基于PKC/ERK 通路探討敗醬總黃酮對缺氧缺血性腦病新生大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

扎西吉，張赟，馬鳳美，王正嶺

青海省婦女兒童醫(yī)院新生兒科，青海 西寧 810000

圍產(chǎn)期窒息是新生兒科的一個重大問題，會影響胎兒的發(fā)育和成長，嚴(yán)重時可導(dǎo)致胎兒缺氧、窒息甚至死亡［1］。缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是臨床嬰幼兒圍產(chǎn)期窒息引起的一種相對常見的惡性并發(fā)癥，是導(dǎo)致新生兒死亡、神經(jīng)系統(tǒng)損傷及腦發(fā)育滯后的主要原因［2］。缺氧缺血可導(dǎo)致ATP耗竭、神經(jīng)元氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡［3-4］。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路在大腦神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起著重要作用，與神經(jīng)發(fā)育障礙和圍產(chǎn)期學(xué)習(xí)、記憶障礙有關(guān)［5］。據(jù)報道，激活PKC/ERK 信號通路可改善小鼠腦出血后的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡［6］。敗醬草作為具有清熱解毒、活血化瘀作用的中藥在中國已有數(shù)千年的歷史，有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌等藥理活性［7］。敗醬總黃酮是敗醬草的主要活性成分，在修復(fù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)方面作用顯著，可減少腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡［8-10］。然而，敗醬總黃酮能否改善HIE 引起的神經(jīng)元凋亡還未見相關(guān)報道。因此，本研究旨在探討敗醬總黃酮對HIE新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以期為HIE的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

10只SD孕鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0004，每只可產(chǎn)仔10～12 只。單獨(dú)飼養(yǎng)在無菌的鼠籠中，保持溫度22～24 ℃、濕度45%～50%，12 h 明暗周期，可自由進(jìn)食和飲水。取出生10 d 的SD 大鼠幼崽90 只（體重14～20 g）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)青海省婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會批準(zhǔn)（IACUC：20200413002）。

敗醬草總黃酮（含量51.76%，批號ZL20150513，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；白屈菜紅堿（PKC 抑制劑，純度98.56%，HY-12048，Med Chem Express 公司，美國）；羅氏原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色試劑盒（紅色熒光）（11684817910，Roche Diagnostics 公司，美國）；RIPA 裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號分別為P0013B、P0012S、C00038、C1062S，上海碧云天生物科技公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（微板法，A020-2-2，南京建成生物工程研究所）；兔源一抗PKC（ab181558）、p-PKC（ab109539）、ERK1/2（ab184699）、p-ERK1/2（ab201015）、Bcl -2（ab194583）、Bax（ab32503）、Caspase -3（ab184787）、GAPDH（ab181602）、NeuN抗體（ab177487），二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?488，綠色熒光）（ab150077）（Abcam 公司，英國）。BX61電子顯微鏡（Olympus 公司，日本），TCS SP2 共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國），F(xiàn)ACScan 流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 HIE大鼠模型的構(gòu)建與分組

于是，便有了大家所看到的王惠和李金枝的同臺演出，同場次、同時空的交流、對話、對唱的攜手表演，便有了舞美以車臺的前后左右運(yùn)動對“推拉搖移”的鏡頭運(yùn)動的效果轉(zhuǎn)換，便有了舞臺使用卷簾紗幕的上下運(yùn)動產(chǎn)生的時空厚度和深度，實(shí)現(xiàn)了電影“蒙太奇”在戲曲舞臺上表現(xiàn)“三維空間”和“心理第四維”時空的藝術(shù)探索等等。

