普通野生稻內(nèi)生細菌的分離鑒定及其對多年生稻的促生效果

馬永海，田青霖，龔禹瑞，薛治峰，張廷萍，李麗萍，楊紅敏，黃立鈺，胡鳳益，秦世雯

(云南大學(xué) 資源植物研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年生稻生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，云南 昆明 650091)

普通野生稻（Oryza rufipogon）是亞洲栽培稻（Oryza sativaL.）的野生近緣種，經(jīng)過長期自然選擇積累了豐富的生境和遺傳多樣性，為栽培稻育種提供了寶貴的基因資源[1-2].普通野生稻在中國分布范圍廣，能夠抵御干旱[3]、鹽堿[4]、寒冷[5]、重金屬[6]、白葉枯病[7]、稻曲病[8]、南方水稻黑條矮縮病[9]、稻飛虱[10]等非生物和生物逆境脅迫.研究還發(fā)現(xiàn)，普通野生稻具有豐富的內(nèi)生細菌和和根際微生物多樣性[11-13]，說明普通野生稻的遺傳基礎(chǔ)和微生態(tài)對其生境和脅迫適應(yīng)性起到了至關(guān)重要的作用.

植物內(nèi)生細菌（endophyte bacteria）是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，與寄主協(xié)同進化，在植物的生長發(fā)育過程中起到重要作用[14].植物內(nèi)生細菌通過溶磷、解鉀和固氮作用幫助寄主植物吸收營養(yǎng)，分泌植物生長激素（吲哚乙酸、生長素、赤霉素等）促進寄主生長，以產(chǎn)生鐵載體、ACC 脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase）、抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性等方式幫助植物抵御脅迫干擾[15].目前研究表明，在脅迫環(huán)境（干旱、寒冷、高溫、鹽堿、污染等）下生長的植物，其內(nèi)生菌回接到寄主或非寄主植物中，可以顯著提高植物在逆境條件下的生長[16-17].因此，植物內(nèi)生細菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護方面具有廣闊的應(yīng)用潛力，但目前對普通野生稻內(nèi)生細菌的挖掘和功能研究尚少.

多年生稻（perennial rice）是指播種一次可實現(xiàn)多年（季）持續(xù)收獲的新型稻作品種，其“一種多收”的生產(chǎn)模式簡化了購種、育秧、犁田、耙田、移栽等生產(chǎn)環(huán)節(jié)，大大減少了勞動力和水資源投入，具有顯著的社會、經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境效應(yīng)[18].由于多年生稻的連作生產(chǎn)方式，需采取恰當?shù)氖┓史绞揭员Ｕ隙嗄晟镜纳a(chǎn)優(yōu)勢.綠色、環(huán)保、持效期長的微生物菌肥契合了多年生稻高效、免耕、輕簡的生產(chǎn)模式，還能夠緩解多年生稻生產(chǎn)存在的冷害、干旱和病蟲害問題[19].針對多年生稻微生物菌肥還處于空白的研究現(xiàn)狀，本研究通過挖掘云南的元江普通野生稻內(nèi)生細菌，明確其促生功能和對多年生稻的促生效果，為普通野生稻微生態(tài)功能研究和多年生稻微生物菌肥的研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料云南元江普通野生稻（Oryza rufipogon）、多年生稻粳型品種“PR23”和秈型品種“云大107”均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年生稻生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供.

1.2 內(nèi)生細菌的分離純化與保存采取云南特有的元江普通野生稻健康根、莖、葉組織，沖洗表面污漬.用75%酒精浸泡2～5 min，無菌水漂洗1 次，2.5%次氯酸鈉浸泡2～4 min，無菌水漂洗3 次.組織研磨后將研磨液進行10-2～10-5梯度稀釋，取100 μL 稀釋液涂布于NA 培養(yǎng)基[20].吸取第3 次漂洗液涂布于NA 培養(yǎng)基，若無菌落產(chǎn)生表明組織表面徹底消毒干凈，組織研磨液可用于分離內(nèi)生細菌.28°C 黑暗倒置培養(yǎng)24～72 h 待細菌菌落長出，挑取形態(tài)不同的細菌菌落進行純化和保存.

