柚類黃酮對鉛中毒小鼠的保護作用及其機制的研究*

楊甜甜，朱程瀅，諶潔，董俊

（1.長沙醫(yī)學院 第一臨床學院，湖南 長沙 410219；2.長沙醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生理學教研室，湖南 長沙 410219 ）

當今社會，鉛在各個行業(yè)的廣泛應用嚴重威脅著人們的健康。鉛的毒性作用機制主要是其對帶負電的巰基表現(xiàn)出高度親和力，從而抑制各個器官中與巰基有關的酶，目前氧化應激被認為是鉛離子損傷機體各器官功能的主要機制［1］。氧化應激可對人體造成嚴重傷害，其機制是通過生成活性氧自由基，直接破壞DNA 分子，同時對生物膜上的多不飽和脂肪酸進行攻擊，破壞膜結(jié)構，損傷細胞正常功能［2］。

關于鉛中毒藥物治療，主要有螯合劑類藥物、金屬硫蛋白、抗氧化劑等，然多數(shù)排鉛藥物均存在不小的毒副作用［3］。為了能夠在減輕驅(qū)鉛藥物的毒副作用的前提下，同時使其適于口服，國內(nèi)外主要將關注點放在了低毒藥物和天然藥物的研發(fā)上，研究其驅(qū)鉛效果［4］。低毒藥物主要以口服絡合劑為主，如二巰基丁二酸、二巰基丙醇及青霉胺等，但其副作用依舊十分明顯如腹部痙攣、惡心、嘔吐、中性粒細胞的可逆性減少，腎臟負擔加重［5-6］。在對具有驅(qū)鉛作用的天然藥物的研究中，主要是通過提取可食用植物中的有效成分，來研發(fā)具備有良好生物安全性、副作用小、便于口服的植物提取物制品，將具備生物安全性、無毒、低副作用、靶向性明確及價格低廉的目標作為驅(qū)鉛藥物的發(fā)展方向［7］。

黃酮類化合物作為一種天然的抗氧化劑，近年來被人們廣泛研究，它具有特殊的分子結(jié)構，既可以作為自由基鏈式反應阻斷劑，又可以作為金屬離子螯合劑［8-9］，從而具有一定的抗氧化作用［10-11］。其抗氧化應激的機制與酚類物質(zhì)相似，都是通過與自由基結(jié)合發(fā)揮抗氧化應激作用。黃酮類化合物可與脂類物質(zhì)反應，通過將氫轉(zhuǎn)移給脂類物質(zhì)自由基，來形成穩(wěn)定的酚基自由基，從而抑制氧化反應的繼續(xù)進行［12］。研究表明，口服鉛暴露可導致血液及腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等活性顯著降低［13］。另外，鉛還可誘導過量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成［14］。本課題主要研究柚類黃酮對鉛中毒小鼠臟器系數(shù)、血清超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平的影響，探索柚類黃酮化合物對醋酸鉛致小鼠損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 離心機（TGL-10B），購于常州金壇中旺儀器制造有限公司；恒溫水浴箱（DU-20G），購于江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計（UV757CRT），可見分光光度計（722），均購于杭州俊升科學器材有限公司。

1.1.2 實驗動物 健康小鼠36 只，體質(zhì)量（25±3）g，于沅江市惠源科教工程有限公司購買。全部動物在實驗室無差別飼養(yǎng)一周后隨機分組分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。

1.1.3 藥品與試劑 醋酸鉛溶液，超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，內(nèi)消旋-2,3-二巰基丁二酸，75%乙醇，均購自河南省萬佳標準物質(zhì)研發(fā)中心有限公司；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成）；柚類黃酮粉劑溶于60%乙醇配制400 mg/mL黃酮試劑，再稀釋成100 mg/mL，200 mg/mL 黃酮試劑。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 36 只小鼠隨機分為6 組，每組6 只，分別為空白對照組，模型對照組，陽性藥物對照組（二巰基丁二酸試劑1.5 mg/mL），黃酮化合物低劑量組（100 mg/mL），黃酮化合物中劑量組（200 mg/mL），黃酮化合物高劑量組（400 mg/mL）。灌胃給藥，每天給藥1 次，持續(xù)給藥4 周。空白對照組小鼠正常飼養(yǎng)，灌胃0.4 mL生理鹽水；其余5 組均用0.2 mL 醋酸鉛水溶液（400 mg/mL）進行染鉛；模型對照組給予0.2 mL生理鹽水進行干預，陽性藥物對照組給予二巰基丁二酸試劑進行干預，黃酮化合物低、中、高劑量組分別給予100 mg/mL、200 mg/mL、400mg/mL的黃酮試劑進行干預。

1.2.2 小鼠臟器系數(shù)的測定 利用小鼠肝臟和腎臟的濕重以及小鼠體重計算小鼠臟器指數(shù)，肝臟系數(shù)=（肝臟重量g/小鼠體重g）×100%，腎臟系數(shù)=（腎臟重量g/小鼠體重g）×100%。