從90 只新生大鼠中隨機(jī)選取12 只為假手術(shù)組，3%的異氟烷麻醉后手術(shù)過程中以2%的劑量維持麻醉。除假手術(shù)組外，其余大鼠采用結(jié)扎右頸總動脈和低氧處理2.5 h的方法構(gòu)建HIE模型［11］：將大鼠仰臥固定以暴露頸前區(qū)，在頸部中線行一個小切口，將右頸總動脈與周圍組織分離，并使用5-0 外科絲線縫合雙結(jié)扎，在兩個結(jié)扎之間切斷動脈；縫合切口，讓幼崽恢復(fù)1 h，然后置于缺氧環(huán)境（8%O2和92% N2）的錐形瓶中，并將其浸入37 ℃水浴中2.5 h；然后，將所有幼崽放回各自的母鼠籠中。假手術(shù)組幼崽經(jīng)過麻醉和右頸總動脈暴露，沒有結(jié)扎和缺氧。若大鼠出現(xiàn)站立不穩(wěn)、右側(cè)肢體癱瘓、提尾時不能伸展對側(cè)前肢等現(xiàn)象，表明HIE 模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)過程中，有15 只大鼠死亡，存活且造模成功的大鼠共63只。因?yàn)樾律笫蟾髌鞴侔l(fā)育并不完善，造模時死亡數(shù)量會較多，其中造模死亡率為19.23%，模型成功率為80.77%，在可接受的范圍。

取60只造模成功大鼠，隨機(jī)分為模型組、白屈菜紅堿組（5 mg/kg）［12］、敗醬總黃酮低劑量組（50 mg/kg）、敗醬總黃酮高劑量組（100 mg/kg）［8-10］、敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組（100 mg/kg 敗醬總黃酮+5 mg/kg 白屈菜紅堿），每組12只。白屈菜紅堿組大鼠腹腔注射白屈菜紅堿5 mg/kg，敗醬總黃酮各劑量組灌胃相應(yīng)劑量的敗醬總黃酮，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠在灌胃100 mg/kg 敗醬總黃酮的同時腹腔注射5 mg/kg 白屈菜紅堿，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃和腹腔注射，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分

在手術(shù)清醒后（給藥前）和給藥結(jié)束后，參照Longa 評分法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無明顯神經(jīng)功能缺損；1分，提尾時不能完全伸展對側(cè)前肢；2分，行走時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時向?qū)?cè)傾斜；4分，不能自主活動或伴意識障礙。分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.3 HE染色觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)變化

行為學(xué)檢測完成后，麻醉大鼠，斷頭取腦，冠狀切分為兩部分，一部分-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)，另一部分4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)變化。

王陽明的古文獻(xiàn)學(xué)思想受到其主觀唯心主義哲學(xué)的影響，主要表現(xiàn)為憑空牽強(qiáng)臆斷，割裂語言文字與思想內(nèi)容的辯證關(guān)系，否定訓(xùn)詁與考據(jù)的作用等三個方面。

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞以1 000個/孔的密度接種到96 孔板中，用含不同終濃度0、5、10、20、40、80 μmol/L敗醬總黃酮的培養(yǎng)基處理原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞24 h。然后向孔中加入10 μL CCK-8 工作液并在37°C下孵育2 h。最后在450 nm波長下評估各孔的吸光度值，計算細(xì)胞活力。

取石蠟切片，脫蠟并與0.1%Triton X-100 在室溫下孵育8 min。檸檬酸/檸檬酸鈉溶液95 ℃修復(fù)10 min后，將組織用TUNEL 溶液37 ℃孵育60 min，然后用NeuN 抗體（1∶300）4 ℃過夜。樣品用PBS洗滌3次，并與Alexa Fluor?488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200）室溫下孵育60 min，DAPI染核，用抗熒光淬滅劑密封組織，并使用熒光顯微鏡觀察、拍照；計數(shù)每個視野下NeuN+TUNEL+陽性細(xì)胞數(shù)，每個切片隨機(jī)選擇3個視野進(jìn)行計數(shù)并取平均值。

1.2.5 Western blot 檢測腦組織PKC/ERK 通路及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液提取腦組織/海馬神經(jīng)元細(xì)胞裂解物，14 000g4 ℃離心30 min。收集并等分上清液，隨后通過BCA測定法測量蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)（30 μg）加到SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1 h，與一抗（PKC、p-PKC、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH，1∶1 000）4 ℃下孵育過夜。第2天，將膜與二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶2 000）室溫下孵育1 h。ECL Plus 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

為突出所述方法的優(yōu)越性,圖6所示為主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)方法對4種運(yùn)行狀態(tài)的分類結(jié)果,相對NCA方法存在著較高的誤分率,說明了所述方法的優(yōu)越性.