1.3 內(nèi)生菌促生功能測定

1.3.1 溶磷能力測定 采用平板法，在無機磷培養(yǎng)基[21]和有機磷培養(yǎng)基[21]上放置滅菌濾紙片，每個濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種等量的NB 培養(yǎng)液作為對照，28 ℃倒置培養(yǎng)24～72 h 后觀察是否形成透明圈.根據(jù)透明圈和菌落圈比值（Mp）判斷其解磷能力，Mp=透明圈直徑/菌落圈直徑，重復(fù)測算5 個處理取平均值（下同）.

1.3.2 固氮作用測定 采用劃線法，在Ashby 培養(yǎng)基[21]上接種內(nèi)生細菌，以NB 培養(yǎng)液作對照，28 ℃倒置培養(yǎng)24～72 h，能夠穩(wěn)定生長的菌株視為固氮菌.用天根細菌基因組DNA 提取試劑盒提取固氮菌株的DNA，隨后利用Zehrf（5′-TGYGAYCCNAARG CNGA-3′）和Zehrr（5′-NDGCCATCATYTCNCC-3′）引物[22]，對固氮菌的固氮酶nifH基因進行PCR 擴增和測序.PCR 反應(yīng)體系（25 μL)：10×Ex Taq PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，Ex Taq 酶（3 U/μL) 0.5 μL，無菌dd H2O 17 μL.PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min.

1.3.3 產(chǎn)鐵載體能力測定 采用平板法，在鉻天青（chrome azurol S,CAS）培養(yǎng)基[20]上放置滅菌濾紙片，每個濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種等量NB 培養(yǎng)液作對照，28 ℃倒置培養(yǎng)24～72 h 后觀察是否有橙黃色變色圈，根據(jù)Mp值判斷其產(chǎn)鐵載體能力.

1.3.4 產(chǎn)吲哚乙酸能力測定 吲哚乙酸定性分析采用Salkowski 比色法測定，將菌株接種至King’s B 培養(yǎng)基[23]中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h.吸取等體積菌懸液和Salkowski’s 試劑[24]混合后放置于白色點滴板上，陽性對照為50 mg/L 吲哚乙酸，陰性對照為King B 培養(yǎng)基.避光反應(yīng)30 min 后呈現(xiàn)粉紅色說明菌株能產(chǎn)生IAA.

IAA 定量測定：配制質(zhì)量濃度為10～60 mg/L的IAA 標準品溶液，分別與Salkowski’s 試劑等體積混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測定OD530nm值，繪制標準曲線.將上述定性測定中具有產(chǎn)IAA 功能的菌株接種于King’s B 培養(yǎng)基中，設(shè)置3 個重復(fù)，28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后，10 000 r/min 離心.取上清液與Salkowski’s 顯色劑等體積混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測定OD530nm值.King B 培養(yǎng)基與Salkowski’s 試劑等體積混合為空白對照.根據(jù)IAA 標準曲線方程y=0.019 5x-0.012 9，R2=0.995 3計算菌株的IAA 分泌量.

1.4 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定將菌株在NA平板培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察其形態(tài)特征.菌株在NB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)16～24 h 后進行革蘭氏染色和菌體形態(tài)特征觀察.利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株DNA，進行16S rRNA 基因全長序列（引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）的PCR 擴增.PCR產(chǎn)物測序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BlastN 比對.菌株16S rRNA 基因序列提交至國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心GenBase 數(shù)據(jù)庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/genbase/）獲得相應(yīng)登錄號.利用MEGA 11 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining Algorithm）構(gòu)建16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值為1 000.

