蒸餾水處理對(duì)體外人晶狀體上皮細(xì)胞活性的抑制作用

張文文 張榮沛 劉亞軍 何自芳 張司 解正高

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院眼科,南京 210008;2大連醫(yī)科大學(xué)研究生院,大連 116044

晶狀體囊膜混濁是白內(nèi)障術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥,其中前囊膜混濁可導(dǎo)致晶狀體前囊收縮和人工晶狀體(intraocular lens,IOL)偏移[1],后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO)可導(dǎo)致視力明顯下降[2]。成人白內(nèi)障術(shù)后3～5年P(guān)CO的發(fā)生率為20%～30%[3],兒童的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)比成人的增生和遷移能力更強(qiáng)[4],兒童白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊膜混濁的發(fā)生率接近100%,對(duì)視力發(fā)育有嚴(yán)重影響[5]。晶狀體囊膜混濁的治療方法主要是Nd:YAG激光囊膜切開(kāi)或行囊膜切開(kāi)術(shù),前者相對(duì)簡(jiǎn)單,但術(shù)后仍有發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[3,6],后者是一種侵入性方法。因此,預(yù)防白內(nèi)障術(shù)后囊膜混濁的研究具有重要臨床意義。研究認(rèn)為,白內(nèi)障術(shù)后囊膜混濁與手術(shù)創(chuàng)傷刺激引起晶狀體周圍和赤道部殘留LECs的增生、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān)[7]。目前,預(yù)防白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊膜混濁的研究主要集中在2個(gè)方面:(1)抑制LECs的增生、遷移和EMT,如白藜蘆醇藥物的應(yīng)用等以及植入疏水性銳邊IOL或厚的囊內(nèi)開(kāi)口環(huán)以抑制LECs向后囊的遷移[8-10],但LECs仍殘留在囊袋內(nèi),無(wú)法消除PCO發(fā)生的機(jī)制[11];(2)采用藥物和手術(shù)結(jié)合的方法,盡可能清除囊膜中殘留的LECs[12-13]。然而,許多藥物對(duì)眼內(nèi)組織的潛在毒性作用限制了其臨床應(yīng)用[14-15]。研究表明,蒸餾水局部應(yīng)用的低滲透壓特性可誘導(dǎo)晶狀體囊膜上LECs溶解,而對(duì)眼內(nèi)組織無(wú)化學(xué)毒性,且可通過(guò)平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS)快速中和[16],推測(cè)其具有預(yù)防白內(nèi)障術(shù)后囊膜上殘留LECs活性作用,但目前相關(guān)人體臨床試驗(yàn)結(jié)果存在分歧,蒸餾水對(duì)LECs的影響及最佳作用時(shí)間也不完全清楚。本研究以年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)患者的分離前囊膜作為實(shí)驗(yàn)樣本,探討蒸餾水對(duì)LECs活性是否具有抑制作用及其聯(lián)合BSS對(duì)LECs是否具有清除作用,為臨床工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1晶狀體囊膜標(biāo)本的收集 納入2020年5—12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院確診為ARC并行超聲乳化白內(nèi)障吸除聯(lián)合IOL植入術(shù)的患者156例156眼,于術(shù)中收集晶狀體前囊膜組織標(biāo)本?；颊吣挲g50～95歲,平均(69.40±11.52)歲;男81例,女75例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥50歲;(2)最佳矯正視力≤0.3;(3)晶狀體囊膜相對(duì)完整、直徑為5.0～5.5 mm。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<50歲;(2)有眼部外傷史;(3)術(shù)中晶狀體囊膜破碎;(4)晶狀體囊膜直徑<5.0 mm;(5)囊膜污染者;(6)有其他內(nèi)眼手術(shù)史者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):2019-248-01)。