酮體代謝相關(guān)基因ACAT1表達(dá)對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響

范博皓 曾 源 黃永勝 顧剛利 劉 釗 閻 磊

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科，山東 濟(jì)南 250012

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率已位居所有惡性腫瘤的前10 位，雖然其死亡率在部分發(fā)達(dá)國(guó)家有所下降，但在大多數(shù)國(guó)家仍居高不下［1］。BCa的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，吸煙和高齡是已經(jīng)證實(shí)的高危因素［2］。研究證實(shí)，飲食結(jié)構(gòu)可以影響B(tài)Ca 的生存和進(jìn)展［3-4］。生酮飲食是指碳水化合物含量非常低、蛋白質(zhì)含量適中、脂肪含量高的飲食，旨在誘導(dǎo)酮病或酮體的產(chǎn)生。酮體作為生酮飲食的代謝產(chǎn)物，共包含3 種，分別是20%的乙酰乙酸、2%的丙酮和78%的β-羥丁酸。酮體除了可以為機(jī)體某些器官（如心臟、大腦、肌肉等）快速提供能量，還可通過(guò)改變基因表達(dá)、細(xì)胞表面受體激活和組蛋白修飾，在代謝性疾病中發(fā)揮表觀遺傳學(xué)作用［5］。研究表明，酮體可以抑制結(jié)直腸癌、肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［6-7］，為腫瘤的治療提供了新的理論指導(dǎo)和方向。

ACAT1編碼乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶1（acetyl coenzyme A acetyltransferase 1，ACAT1），在酮體生成的第一步能夠可逆性地將乙酰輔酶A 合成為乙酰乙酰輔酶A。ACAT1被發(fā)現(xiàn)與阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤的發(fā)生有關(guān)［8］。研究表明，胰島素可以通過(guò)上調(diào)ACAT1進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展［9］。研究表明，ACAT1的聚集可能促進(jìn)上皮性卵巢癌的進(jìn)展［10］。然而目前尚缺乏關(guān)于ACAT1對(duì)于BCa 發(fā)生、發(fā)展影響的研究。本研究旨在通過(guò)對(duì)癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中BCa 的表達(dá)和臨床信息數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，評(píng)估ACAT1基因在BCa 中的表達(dá)和對(duì)預(yù)后的意義，并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證ACAT1在膀胱癌進(jìn)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和整理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal. gdc. cancer.gov/）中下載BCa 表達(dá)數(shù)據(jù)，包含409 個(gè)BCa 樣本和19個(gè)正常樣本，應(yīng)用R軟件包“DEseq2”對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異表達(dá)分析；在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）中篩選出GSE199515和GSE13507 2個(gè)數(shù)據(jù)集，對(duì)二者進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，篩選差異表達(dá)基因。3 組差異基因繪制韋恩圖，最終篩選出BCa差異表達(dá)的基因。

1.2 基因篩選

通過(guò)檢索PubMed 篩選出酮體代謝相關(guān)基因。對(duì)目標(biāo)基因通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/gp/index. html#/main/step1）進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）富集分析驗(yàn)證。BCa 差異表達(dá)基因與酮代謝基因取交集，得到目的基因。

1.3 酮體相關(guān)BCa表達(dá)差異基因在泛癌中的表達(dá)

通過(guò)TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//timer. cistrome.org/）對(duì)篩選出的酮體代謝相關(guān)BCa 表達(dá)差異基因在多種癌癥中觀察其表達(dá)差異。

1.4 酮體代謝相關(guān)BCa差異基因的生存分析

在HAP數(shù)據(jù)庫(kù)中收集ACAT1在BCa中表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)，并使用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)繪制不同臨床特征下BCa 中ACAT1表達(dá)的柱狀圖，同時(shí)通過(guò)Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，觀察ACAT1表達(dá)對(duì)BCa生存預(yù)后的影響。進(jìn)一步通過(guò)TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BCa表達(dá)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素Cox回歸分析，檢驗(yàn)ACAT1是否可以獨(dú)立影響B(tài)Ca預(yù)后。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析

通過(guò)TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析BCa中ACAT1表達(dá)與CD4+ T 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及單核細(xì)胞6 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。

1.6 ACAT1低表達(dá)模型構(gòu)建

訂購(gòu)小干擾RNA（SiRNA1 序列為5′-GCUGAAUAUUGCACGAAAUttAUUUCGUGCAAUA UUCAGC-3′；SiRNA2序列為5′-CAGGACGCUUAUG CUAUUAttUAAUAGCAUAAGCGUCCUG-3′），選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的T24 細(xì)胞，采用非脂質(zhì)體陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑polyfast（MedChemExpress，美國(guó)）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。小干擾凍干粉瞬離后用125 μL DEPC-H2O溶解，震蕩混勻后瞬離。棄掉舊的培養(yǎng)基，PBS洗滌6孔板中細(xì)胞2次，隨后加入1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入3 μL polyfast 試劑和2 μL 小干擾RNA 混合試劑，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.7 ACAT1生物學(xué)功能驗(yàn)證