1.2.3 小鼠血清SOD 活性和MDA 水平的測定稱重，眼球摘除取血法收集血液于抗凝管中，做好標記，然后快速斷頸處死小鼠，解剖，剝離肝組織及腎組織，分別稱重，記錄。將血液室溫放置兩小時，置4℃冰箱內(nèi)過夜，第二天取出，4 000 r/min 離心10 min，取血清進行試劑盒檢測。按照試劑盒說明書進行操作，記錄分光光度計數(shù)值，根據(jù)公式計算出SOD 活性水平和MDA 含量水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)利用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柚類黃酮對鉛中毒小鼠臟器系數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型對照組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組比較，四個干預治療組腎臟指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且黃酮化合物低、中、高劑量組與陽性藥物對照組干預效果相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，陽性藥物對照組和黃酮化合物中劑量組肝臟系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 柚類黃酮對染鉛小鼠臟器系數(shù)的影響（n=36,,%）

表1 柚類黃酮對染鉛小鼠臟器系數(shù)的影響（n=36,,%）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與模型對照組比較，P＜0.05。

2.2 柚類黃酮對鉛中毒小鼠血清SOD 和MDA 含量水平的影響

與空白對照組比較，模型對照組的血清SOD含量下降，且MDA 生成增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組比較，陽性藥物對照組和黃酮化合物中劑量組的SOD 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），黃酮化合物中劑量組與陽性藥物對照組則效果相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；黃酮化合物低劑量組和高劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，陽性藥物對照組和黃酮化合物中劑量組的MDA 含量水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與陽性藥物對照組作用效果相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型對照組比較，黃酮化合物低劑量組與高劑量組MDA 含量水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 柚類黃酮對染鉛小鼠體血清SOD 含量和MDA 水平的影響（n=36,）

表2 柚類黃酮對染鉛小鼠體血清SOD 含量和MDA 水平的影響（n=36,）

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與模型對照組比較，P＜0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，黃酮化合物作為一種天然的抗氧化劑，可以與自由基結(jié)合，起到抗氧化作用，還可以將氫轉(zhuǎn)移到脂類物質(zhì)自由基后形成穩(wěn)定的酚類自由基，從而抑制氧化反應的繼續(xù)進行［15］。研究表明，SOD 可催化超氧陰離子，清除多余的超氧根離子［16］；作為脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，MDA能改變細胞膜通透性、流動性［17］，由此可見，上述指標可以直接反映機體清除自由基的能力。

本實驗研究中模型對照組SOD 含量下降，黃酮化合物中劑量組（200 mg/mL）SOD 活性提高（P＜0.05），黃酮化合物高劑量組（400 mg/mL）理論上抗氧化應激水平高于黃酮化合物中劑量組，但數(shù)值相對較低，且差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；鉛離子可誘導MDA 含量升高，導致肝損傷，黃酮化合物中劑量組（200 mg/mL）降低了鉛離子誘導的MDA 升高趨勢（P＜0.05），同樣，黃酮化合物高劑量組（400 mg/mL）拮抗鉛離子誘導MDA 含量升高的能力有所減弱，且不具有明顯作用（P＞0.05）；黃酮化合物低、中、高劑量組均可以使染鉛小鼠腎臟系數(shù)降低，但只有中劑量組同時可以降低染鉛小鼠的肝臟系數(shù)。由此可見，三種劑量濃度中，以200 mg/mL 黃酮試劑效果最佳，能夠發(fā)揮最大抗氧化應激能力，有效拮抗鉛離子對氧化防御系統(tǒng)SOD 活性抑制作用，同時減少脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物MDA 的產(chǎn)生，有效拮抗鉛離子帶來的過氧化反應，且能顯著降低鉛對肝臟和腎臟的毒性作用。

另外，本實驗中，與空白對照組比較，模型對照組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)均升高（P＜0.05），可作為染鉛造模成功的指標之一［18］。與模型對照組比較，四個干預治療組腎臟指數(shù)均降低（P＜0.05），表明藥物的干預能夠有效地降低鉛的腎毒性，且黃酮化合物低、中、高劑量組與陽性藥物對照組干預效果相當（P＞0.05），且柚類黃酮對腎臟的保護作用不存在劑量依賴關系。與模型對照組比較，陽性藥物對照組和黃酮化合物中劑量組肝臟系數(shù)降低（P＜0.05），表明200 mg/mL 柚類黃酮試劑能夠有效降低鉛的肝毒性，但效果不如陽性藥物對照組顯著；黃酮化合物低劑量組與高劑量組不能顯著降低鉛對肝臟的毒性作用，表明柚類黃酮對肝臟的保護作用不存在劑量依賴關系，且可能揭示柚類黃酮具有安全濃度范圍。

綜上所述，柚類黃酮可以有效減輕醋酸鉛對小鼠機體的損傷，但存在最優(yōu)劑量，其作用機制可能與消除活性氧自由基、增強抗氧化防御能力、抑制脂質(zhì)過氧化有關。