所有患者均了解本研究的方法和目的,同意獲取其生物樣本用于實(shí)驗(yàn)研究,并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑及儀器 錐蟲(chóng)藍(lán)染色液(C0040)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%組織細(xì)胞固定液(P1110)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%Gluta固定液(P1126)(北京索萊寶科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(Gibco 10010023)(上海麥克林生化有限公司);伊紅染色液(R20570,上海源葉生物科技有限公司);BSS(美國(guó)Alcon公司);蒸餾水(滅菌注射用水)(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司);二甲苯(10023418)、無(wú)水乙醇(100092683)(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);鋨酸(分析純)、環(huán)氧樹(shù)脂(Epon618)(美國(guó)Sigma公司)。計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(OLYMPUS cellSens Entry)(日本奧林巴斯公司);OLYMPUS BX43光學(xué)顯微鏡(南京奧力科學(xué)儀器有限公司);脫水機(jī)(Donatello,意大利DIAPATH公司);包埋機(jī)(JB-P5)、凍臺(tái)(JB-L5)(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(jī)(RM2016,上海Leica儀器有限公司);組織攤片機(jī)(KD-P,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);烤箱(GFL-230,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司);防脫載玻片(Servicebio)(北京索萊寶科技有限公司);透射電子顯微鏡(JEOL JEM-1010,日本電子公司);透射電子顯微鏡制樣機(jī)(EM AMW,德國(guó)LEICA公司);超薄切片機(jī)(POWERTOME XL,美國(guó)RMC公司);手術(shù)顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 將術(shù)中收集到的前囊膜迅速于手術(shù)顯微鏡下分別等分為2小片,共計(jì)312片。(1)采用計(jì)算機(jī)取隨機(jī)數(shù)法選取157片,并使用同種方法將其分為正常對(duì)照組23片、陽(yáng)性對(duì)照組10片、BSS浸泡組61片和蒸餾水浸泡組63片。正常對(duì)照組標(biāo)本無(wú)任何處理;陽(yáng)性對(duì)照組標(biāo)本用4%組織細(xì)胞固定液固定;BSS浸泡組標(biāo)本用BSS分別浸泡1、2、3 min,分別為20、21、20片;蒸餾水浸泡組標(biāo)本用蒸餾水分別浸泡1、2、3 min,分別為20、23和20片,備用。(2)模擬白內(nèi)障手術(shù)中的注吸(irrigation and aspiration,I/A)過(guò)程,采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)法選取125片,以同種方法將其分為BSS浸泡組63片和和蒸餾水浸泡組62片,其中BSS浸泡組中浸泡1 min者20片、浸泡2 min者22片、浸泡3 min者21片;蒸餾水浸泡組中浸泡1 min者20片、浸泡2 min者22片、浸泡3 min者20片。用裝有BSS的瓶子在70 cm高度沖洗1 min,備用。(3)另采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)法選取15片,以同種方法分為5個(gè)組,每組3片,其中正常對(duì)照組不做處理,BSS浸泡組浸泡于BSS中3 min,蒸餾水浸泡組分別浸泡1、2、3 min。處理后固定液固定24 h以上,行蘇木精-伊紅染色,于透射電子顯微鏡下觀察。同樣的分組及處理方法處理樣本15片,置入4 ℃預(yù)冷的固定液中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色法檢測(cè)細(xì)胞活力 將處理的樣本置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%錐蟲(chóng)藍(lán)溶液中1 min;BSS溫和沖洗2次;除陽(yáng)性對(duì)照組外,其余樣本用組織細(xì)胞固定液固定10 min,PBS沖洗3 min,伊紅染色30 s;自來(lái)水輕輕洗滌,室溫下干燥。細(xì)胞活力指標(biāo)的計(jì)算:1.2.1(1)中的157個(gè)樣本小片行錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色后于40倍光學(xué)顯微鏡下拼接成1/2囊膜大小并拍照,400倍光學(xué)顯微鏡下調(diào)整焦距,確認(rèn)細(xì)胞核并進(jìn)行拍照,以計(jì)算細(xì)胞核數(shù)目;辨認(rèn)細(xì)胞輪廓并拍照,以計(jì)算細(xì)胞數(shù)目,每組選擇10個(gè)非重疊圖像。采用ImageJ軟件計(jì)算LECs密度(個(gè)/mm2)、LECs死亡數(shù)(個(gè)/mm2)和LECs死亡率(%)(圖1A～D)。計(jì)算公式如下:

圖1 蒸餾水處理的LECs活性定量分析示意圖(錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色) A:以看清細(xì)胞核為拍照要求,計(jì)算細(xì)胞核數(shù)目(×400,標(biāo)尺=50 μm) B:以看清細(xì)胞輪廓為拍照要求,計(jì)算細(xì)胞輪廓數(shù)目(×400,標(biāo)尺=50 μm) C:死亡LECs的數(shù)量計(jì)數(shù)(×400,標(biāo)尺=50 μm) D:計(jì)算5個(gè)正方形中的LECs數(shù)量(×400,標(biāo)尺=50 μm) E:綠色標(biāo)示部分為剩余的LECs面積(×40,標(biāo)尺=500 μm) F:囊膜總面積(×40,標(biāo)尺=500 μm)

將1.2.1(2)中經(jīng)蒸餾水或BSS浸泡的125個(gè)聯(lián)合BSS沖洗的樣本小片進(jìn)行錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色,40倍光學(xué)顯微鏡下拍照,采用ImageJ軟件計(jì)算LECs脫落百分率(%),LECs脫落百分率(%)=1-處理后的LECs面積/囊膜總面積×100%。以同樣方法計(jì)算1.2.1(1)中157個(gè)樣本小片的LECs脫落百分率(%)(圖1E～F)。

1.2.3光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察各組LECs結(jié)構(gòu)

本文研究了針對(duì)票據(jù)關(guān)鍵區(qū)域的基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的識(shí)別方法,對(duì)CNN網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn),提出了一種改進(jìn)的適用票據(jù)內(nèi)容定位的CNN網(wǎng)絡(luò)。與傳統(tǒng)CNN網(wǎng)絡(luò)相比,本文提取出的多階差分特征,與原圖圖像構(gòu)成5通道圖像特征,有效地挖掘了內(nèi)在特征,并且結(jié)合卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為分類器,發(fā)揮了圖像的多通道優(yōu)勢(shì),使得輸入數(shù)據(jù)包含更多的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)特征,從而減少了加密處理的圖像像素,提高了水印加密的計(jì)算效率。

1.2.3.1光學(xué)顯微鏡下觀察各組LECs結(jié)構(gòu) 將1.2.1(3)中的15個(gè)小片樣本從固定液中取出,在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將組織修理平整,將其與對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽匹配后置于脫水盒內(nèi),于脫水機(jī)內(nèi)依次進(jìn)行梯度乙醇脫水:體積分?jǐn)?shù)75%乙醇4 h,85%乙醇2 h,90%乙醇2 h,95%乙醇1 h,無(wú)水乙醇Ⅰ 30 min,無(wú)水乙醇Ⅱ 30 min,醇苯5～10 min;二甲苯Ⅰ 處理5～10 min,二甲苯Ⅱ處理5～10 min,65 ℃條件下融化石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別1 h,于包埋機(jī)內(nèi),先放入包埋框,待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出,按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于-20 ℃凍臺(tái)冷卻,蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊,用石蠟切片機(jī)切片,厚度為4 μm。切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上,將組織展平鋪于載玻片,60 ℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干蠟烤化后取出,常溫下保存。中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.3.2透射電子顯微鏡下各組LECs超微結(jié)構(gòu)觀察 取1.2.1(3)中處理好的剩余15片標(biāo)本,小心倒掉固定液,用0.1 mol/L、pH 7.0的PBS漂洗3次,每次15 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定樣品1～2 h,用PBS漂洗樣品3次,每次15 min。乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、80%、90%)各15 min,用100%的乙醇處理20 min,純丙酮處理20 min。用體積比1∶1的包埋劑與丙酮液的混合液處理樣品1 h,體積比3∶1的包埋劑與丙酮液的混合液處理樣品3 h,純包埋劑處理樣品過(guò)夜,將處理的樣品包埋,70 ℃加熱過(guò)夜。以超薄切片機(jī)切片,厚度為70～90 nm,經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min,晾干后透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 各組LECs存活情況比較(x±s)Table 1 Comparison of LECs viability among different groups (x±s)組別樣本量LECs密度(個(gè)/mm2)LECs死亡數(shù)(個(gè)/mm2)LECs死亡率(%)正常對(duì)照組233 829.08±519.16263.01±142.857.16±4.28BSS浸泡1 min組204 054.63±489.64280.99±124.247.03±3.14BSS浸泡2 min組213 985.13±687.90292.07±129.357.30±2.76BSS浸泡3 min組204 114.35±503.56318.49±176.667.72±4.02蒸餾水浸泡1 min組203 501.20±281.99bcd1 045.47±496.70abcd29.82±13.83abcd蒸餾水浸泡2 min組233 329.59±370.95abcd1 667.40±517.76abcde50.51±15.83abcde蒸餾水浸泡3 min組202 898.03±845.04abcdef1 956.27±434.45abcdef70.05±15.40abcdefF值13.45998.918130.600P值<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與BSS浸泡1 min組比較,bP<0.05;與BSS浸泡2 min組比較,cP<0.05;與BSS浸泡3 min組比較,dP<0.05;與蒸餾水浸泡1 min組比較,eP<0.05;與蒸餾水浸泡2 min組比較,fP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LECs:晶狀體上皮細(xì)胞;BSS:平衡鹽溶液 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with 1-minute BSS treatment group,bP<0.05;compared with 2-minute BSS treatment group,cP<0.05;compared with 3-minute BSS treatment group,dP<0.05;compared with 1-minute distilled water treatment group,eP<0.05;compared with 2-minute distilled water treatment group,fP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LECs:lens epithelial cells;BSS:balanced salt solution