細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后，進(jìn)行CCK8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞活性和增殖能力；使用克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的集落形成能力；使用劃痕試驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力；使用含有基質(zhì)膠的Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對(duì)比BCa和正常膀胱組織之間的ACAT1表達(dá)差異。預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 分析、多因素Cox 回歸分析。計(jì)量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，如符合正態(tài)分布，兩組間比較則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較選用χ2檢驗(yàn)。圖形及組間差異計(jì)算使用GraphPad Prism8.0 軟件繪制和分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 酮體代謝相關(guān)的BCa差異表達(dá)基因篩選

應(yīng)用R 軟件包“edgeR”對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的BCa表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，得到4 193個(gè)差異基因。應(yīng)用“GEO2R”在線對(duì)數(shù)據(jù)集GSE199515 和GSE13507 進(jìn)行基因差異分析，分別篩選出1 143 個(gè)和996 個(gè)差異表達(dá)基因，（P< 0.05，logFC > 1）。對(duì)3 組差異基因應(yīng)用在線軟件“Venn Diagram”繪制韋恩圖，最終篩選出BCa中76個(gè)差異表達(dá)的基因。通過(guò)PubMed 輸入關(guān)鍵詞“酮體代謝”“酮體”“生酮飲食”等進(jìn)行檢索，篩選出酮體代謝相關(guān)基因15個(gè)，分別為ACAA1、ACAA2、ACAT1、ACAT2、HADHA、HADHB、ACSS2、HMGCS2、HMGCL、BDH1、OXCT1、GLUT1、TKTL1、SLC16A1、SLC16A7。并對(duì)篩選出的基因利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的基因富集在酮體代謝相關(guān)通路（圖1A）。最后對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因與酮體代謝相關(guān)基因取交集得到1個(gè)酮體代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因，即ACAT1。

圖1 酮體代謝相關(guān)膀胱癌差異基因篩選

2.2 ACAT1在BCa中的表達(dá)量低于膀胱正常組織

通過(guò)TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ACAT1在多種癌癥中進(jìn)行Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BCa 組織中ACAT1的表達(dá)較正常膀胱組織低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖1B。

2.3 ACAT1高表達(dá)可能是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的免疫組織化學(xué)染色提示，ACAT1在正常組織中的表達(dá)高于BCa（圖2A）。使用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)分析ACAT1與BCa不同臨床性狀之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ACAT1的表達(dá)與BCa的性別、年齡、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（P< 0.01），見圖2B。通過(guò)Kaplan-Meier方法繪制生存曲線顯示，高表達(dá)ACAT1患者總體生存率低于低表達(dá)患者（P< 0.01）。進(jìn)一步通過(guò)TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BCa 表達(dá)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素COX回歸分析提示，高表達(dá)ACAT1生存率顯著低于低表達(dá)患者（P< 0.01），見圖2C。

圖2 ACAT1對(duì)膀胱癌分期和預(yù)后的影響

2.4 ACAT1 在BCa 中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)大致呈正相關(guān)

基于TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，ACAT1的表達(dá)和腫瘤純度之間呈負(fù)相關(guān)（r= ?0.335，P<0.001）。但ACAT1的表達(dá)與部分免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間呈正相關(guān)，其相關(guān)性和差異性為：CD8 + T 細(xì)胞（r= 0.242，P< 0.001）、肥大細(xì)胞（r= 0.257，P<0.001）、中性粒細(xì)胞（r= 0.214，P< 0.001）、巨噬細(xì)胞（r= 0.283，P< 0.001）。

2.5 敲減ACAT1促進(jìn)BCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

qPCR 及Western blot 結(jié)果表明，si-ACAT1-1有更高的敲減效率（圖3A，B），此序列被用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，敲減ACAT1能顯著提高T24細(xì)胞的增殖能力（圖3C）和克隆形成能力（圖3D）。此外，ACAT1的敲減還能提高T24 細(xì)胞的遷移（圖3H）和侵襲能力（圖3F）。

圖3 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ACAT1對(duì)膀胱癌增殖、遷移和侵襲能力的影響

