細(xì)辛醚低劑量組P-gp表達(dá)稍有下降(P>0.05),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 Elisa檢測(cè)各組大鼠海馬組織P-gp蛋白表達(dá)比較

4 討論

目前二線AEDs僅可使40%左右DRE患者癲癇發(fā)作減少50%,使10%～15%DRE患者停止發(fā)作,仍有大量DRE患者不能得到有效控制[27-28]。中醫(yī)藥治療DRE歷史悠久,療效確切。DRE屬中醫(yī)“癇癥”范疇,風(fēng)、火、痰、瘀是疾病發(fā)作的直接病理因素?！度驑O一病證方論·癲癇敘論》曰:“夫癲癇病,皆由驚動(dòng),使臟氣不平,郁而生痰,閉塞諸經(jīng)”;《幼科釋謎·癇痙》曰:“然諸癇證,莫不有痰”;《壽世保元·癇證》曰:“風(fēng)痰上涌而癇作矣”。本病主要病機(jī)是臟氣不平,陰陽(yáng)偏勝,神機(jī)受累,元神失控,清竅蒙蔽,氣機(jī)失常,津液凝結(jié)成痰,痰氣膠著,上蒙清竅,反復(fù)出現(xiàn)意識(shí)昏蒙、抽搐等癥狀。中藥石菖蒲清香馨遠(yuǎn),芳香稟冽,入心透腦,是歸經(jīng)入腦的重要藥物?！侗静菥V目》曰:“治中惡卒死,客忤癲癇”,其辛香行氣,苦溫通絡(luò),化痰行瘀,集開竅豁痰、理氣活血、散風(fēng)祛濕于一體。ɑ-細(xì)辛醚具有廣譜抗癲癇作用,能改善小鼠電驚厥、戊四氮引起的驚厥大發(fā)作和氯化鋰-匹羅卡品引起的癲癇持續(xù)狀態(tài),對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)活性增高,谷氨酸脫羧酶 67(GAD67)及 GABAA 受體的表達(dá)降低的過(guò)程有抑制作用,可明顯降低海馬CA1、CA3 區(qū)神經(jīng)元 N-甲基-D-天冬氨酸受體l(NMDARl)的表達(dá)水平、細(xì)胞表面 NMDAR密度,從而抑制 NMDARl的活性及NMDA引起的興奮性神經(jīng)毒性介導(dǎo)的癲癇過(guò)程。ɑ-細(xì)辛醚同時(shí)也具有神經(jīng)保護(hù)作用,用于預(yù)防和治療包括TLE在內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥疾病[29]。

ɑ-細(xì)辛醚作為抗癲癇藥物在我國(guó)臨床上也得到了廣泛應(yīng)用[30],但目前關(guān)于其對(duì)DRE治療的藥理學(xué)研究及相關(guān)機(jī)制研究相對(duì)缺乏,原因與目前對(duì)DRE動(dòng)物模型制備報(bào)道較少有關(guān),制備與人類疾病相似的動(dòng)物模型對(duì)研究DRE發(fā)病機(jī)制及開發(fā)治療藥物具有重要意義。PTZ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑,通過(guò)阻斷γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)傳遞致癇[31],可使致癇動(dòng)物產(chǎn)生和人類極相似的行為及神經(jīng)病理學(xué)改變。PTZ無(wú)神經(jīng)毒性,致癇過(guò)程不伴有神經(jīng)元壞死, 若致癇動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)元損傷,可明確判斷是EP發(fā)作本身所致[32]。EP發(fā)作后腦內(nèi),活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎因子可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[33]。因此通過(guò)PTZ腹腔注射建立的化學(xué)點(diǎn)燃EP動(dòng)物模型,可使致癇動(dòng)物出現(xiàn)癇性發(fā)作誘導(dǎo)和上調(diào)炎癥介質(zhì)表達(dá),進(jìn)而提高腦部興奮性和發(fā)生神經(jīng)元變性。PTZ腹腔注射是一種建立EP化學(xué)點(diǎn)燃模型的較理想方式。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道對(duì)EP點(diǎn)燃大鼠采用CBZ進(jìn)行篩選后再用丙戊酸鈉(Sodium Valproate, SV)篩選,建立DRE模型[34]。本研究根據(jù)DRE臨床特征[35],患者對(duì)AEDs耐藥性可延伸到其他不同作用機(jī)制的藥物,即對(duì)一種抗癲癇藥無(wú)效的患者即是DRE,本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典抗癲癇藥物CBZ進(jìn)行耐藥性篩選,結(jié)果顯示EP點(diǎn)燃大鼠發(fā)作情況能反應(yīng) DRE特點(diǎn),可應(yīng)用于DRE的深入研究。