1.5 促生效果測定選取籽粒飽滿、長勢一致的多年生稻“PR23”和“云大107”種子，用2.5%次氯酸鈉浸泡10 min 進行消毒.分別以浸種和拌土的方式進行溫室促生試驗.浸種處理：配置108cfu/mL的菌株懸液浸泡種子12 h，對照以無菌水進行浸泡，催芽至漏白，隨后播種于苗盤中.拌土處理：將30 mL 108cfu/mL 的菌株懸液與500 g 滅菌土中混合均勻，放置于苗盆中，將催芽至漏白的種子播種于苗盤中.每盆9 粒種子，每個處理3 個重復(fù).待多年生稻長至三葉一心期測定株高、根長、鮮重、葉綠素和氮素含量.

1.6 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)利用SPSS 17 軟件進行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析和Duncan’s 法檢驗數(shù)據(jù)差異顯著性，利用Graphpad Prism 8.0 軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離純化本研究分別從元江普通野生稻的根、莖、葉3 個組織中分離獲得52、32和27 株內(nèi)生細菌，共111 株.根部分離獲得的內(nèi)生細菌數(shù)量最多，說明根部內(nèi)生細菌種類和豐度高于其他組織.

2.2 內(nèi)生細菌的促生功能

2.2.1 溶磷能力 具有溶磷功能的內(nèi)生細菌可以將無機磷和有機磷培養(yǎng)基中難溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤祝沟镁渲車霈F(xiàn)明顯的透明圈[圖1（a）和1（d）].分離內(nèi)生細菌中50 株具有溶無機磷能力[圖1（b）]，32 株具有溶有機磷能力[圖1（e）].溶無機磷能力的菌株Mp值在1.14～1.92，溶有機磷能力的菌株的Mp值在1.16～2.03，且3 個組織中分離的內(nèi)生細菌溶磷能力（Mp值）無顯著差異[圖1（c）和圖1（f）].

圖1 普通野生稻具有溶磷功能的內(nèi)生細菌數(shù)量及其Mp 值Fig.1 Number and Mp values of endophytic bacterial strains with phosphate-solubilizing ability isolated from Oryza rufipogon

2.2.2 固氮作用 分離的內(nèi)生細菌中共有能夠23 株能夠在Ashby 培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長[圖2（a）和2（b）]，并且均能擴增出固氮酶基因nifH[圖2（c）]，說明23 株細菌可通過固氮酶基因nifH發(fā)揮固氮作用.

2.2.3 產(chǎn)鐵載體 分離的內(nèi)生細菌中共有50 個菌株可以使菌株周圍的藍色CAS 培養(yǎng)基變成橙黃色[圖3（a）和3（b）]，Mp值在1.17～4.88，說明其具有產(chǎn)鐵載體能力，且3 個組織中分離的內(nèi)生細菌產(chǎn)鐵載體能力（Mp值）無顯著差異[圖4（c）].

圖3 普通野生稻產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細菌的數(shù)量及其Mp 值Fig.3 Number and Mp values of endophytic bacterial strains with siderophore-producing activity isolated from Oryza rufipogon

圖4 普通野生稻中產(chǎn)吲哚乙酸內(nèi)生細菌的數(shù)量及分泌量Fig.4 Number of screening endophytic bacterial strains with IAA productivity isolated from Oryza rufipogon and their IAA yields

2.2.4 產(chǎn)吲哚乙酸 利用吲哚乙酸IAA 顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，分離的內(nèi)生細菌中共有18 株菌株可使反應(yīng)液呈現(xiàn)粉紅色[圖4（a）和4（b）]，18 株菌株IAA分泌量在0.73～24.62 mg/L，且3 個組織中分離的菌株的IAA 分泌量無顯著差異[圖4（c）].來自于葉部的ORL3-1 以及來自于莖部的ORS1-2 和ORS2-5 菌株IAA 分泌量顯著高于其他菌株，分別為（24.62 ±0.01）、（22.81 ± 0.07）mg/L 和11.69 ± 0.05 mg/L，說明3 個菌株具有較高的IAA 分泌能力.