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為對照組、OGD/R 組、敗醬總黃酮組（20 μmol/L）、敗醬總黃酮（20 μmol/L）+白屈菜紅堿（10 mmol/L）組。OGD/R誘導(dǎo)方法同1.2.7，對照組細(xì)胞在常氧條件下用神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)。OGD/R 組中的細(xì)胞暴露于OGD/R 環(huán)境中。敗醬總黃酮組中的細(xì)胞用敗醬總黃酮（40 μmol/L）預(yù)處理24 h，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組細(xì)胞用敗醬總黃酮（20 μmol/L）和白屈菜紅堿（10 mmol/L）預(yù)處理24 h。

在胚胎第18天從SD大鼠胚胎中分離海馬神經(jīng)元，用于初級神經(jīng)元分離。切除、解剖海馬組織，小心取出附著的腦膜。然后用PBS 沖洗海馬。用木瓜蛋白酶（0.5 U/g）和脫氧核糖核酸酶I（DNase I）的混合物消化海馬體，32 ℃下保持12 min。消化后，細(xì)胞過濾器（40 μm）過濾以去除細(xì)胞碎片。然后以180g離心10 min，棄去上清液并以3×104個/mL的細(xì)胞密度重懸沉淀。隨后將細(xì)胞接種在12 孔板上。大鼠胚胎海馬神經(jīng)元在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)于含有2% B27 補(bǔ)充劑和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基中。

1.2.8 OGD/R細(xì)胞模型建立

1.2.7 CCK-8法評估敗醬總黃酮對原代海馬神經(jīng)元及氧-葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）后原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

安裝方案一：在新釜設(shè)計時，考慮好安裝的位置，一般建議在釜側(cè)壁或底部安裝，可以考慮采用預(yù)留法蘭，一般建議DN40或50，SRV法蘭型在線黏度計外形見圖6。

如圖6所示，當(dāng)冷凍時間小于2.9 h，漂燙時間小于4 min時，等高線較密集，表明在此范圍內(nèi)，二者對馬鈴薯脆片標(biāo)準(zhǔn)化綜合得分影響較大。適當(dāng)?shù)睦鋬鰰r間和漂燙時間有利于樣品多孔性的形成，提高產(chǎn)品脆度，色澤和降低含油量，有利產(chǎn)品品質(zhì)。

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞以1 000個/孔的密度接種到96 孔板中，除對照組外，其余各組將神經(jīng)元培養(yǎng)基替換為不含葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃缺氧（95% N2和5% CO2）室中培養(yǎng)4 h 以建立OGD/R 模型。之后在常氧條件下（5%CO2和95%空氣、37 ℃）對細(xì)胞進(jìn)行再氧化，并在神經(jīng)元培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。對照組細(xì)胞在常氧條件下用神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)，OGD/R 組中的細(xì)胞暴露于OGD/R 環(huán)境中，敗醬總黃酮處理組用含不同終濃度（0、5、10、20、40、80 μmol/L）的敗醬總黃酮培養(yǎng)基處理原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞24 h。

目前，學(xué)校在進(jìn)行體育教育的過程中，由于受到應(yīng)試教育因素的影響，學(xué)校過度重視德育的教育，而忽略了體育的教育，并且在其中過度重視體育的教育，使得學(xué)生缺乏一定的體育鍛煉。在以往我國對學(xué)生的體制進(jìn)行監(jiān)測時，結(jié)果表明，我國學(xué)生的心肺耐力情況逐漸降低，同時視力不良情況逐漸增多，大部分學(xué)生的身體素質(zhì)較低。

