鐵死亡在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生機(jī)制和治療中的研究進(jìn)展

張 雨，魏志昊，顏 冰

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，其會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙和畸形，是老年人慢性致殘的主要原因，對(duì)生活質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響[1]。OA可以累及身體的任何關(guān)節(jié)，最常見(jiàn)的部位是膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約3.5 億人正遭受OA 的困擾[2]。盡管中西醫(yī)聯(lián)合治療OA 已經(jīng)在臨床中開(kāi)展應(yīng)用，但迄今為止，并沒(méi)有任何治療方式可以阻止疾病的發(fā)生和發(fā)展，關(guān)節(jié)置換仍是終末期OA 的最有效治療方式。隨著關(guān)節(jié)置換頻率的大幅增長(zhǎng)，同時(shí)假體壽命短、術(shù)后易感染、假體周?chē)钦鄣刃g(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率也在不斷增加[3]。這就需要在OA 的治療早期提供更有效的干預(yù)方式延緩終末期的發(fā)生。2012 年，一種新形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式被首次報(bào)道，即一種鐵依賴性的以脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的細(xì)胞死亡形式，稱為鐵死亡[4]。目前為止，鐵死亡已被證明參與癌癥、炎癥、阿爾茨海默病、帕金森病、腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷等疾病的發(fā)生[5]。鐵死亡相關(guān)基因血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1, HMOX1）在OA 軟骨細(xì)胞中高表達(dá)[6]，且鐵死亡參與OA 的軟骨退化過(guò)程[7-10]。因此，以鐵死亡為切入點(diǎn)研究OA 可能為今后預(yù)防和治療OA 提供新的思路和策略。

1 鐵死亡與OA

OA 過(guò)去被認(rèn)為是一種“磨損”，受累關(guān)節(jié)上過(guò)大的機(jī)械負(fù)荷會(huì)直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞[10]。目前隨著研究的加深，OA 被認(rèn)為是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征包括關(guān)節(jié)軟骨的退化和破壞、軟骨下硬化、骨贅形成、不同程度的滑膜炎癥、膝關(guān)節(jié)韌帶和半月板退化及關(guān)節(jié)囊肥大[11]。其中以軟骨損傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)組織退化是OA 進(jìn)展過(guò)程中的主要原因[12]。軟骨基質(zhì)中不存在血管或神經(jīng)，軟骨細(xì)胞作為軟骨的唯一細(xì)胞成分，通過(guò)分泌膠原蛋白Ⅱ和基質(zhì)降解酶13 來(lái)平衡細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的代謝，以維持關(guān)節(jié)軟骨的完整。OA 的病因包括多種生理和物理因素，包括年齡、性別、肥胖、遺傳、炎癥、代謝因素，甚至ABO 血型等[13]。截止目前，在OA患者和動(dòng)物模型上的軟骨組織中鑒定出多種形式的軟骨細(xì)胞死亡形式，包括細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡、自噬和焦亡等[14]。鐵死亡在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上與其他細(xì)胞死亡過(guò)程截然不同，出現(xiàn)不同于傳統(tǒng)細(xì)胞死亡方式的特征，呈現(xiàn)特有的線粒體變小、膜密度增厚、嵴減少以及生物化學(xué)上的鐵過(guò)載和活性氧（reactive oxygen species, ROS）積累等[15]。

2 鐵死亡發(fā)生機(jī)制與OA

目前針對(duì)鐵死亡發(fā)生機(jī)制的研究主要?dú)w納為以下3 條信號(hào)軸，分別是系統(tǒng)Xc-GSH-GPX4 軸、鐵代謝異常及脂質(zhì)過(guò)氧化，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)述。見(jiàn)圖1。