3 討 論

在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，BCa 發(fā)病率僅次于前列腺癌［11］。無(wú)痛性血尿是BCa 最常見的臨床表現(xiàn)［12-13］。大約75%的BCa 患者發(fā)現(xiàn)患病時(shí)是非肌層浸潤(rùn)性BCa［14］，而其余25% ～ 30%的患者，BCa 已侵入膀胱壁更深層次，稱為肌層浸潤(rùn)性BCa。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)是治療非肌層浸潤(rùn)性BCa 的主要方法，而根治性膀胱切除術(shù)一般用于治療肌層浸潤(rùn)性BCa。為了防止復(fù)發(fā)，膀胱腫瘤切除術(shù)在特定的患者中需要輔以膀胱內(nèi)灌注［15］。盡管手術(shù)方面有了很多改進(jìn)，圍手術(shù)期化療、免疫治療也得到了廣泛應(yīng)用，但晚期BCa的預(yù)后仍然很差。

ACAT 是一種細(xì)胞內(nèi)特有的酶，可以利用游離膽固醇生成膽固醇酯，在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［16］。在真核生物中，有2 個(gè)基因（ACAT1和ACAT2）編碼ACAT。ACAT1無(wú)處不在，在各種組織和細(xì)胞類型中表達(dá)，包括肝細(xì)胞、腎上腺、神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞和腸道的Kupffer 細(xì)胞，而ACAT2表達(dá)具有較強(qiáng)的特異性，只存在于腸絨毛的頂端，與腸道吸收膽固醇有關(guān)［17］。在禁食或饑餓狀態(tài)下，ACAT1可以催化2分子的乙酰輔酶A形成乙酰乙酰輔酶A進(jìn)入酮體生成過(guò)程［18］。近年來(lái)，酮體及其代謝相關(guān)酶在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中的作用逐漸受到人們的重視，例如，在肝癌中，3‐羥基丁酸脫氫酶1(3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1,BDH1) mRNA 低表達(dá)的患者生存率和預(yù)后較差［19］。此外，3-琥珀酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶1 (3-oxoacid coenzyme A transferase 1,OXCT1)通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的吉西他濱耐藥［20］。研究表明，過(guò)表達(dá)ACAT1/2 和OXCT1/2 可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖［21］。除此之外，ACAT1在前列腺癌組織中的表達(dá)較良性前列腺增生組織顯著增加［22］。在腎透明細(xì)胞癌中，ACAT1的上調(diào)與腎透明細(xì)胞癌的增殖和侵襲呈負(fù)相關(guān)［18］。然而，ACAT1在BCa 中是否發(fā)揮作用，還未見研究報(bào)道。

本研究在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出BCa中具有差異表達(dá)的基因，與通過(guò)文獻(xiàn)檢索收集到的酮體代謝相關(guān)基因取交集得到ACAT1。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析了ACAT1在BCa 中表達(dá)量高于正常膀胱組織，且ACAT1表達(dá)與BCa 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)大致呈正相關(guān)，提示ACAT1可能在腫瘤免疫中發(fā)揮作用，這也是研究BCa 對(duì)免疫治療敏感性方向的一個(gè)潛在切入點(diǎn)。本研究表明，敲低ACAT1可以促進(jìn)BCa 的增殖、遷移和侵襲，因此認(rèn)為ACAT1可以抑制BCa的發(fā)生和發(fā)展。然而，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中ACAT1高表達(dá)的BCa 患者比ACAT1低表達(dá)的患者有著更差的預(yù)后。對(duì)于這種功能和預(yù)后結(jié)果的不一致性，本研究認(rèn)為原因可能有以下幾點(diǎn)：首先，ACAT1在酮體代謝過(guò)程中發(fā)揮雙向的作用，它既可以促進(jìn)酮體的生成，也可以加速酮體的利用，其中的機(jī)制復(fù)雜且尚未完全闡明；其次，ACAT1除了參與酮體代謝途徑外，還可以參與膽固醇的代謝、脂肪酸的代謝等多種途徑和通路，具體的代謝通路及參與其中的小分子調(diào)控物質(zhì)尚不清楚；再者，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中ACAT1的表達(dá)是基于RNA水平，而基因發(fā)揮作用是依賴蛋白水平，各種轉(zhuǎn)錄、翻譯等階段的修飾也是導(dǎo)致RNA 和蛋白水平表達(dá)不一致的潛在原因。因此，下一步將納入BCa 臨床標(biāo)本，在蛋白水平檢測(cè)ACAT1的表達(dá)，研究其作為預(yù)后指標(biāo)的潛在意義。并納入更多的細(xì)胞系、動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證ACAT1在BCa發(fā)生進(jìn)展中的作用及下游調(diào)控機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突