作為班主任，需要以身作則，用自己高尚的人品對學(xué)生產(chǎn)生影響，多關(guān)懷、鼓勵學(xué)生。將全面提升學(xué)生的綜合素養(yǎng)能力作為教學(xué)宗旨，在此管理下，教師的任務(wù)意義重大，將班級學(xué)生發(fā)展成徳智體美勞兼?zhèn)涞膬?yōu)秀人才，畢業(yè)后才能為社會所需，實(shí)現(xiàn)自己的人生價值。

1.2.6 原代海馬神經(jīng)元的分離

1.2.9 LDH活性測定

收集各組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基上清液，取上清液20 μL，加入2，4-二硝基苯肼混合均勻后在37 ℃下孵育15 min。然后將NaOH（0.4 mol/L）添加到混合物中，再在37 ℃下孵育15 min。最后室溫放置3 min后在酶標(biāo)儀上測量吸光度值。根據(jù)試劑盒說明測定LDH活性。

“跨世界通達(dá)”普遍存在于各種形態(tài)的敘述文本之中，但由于紀(jì)實(shí)型敘述與虛構(gòu)型敘述呈現(xiàn)通達(dá)關(guān)系的程度和方式存在根本性差異，需要區(qū)別對待。趙毅衡從廣義敘述學(xué)的視角提出“雙層區(qū)隔”理論，這一理論對于揭示新聞文本與電影文本中的“跨世界通達(dá)”現(xiàn)象同樣具有重要意義。

1.3 我國康復(fù)醫(yī)學(xué)的發(fā)軔 隨著社會經(jīng)濟(jì)文化的發(fā)展、醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)改革的不斷深化以及生活水平的提高，醫(yī)學(xué)模式由生物醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)向生物-心理-社會的醫(yī)學(xué)模式。人們對醫(yī)療、疾病預(yù)防、殘疾出現(xiàn)后的康復(fù)有了更大期盼。中國現(xiàn)代康復(fù)醫(yī)學(xué)從1982年發(fā)軔，在機(jī)構(gòu)設(shè)置、學(xué)科建設(shè)、人員培養(yǎng)、服務(wù)開展方面已形成一定規(guī)模和水平并且獨(dú)具特色[7]。我國康復(fù)醫(yī)學(xué)的中西醫(yī)結(jié)合的特點(diǎn)，更加富有東方醫(yī)學(xué)色彩，有很大潛力和發(fā)展空間。經(jīng)過30余年的發(fā)展，符合我國實(shí)際的康復(fù)醫(yī)學(xué)理念、工作方式逐漸形成，以臨床康復(fù)醫(yī)學(xué)為主，以專業(yè)康復(fù)機(jī)構(gòu)為骨干、社區(qū)為基礎(chǔ)、家庭為依托的多層次康復(fù)服務(wù)模式不斷完善[8]。

收集各組海馬神經(jīng)元，使用70%酒精固定細(xì)胞24 h，并在37 ℃下將細(xì)胞與Annexin V-FITC 和PI 溶液（各5 μL）避光孵育30 min。然后將細(xì)胞洗滌并重懸于結(jié)合緩沖液中，并立即使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評估

造模前，所有大鼠的神經(jīng)功能均正常。造模成功后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損現(xiàn)象，如活動減少、提尾時左側(cè)前爪不能完全伸展、行走時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈等，神經(jīng)功能缺損評分顯著增加（P＜0.05）。給藥結(jié)束后，與模型組相比，敗醬總黃酮低、高劑量組神經(jīng)功能改善，神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（P＜0.05），而白屈菜紅堿組神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（P＜0.05）；與白屈菜紅堿組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（P＜0.05）；與敗醬總黃酮高劑量組相比，敗醬總黃酮低劑量組和敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和翻正反射時間Table 1 Neurological deficit score and righting reflex time of rats in each group（分，，n=12）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和翻正反射時間Table 1 Neurological deficit score and righting reflex time of rats in each group（分，，n=12）