2 結(jié)果

2.1 單純浸泡處理后各組LECs存活情況比較

正常對(duì)照組前囊LECs呈規(guī)則的多邊形,并有少量LECs死亡。陽(yáng)性對(duì)照組所有細(xì)胞均死亡,視野內(nèi)滿布藍(lán)色細(xì)胞核。BSS浸泡各組LECs邊界清晰,形態(tài)接近正常對(duì)照組。蒸餾水浸泡各組隨時(shí)間延長(zhǎng)LECs逐漸脹大死亡,細(xì)胞邊界不清(圖2)。各組LECs密度、LECs死亡數(shù)和LECs死亡率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.459、98.918、130.600,均P<0.001),其中蒸餾水浸泡2 min和3 min LECs密度均低于正常對(duì)照組,蒸餾水浸泡1、2、3 min組LECs死亡數(shù)和死亡率均高于正常對(duì)照組,蒸餾水浸泡1、2、3 min組LECs死亡數(shù)和死亡率均高于BSS浸泡相同時(shí)長(zhǎng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),蒸餾水浸泡組LECs死亡數(shù)增多,死亡率逐漸升高(表1)。

圖2 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)變化(HE ×400,標(biāo)尺=50 μm) 正常對(duì)照組LECs呈規(guī)則多邊形,并有少量LECs死亡(箭頭);陽(yáng)性對(duì)照組所有細(xì)胞均死亡,視野內(nèi)滿布藍(lán)色細(xì)胞核;BSS浸泡各組LECs邊界清晰,形態(tài)接近正常;蒸餾水浸泡后各組LECs隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸脹大死亡 BSS:平衡鹽溶液

2.2 單純浸泡及聯(lián)合BSS處理后各組LECs脫落情況比較

正常對(duì)照組、BSS浸泡組和BSS浸泡聯(lián)合沖洗組僅檢測(cè)到少量脫落的LECs。蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗組脫落LECs明顯增多,且隨著蒸餾水浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)脫落的LECs增多(圖3)。各組LECs脫落百分率總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=386.287,P<0.001),其中與正常對(duì)照組相比,蒸餾水浸泡1min、2 min和3 min及蒸餾水浸泡1min、2 min和3 min聯(lián)合沖洗組的LECs脫落百分率明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001);BSS浸泡1 min、2 min和3 min及BSS浸泡1 min、2 min和3 min聯(lián)合沖洗組間LECs脫落百分率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。相同浸泡時(shí)間點(diǎn)浸泡聯(lián)合沖洗組LECs脫落率明顯高于蒸餾水浸泡組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

圖3 光學(xué)顯微鏡下各組LECs脫落情況(HE ×400,標(biāo)尺=50 μm) 正常對(duì)照組、BSS浸泡組和BSS浸泡聯(lián)合沖洗組僅檢測(cè)到少量脫落LECs。隨著蒸餾水浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗組LECs脫落增多 ☆:有LECs的區(qū)域;*:沒(méi)有LECs的區(qū)域 BSS:平衡鹽溶液

2.3 各組LECs結(jié)構(gòu)變化

2.3.1光學(xué)顯微鏡下各組LECs結(jié)構(gòu)變化 正常對(duì)照組和BSS浸泡3 min組中可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則及圓形細(xì)胞核的LECs,細(xì)胞呈單層排列并貼附在囊膜上。蒸餾水浸泡2 min組和3 min組LECs的細(xì)胞完整性被破壞,細(xì)胞質(zhì)流出,部分LECs脫落(圖4)。

