HMGB1與HMBOX1的高表達(dá)在結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估中的作用

王寶良,陳鐵良,吳家劍,董智剛,楊立群

(唐山市協(xié)和醫(yī)院,1.病理科;2.普通外科;3.麻醉科;4.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科;5.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院普通外科,河北 唐山 063000)

結(jié)直腸癌是源于大腸腺上皮的惡性腫瘤,可發(fā)生在各段大腸,是常見的惡性腫瘤之一。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,中國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率處于較高水平,在所有的癌癥中發(fā)病率位居第五[1]。目前對(duì)于結(jié)直腸癌,手術(shù)切除病灶并以放療、化療作為輔助治療是最主要的治療方式。結(jié)直腸癌的發(fā)生主要是由于物理、化學(xué)、病毒等因素導(dǎo)致的致癌、致畸變,在該過程中同時(shí)涉及原癌基因的激活及抑癌基因的失活[2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是比較有代表性的腫瘤相關(guān)基因,與細(xì)胞增生、分化、遷移有關(guān)[3]。相關(guān)研究[4]表明,結(jié)直腸癌患者癌組織中HMGB1的高表達(dá)可使患者病灶內(nèi)免疫淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯,且患者的生存時(shí)間相對(duì)縮短。核轉(zhuǎn)錄因子1(homeobox-containing 1,HMBOX1)是一種新型轉(zhuǎn)錄抑制因子,可參與DNA損傷修復(fù),在機(jī)體多種正常組織中均有表達(dá),可控制細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及自我更新[5]。本研究欲采用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者癌組織及遠(yuǎn)端結(jié)直腸組織HMGB1與HMBOX1的表達(dá)情況,探討HMGB1與HMBOX1的高表達(dá)在結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年11月唐山市協(xié)和醫(yī)院收治的96例結(jié)直腸癌切除術(shù)患者作為研究對(duì)象。其中男性49例,女性47例;年齡(71.50±3.67)歲;原發(fā)位置為右半結(jié)腸者25例,左半結(jié)腸者32例,直腸39例;TNM分期I～I(xiàn)I期60例,III～I(xiàn)V期36例;T1～T2者52例,T3～T4者44例;N0～N1者80例,N2者16例;高分化和中分化59例,低分化37例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者組織病理活檢確診為結(jié)直腸癌;所有病理切片均由本院兩名病理醫(yī)師復(fù)核證實(shí);(2)臨床治療遵守NCCN指南原則[6];(3)患者腫瘤均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;(4)患者臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者術(shù)前接受放療或化療;(2)由于除腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以外的原因死亡。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化

1.2.1 檢測(cè)儀器及試劑 脫水機(jī)(賽默飛)、包埋機(jī)(徠卡)、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(徠卡)、展片機(jī)(愛華)、烤片機(jī)(愛華)、生物顯微鏡(奧林巴斯)。HMGB1兔多克隆抗體(上海碧云天),HMBOX1兔多克隆抗體(上海酶聯(lián)),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)(上海碧云天)。

1.2.2 檢測(cè)方法 采集患者適量正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織,經(jīng)固定、洗滌、脫水、包埋后制作石蠟切片,切片厚度為4 μm。然后行免疫組織化學(xué)染色:將石蠟切片依次經(jīng)二甲苯與梯度酒精中脫蠟至水,蒸餾水沖洗后,加入3% H2O2浸泡10 min,除去內(nèi)源性的過氧化氫酶;棄H2O2后使用蒸餾水中洗兩次,再加入14%檸檬酸緩沖液,加熱暴露抗原位點(diǎn);冷卻至室溫,蒸餾水洗,PBS浸泡5 min×2次;加入5%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉,室溫孵育 10 min;滴加一抗(HMGB1:1∶200;HMBOX1∶1∶200),4 ℃冰箱中保存過夜;PBS沖洗5 min×3次,擦干組織周圍的PBS后滴加二抗,然后置于37 ℃溫箱中30 min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG(H+L)(1∶1 000)37 ℃ 孵育 30 min;PBS沖洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加DAB顯色劑顯色15 min;將顯色后的片子用清水沖洗并浸泡于蘇木精中10 min,復(fù)染后脫水、透明、中性樹脂封片,每張切片選取10個(gè)200×鏡下視野,由我院兩名專業(yè)的病理醫(yī)師鏡檢判斷HMGB1與HMBOX1表達(dá)狀況。