2.3 菌株的鑒定選取溶無機磷、固氮、產(chǎn)鐵載體和IAA 的ORL3-1，產(chǎn)IAA 和鐵載體的ORS1-2以及固氮和產(chǎn)IAA 的ORS2-5 菌株進行形態(tài)學(xué)和分子鑒定.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ORS1-2 菌株屬于革蘭氏陰性細菌，桿狀，菌體大小為(0.6～0.8) μm×(2.0～3.0) μm[圖5（b）]；在NA 培養(yǎng)基上單菌落為乳白色，圓形，無凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落直徑為4.0～5.0 mm[圖5（a）].ORS1-2 菌株（GenBase 登錄號：C_AA001297.1）與路德維希腸桿菌Enterobacter ludwigiistrain IB5 菌株（GenBank 登錄號：MK370571.1）的16S rRNA 基因序列相似性為100%，且親緣關(guān)系最近[圖5（c）]，鑒定為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）.ORL3-1 菌株屬于革蘭氏陰性細菌，桿 狀，菌體大小為(0.8～1.0) μm×(2.5～3.0) μm[圖5（b）]；在NA 培養(yǎng)基上單菌落為乳白色，圓形，無凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落直徑為6.0～7.0 mm[圖5（a）].ORL3-1 菌株（GenBase 登錄號：C_AA001296.1）與水稻科薩克氏菌Kosakonia oryzaestrain NAC43 菌株（GenBank 登錄號：MK872330.1）的16S rRNA 基因序列相似性為99.93%，且與其共處同一進化分支[圖5（c）]，鑒定為水稻科薩克氏菌（Kosakonia oryzae）.ORS2-5 菌株屬于革蘭氏陽性細菌，桿狀，菌體大小為(0.8～1.2) μm×(4.0～6.0) μm[圖5（b）]；在NA 培養(yǎng)基上單菌落為乳白色，圓形，有凸起，表面不光滑，邊緣整齊，菌落直徑為2.0～3.0 mm[圖5（a）].ORS2-5 菌株（GenBase 登錄號：C_AA001299.1）與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisstrain HY-119 菌株（GenBank 登錄號：MZ895453.1）的16S rRNA 基因序列相似性為100%，且親緣關(guān)系最近[圖5（a）]，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）.

圖5 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株的鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Morphological identification of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 and their phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences

2.4 菌株對多年生稻的促生效果利用菌株浸種及拌土處理后，將多年生稻栽種至三葉一心期后發(fā)現(xiàn)，ORS1-2 菌株、ORS2-5 菌株和ORL3-1 菌株對多年生稻粳型品種“PR23”和秈型品種“云大107”均具有不同程度促生效果（圖6）.ORS1-2 菌株浸種處理可顯著提高PR23 的根長，拌土處理可顯著提高PR23的根長、葉綠素含量和氮素質(zhì)量比；ORS2-5 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高PR23 的根長、鮮重、葉綠素含量和氮素質(zhì)量比；ORL3-1 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高PR23 的根長（表1）.ORS1-2 菌株浸種處理可顯著提高“云大107”的根長、鮮重、葉綠素含量和氮素質(zhì)量比，拌土處理可顯著提高“云大107”的根長；ORS2-5 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高“云大107”的根長、鮮重、葉綠素含量和氮素質(zhì)量比；ORL3-1 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高“云大107”的根長、鮮重、葉綠素含量和氮素質(zhì)量比（表2）.以上結(jié)果說明路德維希腸桿菌ORS1-2 菌株、枯草芽孢桿菌ORS2-5 菌株和水稻科薩克氏菌ORL3-1 菌株能夠促進多年生稻的細胞伸長、光合作用和生物量積累.

表2 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株對多年生稻“云大107”的促生效果Tab.2 Effect of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 on perennial rice Yunda107

圖6 ORS1-2、ORL3-1 和ORS2-5 菌株對多年生稻的促生效果Fig.6 Effect of strains ORS1-2,ORL3-1 and ORS2-5 on perennial rice growth