2.3.2透射電子顯微鏡下各組LECs結(jié)構(gòu)變化 正常對(duì)照組和BSS浸泡3 min組LECs細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核呈圓形或類圓形,核膜完整,核仁清晰,染色質(zhì)分布均勻,亞細(xì)胞器形態(tài)正常,細(xì)胞間連接呈指狀突起,細(xì)胞呈單層排列,貼附于囊膜。蒸餾水浸泡1 min組和2 min組可見(jiàn)細(xì)胞溶解,細(xì)胞核形態(tài)尚規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)破壞,亞細(xì)胞器腫脹,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出細(xì)胞外,細(xì)胞間連接斷裂,細(xì)胞與囊膜間貼附疏松。蒸餾水浸泡3 min組可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出細(xì)胞外,細(xì)胞體積減小,細(xì)胞核變形并可見(jiàn)多處呈銳角狀突起,細(xì)胞質(zhì)破壞,亞細(xì)胞器腫脹,細(xì)胞間連接中斷,細(xì)胞與囊膜部分分離(圖5)。

表2 各組LECs脫落百分率比較(x±s,%)Table 2 Comparison of LECs shedding percentage among various groups (x±s,%)組別樣本量LECs脫落百分率正常對(duì)照組2311.04±4.85BSS浸泡1 min組2010.88±5.65aBSS浸泡2 min組2111.43±4.95aBSS浸泡3 min組2018.80±7.97bc蒸餾水浸泡1 min組2036.40±15.83abcd蒸餾水浸泡2 min組2341.29±17.55abcd蒸餾水浸泡3 min組2046.22±18.88abcdeBSS浸泡聯(lián)合沖洗1 min組2017.77±10.25efgBSS浸泡聯(lián)合沖洗2 min組2219.81±7.37abcefgBSS浸泡聯(lián)合沖洗3 min組2119.07±6.70abcefg蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗1 min組2060.02±14.80abcdefghij蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗2 min組2281.31±13.01abcdefghijk蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗3 min組2094.12±4.86abcdefghijklF值123.670P值<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.001;與BSS浸泡1 min組比較,bP<0.001;與BSS浸泡2 min組比較,cP<0.001;與BSS浸泡3 min組比較,dP<0.001;與蒸餾水浸泡1 min組比較,eP<0.001;與蒸餾水浸泡2 min組比較,fP<0.05;與蒸餾水浸泡3 min組比較,gP<0.05;與BSS浸泡聯(lián)合沖洗1 min組比較,hP<0.05;與BSS浸泡聯(lián)合沖洗2 min組比較,iP<0.05;與BSS浸泡聯(lián)合沖洗3 min組比較,jP<0.05;與蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗1 min組比較,kP<0.05;與蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗2 min組比較,lP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LECs:晶狀體上皮細(xì)胞;BSS:平衡鹽溶液 Note:Compared with normal control group,aP<0.001;compared with 1-minute BSS treatment group,bP<0.001;compared with 2-minute BSS treatment group,cP<0.001;compared with 3-minute BSS treatment group,dP<0.001;compared with 1-minute distilled water treatment group,eP<0.001;compared with 2-minute distilled water treatment group, fP<0.05;compared with 3-minute distilled water treatment group,gP<0.05;compared with 1-minute BSS immersion combined rinse group,hP<0.05;compared with 2-minute BSS immersion combined rinse group,iP<0.05;compared with 3-minute BSS immersion combined rinse group,jP<0.05;compared with 1-minute distilled water immersion combined rinse group,kP<0.05;compared with 2-minute distilled water immersion combined rinse group,lP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LECs:lens epithelial cells;BSS:balanced salt solution

圖 4 光學(xué)顯微鏡下各組LECs形態(tài)變化(HE ×400,標(biāo)尺=50 μm) 蒸餾水浸泡1、2和3 min組細(xì)胞完整性破壞,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流;蒸餾水浸泡2 min和3 min組部分LECs脫落 AC:前囊膜;1:正常LECs;2:細(xì)胞溶解;3:LECs脫落 BSS:平衡鹽溶液