1.2.3 結(jié)果評(píng)分及分組 (1)評(píng)估 HMGB1染色:陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比評(píng)分:0%～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分;染色強(qiáng)度評(píng)分:細(xì)胞無著色=0分,呈淡黃色=1分,呈黃色=2分,呈棕黃色=3分。最終免疫評(píng)分=平均陽性細(xì)胞率+細(xì)胞著色強(qiáng)弱得分,0～4分納入HMGB1 低表達(dá)組,5～7分納入HMGB1 高表達(dá)組[7]。(2)評(píng)估 HMBOX1染色:陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比評(píng)分:0%為0分,1%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～100%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分:細(xì)胞無著色=0分,呈淡黃色=1分,呈黃色=2分,呈棕黃色=3分。最終免疫評(píng)分=染色百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分,0～4分納入HMBOX1低表達(dá)組;6～9分納入 HMBOX1高表達(dá)組[6]。

1.3 臨床資料收集及隨訪

收集所選取的96例結(jié)直腸癌患者的性別、年齡等一般臨床資料,采用 TNM分期(第8版)[8]對(duì)術(shù)后所得的病理組織切片進(jìn)行評(píng)估確定各患者腫瘤TNM 分期及分級(jí)。在患者術(shù)后出院,采取門診或電話方式對(duì)患者病情進(jìn)行持續(xù)跟蹤,隨訪頻次為3～6個(gè)月/次,隨訪時(shí)間為5年。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用 [n(%)]表示,組間比較采用獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn);采用交叉列聯(lián)表分析結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)的相關(guān)性;生存時(shí)間采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank法比較兩組患者的生存率;Cox回歸綜合生存分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示,HMGB1與HMBOX1在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),在個(gè)別正常的結(jié)直腸組織中弱表達(dá),但在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量升高,免疫組化染色呈陽性。依據(jù)免疫組化結(jié)果將96例結(jié)直腸癌患者分為蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組,其中HMGB1高表達(dá)組60例、低表達(dá)組36例;HMBOX1高表達(dá)組55例、低表達(dá)組41例。見圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者中低分化程度者HMGB1高表達(dá)率較高(P<0.05),不同性別、年齡、原發(fā)位置、TNM分期、T分類、N分類等患者HMGB1高表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);HMBOX1高表達(dá)與患者年齡、結(jié)直腸癌TNM分期及分化程度有關(guān),其中年齡越低、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ及分化程度為低分化者HMBOX1高表達(dá)率較高(P<0.05),不同性別、原發(fā)位置、T分類、N分類、M分類HMBOX1高表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)的相關(guān)性

采用交叉表分析結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1均高表達(dá)占73.33%,HMGB1與HMBOX1均低表達(dá)的占69.44%,(r=0.419,P<0.05),因此,結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)相關(guān)。見表2。

表1 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

表2 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.4 結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達(dá)與患者預(yù)后間的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示,HMGB1高表達(dá)組第3、5年的總生存率分別為:56.7%、33.3%,HMGB1低表達(dá)組第3、5年的總生存率分別為:80.6%、55.6%;HMGB1高表達(dá)組第3、5 年的無瘤生存率分別為:36.7%、33.3%,HMGB1低表達(dá)組第3、5年的無瘤生存率分別為:61.1%、55.6%,均高于HMGB1高表達(dá)組(χ2=5.415,4.571,P<0.05);HMBOX1高表達(dá)組第3、5年的總生存率分別為:50.9%、27.3%,HMBOX1低表達(dá)組第3、5年的總生存率分別為:85.4%、61.0%,均高于HMBOX1高表達(dá)組(χ2=12.363,10.978,P<0.05);HMBOX1高表達(dá)組第3、5年的無瘤生存率分別為:28.1%、27.3%,HMBOX1低表達(dá)組第3、5年的無瘤生存率分別為:68.3%、60.4%,均高于HMBOX1高表達(dá)組(χ2=14.540,10.978,P<0.05)。見圖2。

2.5 結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析結(jié)果顯示,TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、T分級(jí)為T3～T4、N分級(jí)為N2、HMGB1高表達(dá)與HMBOX1高表達(dá)均為結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的影響因素(P<0.05);多因素分析結(jié)果顯示,T分級(jí)為T3～T4、N分級(jí)為N2與HMBOX1高表達(dá)為結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05)。見表3。