圖1 鐵死亡的主要信號(hào)機(jī)制和相關(guān)防御通路

2.1 系統(tǒng)Xc-GSH-GPX4 軸 Xc-系統(tǒng)作為一種氨基酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體，有SLC3A2 和SLC7A11 兩個(gè)亞基，對(duì)谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成至關(guān)重要。因此，各種抑制胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都會(huì)使GSH減少，并最終以脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的形式積累ROS 導(dǎo)致鐵死亡。經(jīng)典的鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 可抑制其反轉(zhuǎn)運(yùn)體誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[16]。氧化條件下Xc-系統(tǒng)在細(xì)胞膜外吸收胱氨酸、半胱氨酸，同時(shí)將谷氨酸交換到細(xì)胞膜外。進(jìn)入細(xì)胞的胱氨酸可被GSH還原為半胱氨酸。隨后在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的催化下將全部半胱氨酸轉(zhuǎn)化成GSH。谷胱甘肽通路已被證明是關(guān)鍵的抗氧化防御通路，該軸起核心作用的是脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡的關(guān)鍵抑制因子谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4），其將GSH 轉(zhuǎn)化為氧化谷胱甘肽（oxidized glutathione, GSSG）的同時(shí)把磷脂過(guò)氧化物還原為相應(yīng)的醇，從而達(dá)到解除細(xì)胞過(guò)氧化毒性降低鐵死亡發(fā)生的可能[17]。此過(guò)程可被RAS 選擇性致死小分子3（ras selective lethal small molecule 3,RSL3）抑制。生成的GSSG 又可被谷胱甘肽還原酶利用還原型輔酶Ⅱ （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）還原為GSH，形成循環(huán)。Miao 等[8]發(fā)現(xiàn)OA 患者的軟骨細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性降低，主要功能酶GPX4 較未受損的軟骨下降約50%，GSH 也出現(xiàn)了不同程度的耗竭，并且GSH/GSSG 的水平也降低。Xu 等[18]發(fā)現(xiàn)相比于創(chuàng)傷患者軟骨細(xì)胞，OA 患者軟骨細(xì)胞中GPX4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低，表明軟骨細(xì)胞清除ROS 的能力在OA 中受到很大程度的損害。Wang 等[19]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)機(jī)械超負(fù)荷可誘發(fā)GPX4 相關(guān)的鐵死亡，且敲除軟骨中的GPX4 可加重OA 的進(jìn)展。因此，該軸參與了OA 疾病的發(fā)生和發(fā)展。

2.2 鐵代謝 作為機(jī)體必需的微量元素，鐵參與氧的運(yùn)輸、能量生產(chǎn)、DNA 合成、免疫平衡及新陳代謝等生理過(guò)程[20]。循環(huán)中的Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-1、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 的介導(dǎo)進(jìn)行鐵攝取并釋放到不穩(wěn)定鐵池，同時(shí)在儲(chǔ)鐵蛋白中的鐵也會(huì)通過(guò)核受體共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4, NCOA4）介導(dǎo)的鐵自噬途徑釋放到不穩(wěn)定鐵池。游離的Fe2+催化過(guò)氧化氫產(chǎn)成強(qiáng)氧化性的羥基自由基和氫氧根的過(guò)程，稱為芬頓（Fenton）反應(yīng)。鐵超載狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞內(nèi)的Fe2+與不同的過(guò)氧化物依賴Fenton 反應(yīng)或脂氧化酶（lipoxygenase,LOX）都可產(chǎn)生ROS，從而觸發(fā)對(duì)細(xì)胞及其細(xì)胞器上多不飽和脂肪酸（PUFAs）的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致線粒體功能障礙、細(xì)胞蛋白和核酸損傷，最終導(dǎo)致鐵死亡。年齡已被證明是導(dǎo)致OA 的最大危險(xiǎn)因素，且發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，多項(xiàng)研究表明血清鐵蛋白水平高的人患OA 的風(fēng)險(xiǎn)增加4 倍[7,21-22]。由于老年人體內(nèi)鐵排泄的主要機(jī)制降低，鐵在軟骨細(xì)胞中容易積累并形成羥基自由基[20]。一項(xiàng)用檸檬酸鐵培養(yǎng)牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)erreira 等[23]發(fā)現(xiàn)處理后的軟骨細(xì)胞分解代謝過(guò)度激活，出現(xiàn)膠原蛋白Ⅱ減少和軟骨細(xì)胞的死亡，促使ECM 的降解增多。目前雖然已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)鐵過(guò)載可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化并促進(jìn)OA 的進(jìn)展，但鐵損害軟骨的詳細(xì)分子機(jī)制仍有待更深的了解[24-26]。