圖5 透射電子顯微鏡下各組LECs超微結(jié)構(gòu)變化(檸檬酸鉛+醋酸雙氧鈾 ×8 000,標(biāo)尺=2 μm;×20 000,標(biāo)尺=1 μm) 蒸餾水浸泡1 min、2 min組可見(jiàn)細(xì)胞溶解,細(xì)胞核形態(tài)尚規(guī)則,亞細(xì)胞器腫脹,細(xì)胞間連接中斷,細(xì)胞與囊膜間附著疏松。蒸餾水浸泡3 min組細(xì)胞體積減小,細(xì)胞核變形,亞細(xì)胞器腫脹,細(xì)胞間連接破壞,部分細(xì)胞從囊膜上分離 N:細(xì)胞核;C:細(xì)胞質(zhì);1:正常LECs間連接呈指狀突起;2:正常線粒體;3:正常溶酶體;4:細(xì)胞器腫脹

3 討論

本研究采用錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色和顯微鏡下拍照對(duì)LECs密度、死亡數(shù)和死亡率進(jìn)行了精確計(jì)算和定量分析,更全面地評(píng)估了蒸餾水對(duì)LECs活性的影響[18]?；罴?xì)胞具有排除錐蟲(chóng)藍(lán)的完整細(xì)胞膜,而死亡細(xì)胞則沒(méi)有,基于此原理,錐蟲(chóng)藍(lán)是常用的檢測(cè)細(xì)胞活力的方法之一[19-20]。蘇木精-伊紅染色適合于組織學(xué)分析,伊紅可以將細(xì)胞質(zhì)染成紅色,清晰顯示細(xì)胞輪廓[21-22]。已發(fā)生白內(nèi)障的LECs密度差異很大,平均約為4 000/mm2[23]。本研究正常對(duì)照組LECs密度為(3 829.08±519.16)個(gè)/mm2,與Laspias等[23]的研究結(jié)論相似,因此,本研究計(jì)算方法可認(rèn)為是可靠的。

本研究定量分析顯示,蒸餾水浸泡3 min后LECs死亡率約為70.05%,是蒸餾水浸泡1 min組的2.35倍,這一結(jié)果與Rekas等[24]的蒸餾水浸泡3 min有70.8%的細(xì)胞溶解結(jié)果相似。本研究同時(shí)設(shè)置了正常對(duì)照組及相同作用時(shí)間的BSS組與蒸餾水浸泡組進(jìn)行比較,結(jié)果表明在蒸餾水中浸泡2 min或3 min可有效導(dǎo)致LECs死亡,蒸餾水浸泡3 min的效果最好。但Duncan等[25]的研究中,FHL124細(xì)胞暴露于蒸餾水中2 min后有50%的細(xì)胞存活,這可能與實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)數(shù)方法不同有關(guān)。Rabsilber等[26]研究認(rèn)為,使用蒸餾水處理并不能顯著減輕PCO的發(fā)展,與本研究結(jié)論不同。這可能是由于蒸餾水的作用時(shí)間不足造成的。

白內(nèi)障手術(shù)過(guò)程中,需用I/A沖洗整個(gè)囊袋,以去除晶狀體皮質(zhì)和黏彈劑。因此,可考慮在吸除晶狀體皮質(zhì)后采用蒸餾水聯(lián)合囊袋沖洗,既可以充分發(fā)揮蒸餾水對(duì)LECs的破壞作用,又可以將蒸餾水沖出囊袋,同時(shí)清除與囊膜連接松散的細(xì)胞。本研究中采用70 cm高處BSS沖洗囊膜1 min模擬白內(nèi)障術(shù)中I/A操作,結(jié)果顯示蒸餾水浸泡結(jié)合沖洗有助于LECs清除,最有效的暴露時(shí)間為3 min。有研究認(rèn)為360°前囊膜拋光并不能降低PCO的發(fā)生率[27],這意味著單獨(dú)的機(jī)械前囊膜拋光不能清除囊袋中的所有LECs。而本研究結(jié)果顯示低滲蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗可以有效清除LECs。