DRE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜, 研究證明DRE與炎癥密切相關(guān),炎癥過(guò)程參與DRE發(fā)作與復(fù)發(fā)[36]。DRE發(fā)作時(shí)可誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng),包括激活小膠質(zhì)細(xì)胞[37]和星形膠質(zhì)細(xì)胞[38-41]產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。IL-1β 是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,IL-1β 可由小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生。IL-1β 與白細(xì)胞介素1受體I型(Interleukin-1 receptor type 1, IL-1R1)結(jié)合可刺激免疫細(xì)胞活化,改變 GABA 能和谷氨酸能神經(jīng)傳遞,增加神經(jīng)元興奮性并誘導(dǎo)神經(jīng)毒性分子的產(chǎn)生[42]。TNF-α 是全身炎癥后EP易感性的重要介質(zhì)[43]。在大腦中,TNF-α 由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放,通過(guò)上調(diào)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor, AMPA),觸發(fā)Ca2+依賴的谷氨酸釋放,增強(qiáng)海馬興奮性突觸活動(dòng)并維持其興奮性。DRE發(fā)作之后,IL-1β、TNF-α及黏附分子等均呈現(xiàn)不同程度高表達(dá),炎癥因子不斷蓄積引起內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用從而破壞BBB完整性, 導(dǎo)致BBB維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)功能受損[44]。BBB破壞使腦組織暴露于免疫系統(tǒng)中,血清白蛋白外滲進(jìn)入腦組織,白蛋白在BBB損壞時(shí)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境后,與TGF-β1受體結(jié)合,誘導(dǎo)P-smad2蛋白激活,TGF-β1/P-smad2通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能,改變星形膠質(zhì)細(xì)胞鉀離子空間緩沖和重新攝取谷氨酸的能力,引起 N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)的GluN 2B亞基和上調(diào)突觸后細(xì)胞上的NMDA受體,放大大腦興奮性損傷反應(yīng),導(dǎo)致癲癇逐級(jí)發(fā)生至最高峰[45]。BBB作為血-腦間重要屏障系統(tǒng),嚴(yán)格限制血液與腦組織物質(zhì)交換,一方面允許腦組織所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入屏障,另一方面限制有損腦組織物質(zhì)進(jìn)入屏障,以維持神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)定。BBB內(nèi)皮細(xì)胞中存在大量ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可有效阻止外源性毒素入侵,排出內(nèi)源性有毒物質(zhì),維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[46]。其中P-gp是最主要的多藥耐藥蛋白,當(dāng)炎癥等因素導(dǎo)致BBB損傷時(shí),BBB及腦組織中P-gp異常升高,對(duì)AEDs跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),主動(dòng)將AEDs逆濃度梯度外排出腦組織,降低腦組織中藥物濃度,從而產(chǎn)生耐藥,這也是DRE多藥耐藥的重要分子生物學(xué)機(jī)制[47]。由此可見,DRE與腦內(nèi)炎癥因子水平升高后BBB破壞,中樞神經(jīng)穩(wěn)態(tài)失衡,腦組織內(nèi)多藥耐藥蛋白高表達(dá)致AEDs外排密切相關(guān)。

DRE發(fā)生后腦內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-1β、TGF-β1、P-smad2等呈現(xiàn)不同程度高表達(dá)[45],腦組織內(nèi)P-gp也呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)[48]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、P-smad2表達(dá)水平顯著升高,證實(shí)了炎性因子參與DRE發(fā)作過(guò)程。DRE急性發(fā)作時(shí),BBB破壞,線粒體損傷,血管周隙增寬,白蛋白及白細(xì)胞進(jìn)入大腦,提示DRE與BBB受損有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)BBB透視電鏡顯示,模型組線粒體損傷,血管周隙增寬,BBB開放,這進(jìn)一步說(shuō)明BBB的破壞參與DRE發(fā)生。與正常組相比,模型組大鼠海馬組織中P-gp表達(dá)水平顯著升高,證實(shí)了DRE大鼠模型對(duì)AEDs的外排。本課題組認(rèn)為,ɑ-細(xì)辛醚能促進(jìn)BBB 通透性增加,減少 BBB 緊密連接結(jié)構(gòu),具有下調(diào)炎性表達(dá),保護(hù)BBB,促進(jìn)BBB生理性開放,增加通透性,阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑,同時(shí)具有抑制腦內(nèi)P-gp 表達(dá)的作用,通過(guò)對(duì) P-gp 表達(dá)抑制使治療藥物進(jìn)入腦組織。使進(jìn)入BBB 的藥物被排除概率減小,使良藥透過(guò)BBB進(jìn)入腦組織,實(shí)現(xiàn)腦部靶向治療。在本實(shí)驗(yàn)研究中,與模型組相比,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組、ɑ-細(xì)辛醚低劑量組大鼠發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)、發(fā)作級(jí)別降低,持續(xù)時(shí)間明顯縮短。研究證實(shí)ɑ-細(xì)辛醚對(duì)DRE有確切治療效果。

綜上所述,ɑ-細(xì)辛醚能有效控制DRE,實(shí)現(xiàn)腦部靶向治療。這意味著在臨床上可以通過(guò)這種方式使因長(zhǎng)期癇性發(fā)作或長(zhǎng)期服藥導(dǎo)致BBB異?；颊叩玫礁行е委?且在保證療效同時(shí)減少全身用藥量,降低藥物毒副作用。ɑ-細(xì)辛醚可打開BBB,且不破壞BBB功能,僅選擇性讓藥達(dá)病所,增加病灶局部血藥濃度;同時(shí)調(diào)節(jié)多藥耐藥蛋白及炎性反應(yīng),產(chǎn)生治療DRE的作用。值得注意的是,本次實(shí)驗(yàn)中,ɑ-細(xì)辛醚高劑量組與ɑ-細(xì)辛醚低劑量組在改善DRE大鼠癲癇發(fā)作情況、保護(hù)BBB受損及相關(guān)炎性因子及多藥耐藥蛋白調(diào)控上無(wú)明顯差異, 其可能原因與藥物在大鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程以及藥物在腦組織內(nèi)的含量水平有關(guān),本次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行進(jìn)一步探討,且由于作用機(jī)制相對(duì)復(fù)雜,ɑ-細(xì)辛醚抗DRE的靶點(diǎn)及通路尚不詳細(xì),還待進(jìn)一步研究。