與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與白屈菜紅堿組相比，△P＜0.05；與敗醬總黃酮高劑量組相比，▲P＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密，未出現(xiàn)明顯的病理損傷；模型組大鼠海馬CA1區(qū)可觀察到神經(jīng)元排列疏松，細(xì)胞核固縮深染；與模型組相比，敗醬總黃酮低、高劑量組大鼠海馬組織上述病理改變減輕，神經(jīng)元密度增加，且敗醬總黃酮高劑量組對海馬組織病理損傷的改善程度優(yōu)于敗醬總黃酮低劑量組，而白屈菜紅堿組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)一步減少；敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較敗醬總黃酮高劑量組減少，而較白屈菜紅堿組神經(jīng)元數(shù)量增多（圖1）。

1.2.4 TUNEL/NeuN熒光雙染觀察海馬神經(jīng)元凋亡

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化（HE，×200）Figure 1 Histopathological changes of the hippocampus of rats in each group（HE，×200）

2.3 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，敗醬總黃酮低、高劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），而白屈菜紅堿組大鼠NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與白屈菜紅堿組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與敗醬總黃酮高劑量組相比，敗醬總黃酮低劑量組和敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05，圖2、表2）。

圖2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL，×200）Figure 2 Apoptosis of neurons in hippocampus of rats in each group（TUNEL，×200）

表2 各組大鼠海馬組織NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)Table 2 The number of NeuN+TUNEL+ cells in hippocampus of rats in each group（，n=12）

表2 各組大鼠海馬組織NeuN+TUNEL+細(xì)胞數(shù)Table 2 The number of NeuN+TUNEL+ cells in hippocampus of rats in each group（，n=12）

與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與白屈菜紅堿組相比，△P＜0.05；與敗醬總黃酮高劑量組相比，▲P＜0.05。

2.4 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織Bax、Caspase-3 的表達(dá)顯著升高，Bcl-2 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，敗醬總黃酮低、高劑量組大鼠腦組織Bax、Caspase-3 的表達(dá)顯著降低，Bcl-2的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而白屈菜紅堿組大鼠腦組織Bax、Caspase-3 的表達(dá)顯著升高，Bcl-2 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與白屈菜紅堿組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠腦組織Bax、Caspase3 的表達(dá)顯著降低，Bcl-2的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與敗醬總黃酮高劑量組相比，敗醬總黃酮低劑量組和敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠腦組織Bax、Caspase-3的表達(dá)顯著升高，Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of Bcl-2，Bax and Caspase-3 proteins in brain tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠腦組織PKC/ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，敗醬總黃酮低、高劑量組大鼠腦組織p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值顯著升高（P＜0.05），而白屈菜紅堿組大鼠腦組織p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值顯著降低（P＜0.05）；與白屈菜紅堿組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠腦組織p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值顯著升高（P＜0.05）；與敗醬總黃酮高劑量組相比，敗醬總黃酮低劑量組和敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組大鼠腦組織p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值顯著降低（P＜0.05，圖4）。

1.2.10 流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)元凋亡

圖4 各組大鼠腦組織PKC/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of PKC/ERK pathway-related proteins in brain tissue of rats in each group

2.6 敗醬總黃酮對原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的影響

海馬神經(jīng)元用不同濃度（0、5、10、20、40、80 μmol/L）的敗醬總黃酮處理24 h。CCK-8 結(jié)果顯示，與對照組相比，用5、10、20、40、80 μmol/L 敗醬總黃酮處理對細(xì)胞存活率沒有明顯影響（P＞0.05，圖5）。

圖5 敗醬總黃酮對原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的影響（n=6）Figure 5 The effect of total flavonoids of patriniae radix on the cytotoxicity of primary hippocampal neurons（n=6）

2.7 敗醬總黃酮對OGD/R 誘導(dǎo)的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，OGD/R 組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與OGD/R 組相比，敗醬總黃酮（10、20、40、80 μmol/L）組細(xì)胞活力顯著增加（P＜0.05，圖6）。由于20 μmol/L敗醬總黃酮的神經(jīng)保護(hù)作用最大，因此以該濃度用于隨后的體外研究。

圖6 敗醬總黃酮對OGD/R誘導(dǎo)的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響Figure 6 The effect of total flavonoids of patriniae radix on the viability of primary hippocampal neurons induced by OGD/R