為使蒸餾水對(duì)眼內(nèi)其他組織的危害降至最低,可能需要加用保護(hù)措施。密閉囊袋灌洗裝置可暫時(shí)封閉囊袋以保護(hù)眼內(nèi)組織,并可將藥液注入及沖洗出囊袋[6]。R?kas等[28]在人眼白內(nèi)障手術(shù)中吸除晶狀體皮質(zhì)后,借助密閉囊袋灌洗裝置將蒸餾水注入囊袋,停留3 min后沖洗囊袋,結(jié)果顯示該方法可有效降低晶狀體囊膜混濁發(fā)生率。但密閉囊袋灌洗裝置不適用于深前房或小瞳孔者[26],不適合微切口(1.8 mm或2.2 mm)白內(nèi)障手術(shù)[12]。在去除細(xì)胞核和皮質(zhì)抽吸后,Zhang等[12]在玻璃體切割機(jī)輔助下,用空氣和黏彈劑維持前房并封閉囊袋,吸除晶狀體皮質(zhì)后向囊袋注入蒸餾水或BSS,停留3 min后沖洗囊袋,術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)BSS組患者部分發(fā)生晶狀體囊膜混濁,而蒸餾水組患者無(wú)明顯晶狀體囊膜混濁形成。但此方法對(duì)手術(shù)設(shè)備要求高,難以在基層醫(yī)院推廣。蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗可有效清除LECs,從而預(yù)防術(shù)后PCO的發(fā)生,本課題組正在進(jìn)行后續(xù)臨床試驗(yàn),并將介紹一種方便的給藥方式,以便于該方法的廣泛傳播和利用。

細(xì)胞死亡有壞死和凋亡2種方式。壞死是指細(xì)胞受到物理、化學(xué)因素影響后的被動(dòng)死亡,以細(xì)胞質(zhì)膜和核膜破裂、細(xì)胞骨架和核纖層解體為特征。本研究結(jié)果顯示,蒸餾水浸泡可導(dǎo)致LECs死亡并清除LECs。采用蘇木精-伊紅染色后光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,在蒸餾水浸泡2 min和3 min亞組中LECs細(xì)胞溶解被破壞和部分脫落。在Rekas等[24]的研究中,顯微鏡下可偶見(jiàn)基底膜和LECs,與本研究光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果相同。透射電子顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,蒸餾水浸泡組LECs破壞,蒸餾水浸泡1 min組和2 min組細(xì)胞與囊膜之間連接松散,蒸餾水浸泡3 min組LECs與囊膜部分分離。核固縮是細(xì)胞壞死的重要標(biāo)志之一,可以在蒸餾水浸泡3 min組透射電子顯微鏡下觀察到。在每個(gè)處理時(shí)間的蒸餾水組的光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡結(jié)果中可以觀察到細(xì)胞質(zhì)破壞和腫脹,這是細(xì)胞器壞死的另一個(gè)標(biāo)志。因此,可以得出蒸餾水可以導(dǎo)致LECs壞死的結(jié)論。而且本研究結(jié)果表明,蒸餾水不僅可以導(dǎo)致LECs死亡,還可以使細(xì)胞與囊膜之間的連接變得松散,從而使LECs從囊膜上脫落。因此,蒸餾水浸泡組的細(xì)胞脫落百分率升高。這些組織細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)與錐蟲(chóng)藍(lán)-伊紅染色結(jié)果顯示的LECs脫落百分率的結(jié)果相一致。

本研究仍存在一定的局限性:(1)雖然蒸餾水可以導(dǎo)致LECs死亡,但還不足以清除所有LECs;對(duì)此,我們考慮蒸餾水經(jīng)常作為溶劑存在,是否可以嘗試聯(lián)合其他藥物以更充分地破壞LECs?(2)本研究結(jié)果顯示沖洗可以提高細(xì)胞脫落百分率,但并不能達(dá)到百分之百,可能是因?yàn)闆_洗過(guò)程中囊膜的部分折疊。(3)本研究的材料為前囊膜,而赤道部囊膜的LECs形態(tài)和功能與前囊膜并不相同[29],因此,需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探討蒸餾水對(duì)赤道部囊袋LECs的清除效果。(4)蒸餾水處理后LECs的組織病理學(xué)改變顯示細(xì)胞壞死,提示蒸餾水除低滲機(jī)制外還有其他作用機(jī)制。這些方面均有待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)蒸餾水處理后可導(dǎo)致LECs死亡,蒸餾水浸泡聯(lián)合沖洗是清除LECs以預(yù)防白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊膜混濁的有效方法。蒸餾水處理后的細(xì)胞組織病理學(xué)變化提示細(xì)胞壞死是LECs死亡的原因之一。本研究結(jié)果為采用蒸餾水預(yù)防白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊膜混濁提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明張文文:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、文章撰寫(xiě);張榮沛:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析;劉亞軍、何自芳、張司:實(shí)施研究、采集分析數(shù)據(jù);解正高:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、指導(dǎo)研究、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