2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化 鐵死亡的中心環(huán)節(jié)是鐵依賴性的脂質(zhì)氧化代謝失調(diào)，其與轉(zhuǎn)化成磷脂的花生四烯酸（arachidonic acid, AA）及其衍生物腎上腺素酸（adrenic acid, AdA）的量密切相關(guān)。磷脂?；溨貥?gòu)階段，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的AA 及其衍生物在?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-coA synthetase longchain family member 4, ACSL4）的催化下與輔酶A（coenzyme A，CoA）結(jié)合催化形成衍生物AA-CoA或AdA-CoA，然后被溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3, LPCAT3）酯化為磷脂酰乙醇胺，為脂質(zhì)過(guò)氧化提供關(guān)鍵底物，是鐵死亡的關(guān)鍵一環(huán)。其中ACSL4、LPCAT3 不僅是監(jiān)測(cè)鐵死亡的敏感指標(biāo)，也是導(dǎo)致鐵死亡的重要原因。脂質(zhì)過(guò)氧化包括芬頓反應(yīng)和酶催化兩個(gè)途徑。非酶催化途徑脂質(zhì)過(guò)氧化的啟動(dòng)需要從磷脂上的多不飽和脂肪酸?；忻撊蓚€(gè)碳碳雙鍵之間的雙烯丙基氫原子，形成以碳為中心的磷脂基團(tuán)，再與分子氧迅速反應(yīng)生成磷脂過(guò)氧化自由基。隨后磷脂過(guò)氧化自由基從臨近的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）中提取氫形成磷脂過(guò)氧化物和一個(gè)新的磷脂集團(tuán)，這個(gè)新的磷脂集團(tuán)又可以起始新的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促進(jìn)含PLs 的PUFAs 的自氧化自由基傳播。酶催化的脂質(zhì)過(guò)氧化是由LOX 直接氧化生物膜上的PUFAs 和含PUFA的脂質(zhì)。軟骨細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)如果不能及時(shí)阻止自由基的擴(kuò)增，就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化在細(xì)胞膜上的傳播進(jìn)而發(fā)生鐵死亡，但目前脂質(zhì)過(guò)氧化如何導(dǎo)致細(xì)胞死亡的確切機(jī)制尚不清楚。