2.8 各組海馬神經(jīng)元LDH活性

與對照組相比，OGD/R 組LDH 活性顯著升高（P＜0.05）；與OGD/R組相比，敗醬總黃酮組LDH活性顯著降低（P＜0.05）；與敗醬總黃酮組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組LDH 活性顯著升高（P＜0.05，表3）。

表3 各組LDH活性和海馬神經(jīng)元凋亡率比較Table 3 Comparison of LDH activity and apoptosis rate of hippocampal neurons in each group（，n=6）

表3 各組LDH活性和海馬神經(jīng)元凋亡率比較Table 3 Comparison of LDH activity and apoptosis rate of hippocampal neurons in each group（，n=6）

與對照組相比，*P＜0.05；與OGD/R組相比，#P＜0.05；與敗醬總黃酮組相比，△P＜0.05。

2.9 各組海馬神經(jīng)元凋亡率

與對照組相比，OGD/R 組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與OGD/R 組相比，敗醬總黃酮組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與敗醬總黃酮組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05，表3、圖7）。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組海馬神經(jīng)元凋亡Figure 7 Apoptosis of hippocampal neurons in each group detected by flow cytometry

2.10 各組海馬神經(jīng)元PKC/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與對照組相比，OGD/R 組海馬神經(jīng)元p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著降低（P＜0.05）；與OGD/R組相比，敗醬總黃酮組p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著升高（P＜0.05）；與敗醬總黃酮組相比，敗醬總黃酮+白屈菜紅堿組p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著降低（P＜0.05，圖8）。

Modic改變主要是指終板及終板下骨的炎性水腫信號改變，表現(xiàn)為T1低信號，T2高信號，最早于1987年由de Roos提出[7]。其發(fā)生原因更多的傾向于局部力學(xué)環(huán)境的改變帶來了終板及終板下骨的微骨折，進(jìn)而表現(xiàn)局部炎性水腫信號的廣泛發(fā)生，機(jī)體表現(xiàn)出疼痛的反應(yīng)[8]。Modic改變往往預(yù)示著脊柱終板的損傷及脊柱穩(wěn)定性的減弱，增加了局部鈣化及微骨折的發(fā)生，進(jìn)而出現(xiàn)局部炎性物質(zhì)產(chǎn)生的增多，進(jìn)而引起機(jī)體的疼痛反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)腰痛組中Modic改變陽性14例，陽性率為36.9%，較對照組明顯升高，同樣證明了Modic與腰痛之間的相關(guān)性。

圖8 各組海馬神經(jīng)元PKC/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 8 Expression of PKC/ERK pathway-related proteins in hippocampal neurons in each group

3 討論

神經(jīng)元凋亡是HIE后的主要病理過程，新生兒的大腦可能比成人更容易受到這種影響［13］。據(jù)報道，在經(jīng)歷HIE后死亡兒童的大腦切片以及經(jīng)受缺氧缺血的大鼠大腦中Caspase-3活化均增加［14］。本研究通過結(jié)扎右頸總動脈和低氧處理以模擬缺氧缺血環(huán)境建立了新生大鼠HIE模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能損傷，海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元凋亡增加，并伴隨著促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)的升高；與以往研究結(jié)果一致，表明HIE 新生大鼠神經(jīng)元凋亡增加。因此，增強(qiáng)內(nèi)源性抗凋亡機(jī)制的治療策略可能是減少HIE患者神經(jīng)損傷的安全方法。

敗醬總黃酮能夠抑制腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)元凋亡，有助于受損神經(jīng)元的修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［8-10］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)敗醬總黃酮干預(yù)后，HIE新生大鼠的神經(jīng)功能明顯改善，海馬神經(jīng)元密度增加，凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少，同時促凋亡標(biāo)志物Caspase-3、Bax 表達(dá)減少，而抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2增加，表明敗醬總黃酮可抑制HIE 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。體外實(shí)驗(yàn)顯示，敗醬總黃酮增加了海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力，挽救了神經(jīng)元損傷并減少了OGD/R損傷后的細(xì)胞凋亡，與體內(nèi)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)敗醬總黃酮可減少HIE后海馬神經(jīng)元凋亡。