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細菌通過多種機制幫助植物抵御生物和非生物脅迫，并促進寄主生長，具有開發(fā)成微生物農(nóng)藥和菌肥的巨大潛力.野生稻是農(nóng)業(yè)微生物資源的重要保藏庫，已有研究從南方野生稻[23]、澳洲野生稻[25]、尼瓦拉野生稻[26]、藥用野生稻[27-28]、普通野生稻[29-30]中篩選到具有促生功能的內(nèi)生細菌.同時，已有研究從我國廣東、海南和東鄉(xiāng)普通野生稻中挖掘出了促生功能的內(nèi)生細菌，且研究重點集中在固氮和溶磷內(nèi)生細菌[29-30].本研究首次從云南元江普通野生稻中篩選到82 株溶磷能力的內(nèi)生細菌，23 株固氮內(nèi)生細菌，50 株產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細菌，18 株產(chǎn)IAA 內(nèi)生細菌，分別占總分離菌株數(shù)量的73.87%、20.72%、16.22%和45.05%，且根部分離獲得的菌株數(shù)量較莖部和葉部多.研究發(fā)現(xiàn)，東鄉(xiāng)野生稻可培養(yǎng)內(nèi)生細菌在根部的數(shù)量和多樣性相對于葉部和莖部較高[12]，與本研究菌株分離結(jié)果一致，這與土壤根際微生物效應(yīng)有關(guān)[31].促生菌株是否能在植株體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮促生作用跟其定殖效率密切相關(guān)，IAA 分泌能力被認為是具有高定殖效率的水稻促生細菌特征，可依據(jù)菌株IAA 分泌量進行水稻促生菌的高效篩選[32]，因此本研究選取了3 個IAA 分泌量較高的菌株進行多年生稻促生效果分析.

目前研究從不同生境下的普通野生稻中分離的內(nèi)生細菌對水稻具有促生效果.分離自海南陵水的普通野生稻根部的內(nèi)生檸檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）Ls16 和Ls20 菌株具有固氮功能，對水稻秈型品種“華航1 號”具有顯著促生效果[30].分離自印度普通野生稻莖部的內(nèi)生微桿菌Microbacterium laevaniformansRS0111 菌株高 產(chǎn)IAA 和赤霉素，可顯著提高水稻品種“迪昌”（Dichang）的產(chǎn)量[33].本研究篩選到的枯草芽孢桿菌ORS2-5 菌株對多年生稻粳型品種“PR23”和秈型品種“云大107”均具有較好的促生效果，而水稻科薩克氏菌ORL3-1 菌株和路德維希腸桿菌ORS1-2 菌株對“云大107”具有較好的促生效果.說明普通野生稻不同種類的內(nèi)生細菌對水稻品種具有寄主選擇性.枯草芽孢桿菌是目前商業(yè)化最為成功的生防微生物之一，在多種單子葉和雙子葉作物上均具有良好的促生和防病效果[34].水稻科薩克氏菌和路德維希腸桿菌在水稻生防方面的研究還較少.因此深入研究不同種類內(nèi)生細菌介導(dǎo)的促生機制和寄主選擇性，將有助于定向改善水稻對環(huán)境的適應(yīng)性及其生產(chǎn)力，為水稻生物育種及增產(chǎn)提供新途徑.

植物種子內(nèi)生菌群是建立植物內(nèi)生菌群的基礎(chǔ)，種子內(nèi)生菌群能夠隨著種子萌發(fā)轉(zhuǎn)移至幼苗，促進寄主生長發(fā)育[35].本研究采用菌株浸種和拌土方法構(gòu)建多年生稻種子內(nèi)生菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，路德維希腸桿菌ORS1-2 菌株浸種和拌土處理對多年生稻的促生效果存在顯著差異，這可能是由于兩種處理對該菌株的定殖效果存在一定影響.因此，針對不同菌株不僅需考慮其寄主選擇性，還需采取適宜的接種方法，才能建立有效的促生微生態(tài).本研究篩選的促生菌株將為多年生稻生態(tài)菌肥提供菌種資源，搭配合理的播種和田間管理措施，可精準培育“多年生稻-微生物共生體”.未來還需深入分析促生菌株的大田長期效應(yīng)及其對多年生稻農(nóng)業(yè)生態(tài)的影響，構(gòu)建“促生微生物組”，助力多年生稻綠色輕簡化的生產(chǎn)模式.