3 鐵死亡抑制通路與OA 治療

3.1 傳統(tǒng)GPX4 依賴性通路 系統(tǒng)Xc-GSH-GPX4軸被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中對(duì)抗鐵死亡的主要方式。核因子E2 相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）和kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1, Keap1）作用于Xc-系統(tǒng),是細(xì)胞主要的抗氧化系統(tǒng)。細(xì)胞外高濃度的谷氨酸或小分子抑制劑如Erastin、柳氮磺胺吡啶索拉菲尼等多種藥物可通過(guò)此過(guò)程誘導(dǎo)鐵死亡。其機(jī)制是由于抑制半胱氨酸/胱氨酸攝取或使GPX4 失活引起的，過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致鐵死亡，細(xì)胞中鐵和GSH 的攝入和消耗分別加劇了其表型[27]。腫瘤蛋白P53 不僅是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控原件，也可以通過(guò)下調(diào)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的關(guān)鍵成分SLC7A11 的表達(dá)，抑制胱氨酸攝取從而誘導(dǎo)鐵死亡[28]。去鐵胺（deferoxamine, DFO）是一種有效的鐵螯合劑，已被用于各種疾病的鐵死亡模型的治療。鐵抑素-1 和DFO 可以促進(jìn)Nrf2 的表達(dá)來(lái)維持GPX4/GSH 的功能，降低ROS 和脂質(zhì)ROS 的水平，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化、減少鐵積累，達(dá)到抑制鐵死亡減輕體內(nèi)軟骨退化[8,10,16]。也有研究表明過(guò)量全身鐵的螯合并不能改善關(guān)節(jié)病的癥狀，這表明鐵過(guò)載條件下的關(guān)節(jié)損傷更多地與關(guān)節(jié)組織中的鐵螯合而不是全身鐵水平有關(guān), 這就提示是否可以通過(guò)局部用藥來(lái)更有效地治療OA[29]。然而研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)注射含有槲皮素、DFO 的抗氧化制劑并不會(huì)延緩?fù)砥贠A 的進(jìn)展，這就提示在OA 疾病早期使用可能會(huì)更加有效[30]。研究表明GPX4 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要調(diào)節(jié)膜過(guò)氧化物的水平，進(jìn)而影響LOX 活性影響脂質(zhì)過(guò)氧化。OA 情況下軟骨細(xì)胞中GPX4 的輕微降低可能會(huì)使軟骨細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感并通過(guò)MAPK/NFk 途徑促進(jìn)ECM 的降解加速OA 的進(jìn)展[8]。潛在治療靶點(diǎn)瞬時(shí)受體電位家族香草醛1 型受體（transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1）的激活可以上調(diào)GPX4 來(lái)保護(hù)軟骨細(xì)胞免受鐵死亡并改善OA 的進(jìn)展[31]。LOX 的特異性抑制劑如Vitamin E已被證明可以減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而抑制鐵死亡的發(fā)生[32]。依達(dá)拉奉作為一種自由基清除劑，也在很大程度上抑制了鐵死亡[33]。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，基于傳統(tǒng)通路的中藥學(xué)研究在OA 治療中也有了較大進(jìn)展：在脂多糖誘導(dǎo)的OA 細(xì)胞模型中，淫羊藿苷通過(guò)激活系統(tǒng)Xc-GSH-GPX4 軸，對(duì)GPX4、SLC3A2 和SLC7A11 的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)作用，從而顯著減少誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中的死亡并抑制鐵死亡[34]。牛膝的主要活性成分豆甾醇可通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡減輕白細(xì)胞介素-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷[35]。黃芪中的活性成分鷹嘴豆芽素在OA 中可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 和促進(jìn)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接降低細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度，還可以靶向Nrf2 / system xc-/GPX4信號(hào)通路清除自由基并防止脂質(zhì)過(guò)氧化[36]。在今后的OA 治療中，這將起到至關(guān)重要的作用。

3.2 FSP1-CoQ10-NADPH 通路 GPX4 最初被認(rèn)為是防御鐵死亡唯一的防御系統(tǒng)。然而在2019 年，Stockwell 發(fā)現(xiàn)了一條GPX4 非依賴性鐵死亡抑制機(jī)制[37]。鐵死亡抑制蛋白（ferroptosis suppressor protein 1, FSP1）通路是由泛醌（coenzyme Q10, CoQ10）的還原形式泛醇（reduced coenzyme Q10, CoQ10H2）捕獲介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化的脂質(zhì)自由基或通過(guò)回收α-生育酚產(chǎn)生抗氧化的作用來(lái)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡，而FSP1 可以使用NAD(P)H 催化CoQ10的再生[38]。雖然FSP1 的藥理靶向作用與GPX4 依賴性通路有很強(qiáng)的協(xié)同作用，但有研究表明相比于直接靶向GPX4，靶向FSP1 可能是觸發(fā)鐵死亡的更安全的替代方案[39]。艾地苯醌等作為CoQ10 類(lèi)似物已被用來(lái)考慮治療與鐵死亡有關(guān)的疾病[40]。一項(xiàng)關(guān)于OA 患者CoQ10狀態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，OA 患者的CoQ10水平明顯低于非OA 患者，其水平隨著關(guān)節(jié)變形嚴(yán)重程度而下降[41]。研究表明FSP1 和CoQ10可以減輕患者疼痛、骨侵蝕和軟骨破壞，抑制OA 的進(jìn)展，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)藥物的不同制備方式也會(huì)影響OA 的治療療效[18，42]。因此該通路將會(huì)是治療OA 的有效靶點(diǎn)及通路。