PKC/ERK 通路是一種離子通道活性調(diào)節(jié)劑。據(jù)報道，在δ-阿片受體（DOR）介導(dǎo)的缺氧/缺血應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)中，其增強(qiáng)K+穩(wěn)態(tài)的作用依賴于PKC途徑和ERK、Bcl-2 活性的增加［15］。另有研究顯示，在缺氧神經(jīng)元中，PKC/ERK 通路的激活可增強(qiáng)Bcl-2活性，抑制細(xì)胞色素C 的釋放，保護(hù)神經(jīng)元［16］。此外，近年來不少研究發(fā)現(xiàn)激活發(fā)育中的海馬神經(jīng)元中的PKC/ERK通路，可抑制氯胺酮誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元早期和晚期凋亡［17］。在腦出血小鼠模型中，PKC活性的敲低降低了p-ERK1/2、Bcl-2表達(dá)，升高了Caspase-3表達(dá)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加重和神經(jīng)元凋亡增加，而激活PKC/ERK通路則表現(xiàn)出相反的作用［6］。以上研究表明PKC/ERK 通路在神經(jīng)元凋亡中具有重要作用。與既往研究一致，本研究HIE 模型大鼠的腦組織中p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2的比值較假手術(shù)組顯著降低，且使用PKC抑制劑白屈菜紅堿干預(yù)的HIE 模型大鼠神經(jīng)功能損傷進(jìn)一步加重，并伴隨著Caspase-3、Bax 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)減少，說明HIE新生大鼠腦組織PKC/ERK 通路被抑制。在OGD/R細(xì)胞模型中也觀察到一致的趨勢。敗醬總黃酮可升高HIE 大鼠腦組織中p-PKC/PKC、p-ERK1/2/ERK1/2比值，白屈菜紅堿明顯減弱了體內(nèi)和體外敗醬總黃酮對PKC/ERK通路的激活作用，削弱了敗醬總黃酮對海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用。提示敗醬總黃酮可能通過激活PKC/ERK 通路減少HIE 新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

在本系統(tǒng)中，用戶可以即時查詢獲取文件的電子數(shù)據(jù)。根據(jù)電子數(shù)據(jù)用戶隱私需求，電子數(shù)據(jù)僅該用戶自己可見（在默認(rèn)情況）。當(dāng)用戶需要查看其他用戶的電子數(shù)據(jù)時，先給出需要查看文件的序號，系統(tǒng)根據(jù)文件序號查詢區(qū)塊鏈上文件序號對應(yīng)用戶的用戶名。當(dāng)文件屬于查看用戶的用戶名時，則可以查看用戶數(shù)據(jù)；如果文件不屬于該用戶名類，則文件不能被查看，具體如圖6所示。

然而，PKC 在缺血性腦損傷中的作用存在爭議。大多數(shù)闡明PKC 作用的研究提示在缺血性損傷后，總PKC 水平和活性迅速下降，這表明PKC 在這些條件下被降解［6，16-17］。但另一些研究表明，在腦缺血損傷早期和OGD/R 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，PKC 水平和PKC 活性增加，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎介質(zhì)［18-19］；用PKC 抑制劑處理細(xì)胞可保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［20］。這些研究結(jié)果不一致的原因可能是動物模型不同，大腦區(qū)域不同，缺血/再灌注損傷的持續(xù)時間和強(qiáng)度不同，也可能是不同的PKC 同工酶產(chǎn)生相反作用。

綜上所述，敗醬總黃酮可抑制HIE 新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，其作用機(jī)制可能與激活PKC/ERK通路有關(guān)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了敗醬總黃酮的神經(jīng)保護(hù)作用，為HIE 的治療提供實(shí)驗(yàn)參考。但其介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是否與HIE 期間炎癥或氧化應(yīng)激有關(guān)，仍有待確定。此外，敗醬總黃酮能否影響其他腦組織區(qū)域（如皮質(zhì)、CA2、CA3 區(qū)）改善新生兒HIE，有待進(jìn)一步深入研究。