表3 單因素和多因素Cox 回歸綜合生存分析

3 討論

現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為[9],結(jié)直腸癌的發(fā)病主要與患者的年齡、生活方式、環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳因素等相關(guān)。在多種因素的相互作用下,原發(fā)灶部位細(xì)胞由于原癌基因的激活、抑癌基因的抑制、DNA甲基化及錯(cuò)配修復(fù)等機(jī)制發(fā)生癌變[10],在該癌變過程中,多種關(guān)鍵因子表達(dá)異常,參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖與遷移。本研究通過免疫組化法檢測(cè)各患者結(jié)直腸癌組織及遠(yuǎn)端結(jié)直腸組織HMGB1與HMBOX1的表達(dá),分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后差異,為臨床結(jié)直腸癌的治療與預(yù)后評(píng)估提供一定的理論基礎(chǔ)。

HMGB1是一組非組蛋白,可參與腫瘤的形成與機(jī)體的炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化及遷移等。低表達(dá)HMGB1可有效促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及上皮-間質(zhì)化,具有作為臨床結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)和指標(biāo)。相關(guān)研究[11]表明,結(jié)直腸癌患者癌組織中HMGB1的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),且HMGB1陽性表達(dá)患者的生存時(shí)間相對(duì)縮短。本研究結(jié)果顯示,HMGB1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平較正常的結(jié)直腸組織升高,且HMGB1高表達(dá)與患者結(jié)直腸癌分化程度相關(guān)(P<0.05),HMGB1高表達(dá)組第3、5年的總生存率及無瘤生存率均低于HMGB1低表達(dá)組,與已有研究[11]結(jié)果相符。其機(jī)制可能為HMGB1高表達(dá)能夠一定程度影響GSK3β的活化,使GSK3β下游靶基因c-Myc靶向調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移[12],加速腫瘤進(jìn)展,最終導(dǎo)致患者生存率降低。

HMBOX1可參與DNA損傷修復(fù),是該過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子,可表達(dá)于機(jī)體多種正常組織中,但具有不同的表達(dá)模式和異質(zhì)性,同時(shí)在胃癌組織[13]、肝癌組織、卵巢癌中均有表達(dá)。相關(guān)研究[14]表明,HMBOX1的表達(dá)水平與肝癌臨床TNM分期呈負(fù)相關(guān)。HMBOX1可增加內(nèi)源性自噬標(biāo)志物 LC3 II/LC3 I比率,抑制p38/AKT/mTOR通路。此外,HMBOX1過表達(dá)還可抑制癌癥干細(xì)胞CD133、KLF4、ESG1和SOX2等特異性基因,使其表達(dá)下調(diào)。同樣有研究[15]表明,HMBOX1在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中的下調(diào),可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有效下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),上調(diào)促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bad、Bax的表達(dá)和凋亡執(zhí)行者Caspase-3及P53的表達(dá)。本研究顯示,HMBOX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平較正常的結(jié)直腸組織升高(P<0.05),HMBOX1高表達(dá)與年齡、患者結(jié)直腸癌TNM分期及分化程度相關(guān)(P<0.05)。HMBOX1高表達(dá)組第3、5年的總生存率及無瘤生存率低于HMBOX1低表達(dá)組,與已有研究[16]結(jié)果相符。同時(shí)本研究分析發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1高表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。且Cox回歸分析結(jié)果顯示,HMBOX1高表達(dá)為結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。推測(cè)HMBOX1高表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,抑制癌細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)病灶生長(zhǎng),最終加速腫瘤的復(fù)發(fā)與生存時(shí)間的縮短。

綜上,HMGB1高表達(dá)與患者結(jié)直腸癌分化程度相關(guān),HMBOX1高表達(dá)與患者年齡、結(jié)直腸癌TNM分期及分化程度相關(guān),且HMGB1與HMBOX1的高表達(dá)具有相關(guān)性,其高表達(dá)時(shí)患者生存時(shí)間減少,可作為患者術(shù)后預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。但本研究中所選取的樣本量較少,對(duì)于HMGB1與HMBOX1表達(dá)的相關(guān)性、與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性及對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素分析均缺乏較強(qiáng)的說服力,且免疫組化檢測(cè)HMGB1與HMBOX1表達(dá)量不夠準(zhǔn)確,之后將擴(kuò)大樣本量及運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附或蛋白免疫印跡等更為準(zhǔn)確的蛋白檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化,以此研究為基礎(chǔ)做更加深入的研究。