3.3 DHODH-CoQ10H2通路 二氫乳清酸酶脫氫酶（dihydroorotate dehydrogenase, DHODH）是介導(dǎo)線粒體的局部防御系統(tǒng)，其可以通過(guò)補(bǔ)償GPX4 的損失以達(dá)到解除線粒體過(guò)氧化毒性的作用。DHODH 作為一種嘧啶合成酶，可以將線粒體內(nèi)膜上的CoQ10還原為CoQ10H2。特別是在GPX4 急劇失活的時(shí)刻，DHODH 的量會(huì)顯著增加以促進(jìn)泛醇的生成，達(dá)到中和脂質(zhì)過(guò)氧化防止線粒體發(fā)生鐵死亡的作用。由此可見(jiàn)GPX4 和DHODH 在抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的過(guò)程中相互補(bǔ)償，提示聯(lián)合多種通路的抑制可能會(huì)在OA 治療過(guò)程中取得更加有效的治療結(jié)果。

3.4 GCH1-BH4 通路或角鯊烯介導(dǎo)通路 GTP 環(huán)形水解酶1（GTP cyclohydrolase-1, GCH1）最近被報(bào)道可通過(guò)其代謝產(chǎn)物四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)和二氫生物蝶呤抑制鐵死亡。BH4 對(duì)含有兩個(gè)PUFA 尾部的磷脂具有氧化降解作用，這可能涉及雙重機(jī)制：直接捕獲過(guò)氧化脂質(zhì)自由基和參與CoQ10合成[43]。葉酸已被證明可以促進(jìn)BH4 的生成[44]。目前GCH1 在保護(hù)組織和器官免受鐵死亡中的作用仍有待更加詳細(xì)地闡明。角鯊烯是膽固醇代謝中的一種代謝物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤中它的積累可以有效防止氧化應(yīng)激條件下膜PUFA 的損傷，從而達(dá)到抑制鐵死亡發(fā)生的作用[45]。在缺血再灌注損傷的大鼠模型中，角鯊烯降低了細(xì)胞內(nèi)鐵的含量，改善脂肪酸代謝，增加了細(xì)胞抗氧化的作用[46]。Kim 等[47]發(fā)現(xiàn)在OA 患者不同時(shí)期的滑膜代謝物中，角鯊烯的含量存在顯著差異。基于角鯊烯作為治療靶點(diǎn)的通路有望開(kāi)辟OA治療的新領(lǐng)域。

4 總結(jié)與展望

盡管關(guān)節(jié)置換技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但保守治療仍是早期OA 的主要治療方式，然而基于現(xiàn)有的治療方案并不能完全改善甚至逆轉(zhuǎn)OA。鐵死亡為OA的干預(yù)提供了一種新的思路和策略，這有助于充分認(rèn)識(shí)該疾病的發(fā)生機(jī)制并提供新的治療方案。以鐵死亡作為靶點(diǎn)治療OA，可能會(huì)取得良好的治療前景。目前針對(duì)鐵死亡治療OA 的相關(guān)研究仍需進(jìn)一步開(kāi)展和豐富，并且鐵死亡涉及復(fù)雜的信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子，相關(guān)調(diào)節(jié)因子是否具有多效應(yīng)調(diào)節(jié)尚不明確。就藥物治療方面，現(xiàn)有研究多在急性O(shè)A 疾病模型中完成，長(zhǎng)期治療效果未知。另外藥物的作用靶點(diǎn)、給藥方式以及治療時(shí)機(jī)不同是否會(huì)帶來(lái)不同的治療效果也有待進(jìn)一步研究。因此臨床高質(zhì)量的多中心、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。最后，中醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，已經(jīng)在相關(guān)研究中展現(xiàn)出明確的療效，對(duì)今后研究中藥治療OA 具有重要價(jià)值。