紫草素對糖尿病小鼠中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)表達的影響

馬慧可，姚文濤，劉 欣，陳 佳，王正春，林 燕，李 萍，何秀娟

糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病的常見并發(fā)癥[1-2]。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的三維DNA 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其上鑲嵌著瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3, Cit -H3）、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 和彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE) 等殺菌蛋白，可捕獲并清除病原微生物，發(fā)揮免疫防御功能[3]。然而，過多或持續(xù)存在的NETs 可導致DFU 創(chuàng)面愈合遲緩[4]。

紫草素是紫草的主要成分，具有殺菌、抗炎、抗腫瘤、促進傷口愈合、抗氧化和抗感染等多種生物活性，可用于治療銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及皮膚腫瘤等，具有廣泛的應用前景[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可提高間隙連接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx26、Cx30 和Cx43 水平，促進慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合，促進人角質(zhì)形成細胞與成纖維細胞增殖，并因此加速慢性創(chuàng)面愈合、激活磷酯酰激醇3-激酶( phosphoinositide 3- kinases，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine threonine protein kinase，Akt)信號通路，發(fā)揮抗炎作用，進而促進小鼠燒傷性創(chuàng)面愈合，但其對糖尿病性創(chuàng)面愈合的機制尚未明確[6-7]。本實驗用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA) 刺激糖尿病小鼠骨髓來源的中性粒細胞誘導體外NETs 模型[8]，通過研究紫草素對中性粒細胞NETs生成及其標志物表達的影響，探討其促進創(chuàng)面修復的機制，以期為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗與材料

1.1 材料

1.1.1 動物 30 只SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠（8周，體質(zhì)量18～22 g），購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號: SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院、北京市中醫(yī)藥研究所SPF 級動物室，無菌飼料單籠飼養(yǎng)，自由進食食物和水，室溫22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h 明暗交替，適應性飼養(yǎng)1 周。本動物實驗經(jīng)北京市中醫(yī)藥研究所動物倫理委員會批準，項目批準號：2020120203。

1.1.2 藥物 紫草素（批號：517-89-5，純度≥98%），購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 小鼠骨髓來源中性粒細胞分離試劑盒（天津灝洋生物制品科技有限責任公司，貨號TBD2013NM）；DMEM 培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為 5.5 mmol/L，美國 HyClone 公司，貨號SH30243.01）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學研究所，貨號TR733）；Quant-iTTMPicogreenTMdsDNA Assay Kit（美國Invitrogen 公司，貨號P7589）；胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號10100154）、核酸染料Sytox Green（美國Thermo 公司，貨號S7020）；PMA、DNase I（美國Sigma 公司，貨號分別為16561-29-8、DN25-100MG）；Cit-H3 兔重組多克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab281584）；活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、DAPI 染色液、Alex Fluor?488 標記山羊抗兔抗體（上海碧云天生物技術(shù)研究所，貨號分別為S0033S、ZLI-9557、S8802）；鏈脲佐菌素、紅細胞裂解液（中國索萊寶公司，貨號分別為S8050、R1010）；MCo-15AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱、全自動酶標儀（美國Thermo 公司，型號分別為371、SYNERGY H1）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司，型號LSM780）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠骨髓來源中性粒細胞的分離與培養(yǎng) 30 只小鼠腹腔注射0.1%鏈脲佐菌素(0.1 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH 值4.5，40 mg/kg)，連續(xù)注射5 d；注射結(jié)束1 周后，隔天尾靜脈采血并檢測隨機血糖，血糖值＞16.6 mmol/L 提示糖尿病小鼠模型造模成功。

在無菌條件下，體外剝離糖尿病小鼠的股骨和脛骨，沖洗內(nèi)腔骨髓，70 μm 細胞篩網(wǎng)過濾，離心，棄上清；使用紅細胞沉降液重懸細胞，于無菌硅化管中依次加入3 mL 中性粒細胞分離液及1.5 mL 80%濃度中性粒細胞分離液；吸取1 mL 細胞懸液，緩慢加于80%濃度中性粒細胞分離液上，離心。吸取中性粒細胞層，加入清洗液充分混勻，離心；棄上清，加入紅細胞裂解液充分混勻，離心；棄上清，加DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)待用。

1.2.2 藥物配制 使用DMEM 培養(yǎng)基將紫草素粉末配成工作液（16 μg/mL，DMSO 終濃度<0.1%），過濾除菌，-80 ℃冰箱儲存。DMSO 作為助溶劑時，其終濃度控制在0.1%以內(nèi)，對細胞活性無影響[9]。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞活性 將細胞以3×105個/孔的密度接種于96 孔板，加入不同濃度的紫草素培養(yǎng)8 h后，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，用酶標儀在450 nm 處測定光密度（OD）值。

1.2.4 細胞分組 將細胞分為對照組、模型組、陽性對照組、紫草素高、中、低濃度組。對照組中加入DMEM 培養(yǎng)基；其余組中均加入PMA（100 nmol/L）；DNase I 陽性對照組中加入DNase I（0.1 mg/mL）；紫草素高、中、低濃度組中分別加入紫草素溶液（1、0.5、0.25 μg/mL）。

1.2.5 NETs 檢測 將中性粒細胞以2×106/mL 接種于24 孔培養(yǎng)板。模型組加入100 nmol/L PMA，藥物處理組同時加入1、0.5、0.25 μg/mL 紫草素，陽性對照組加入0.1 mg/mL DNase I，培養(yǎng)8 h，收集上清。取上清，加入Sytox Green（1 μmol/L）染色，使用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.2.6 dsDNA 檢測 將中性粒細胞以2×106/mL 接種于24 孔培養(yǎng)板。如上處理細胞，培養(yǎng)8 h，收集上清。按照PicoGreen 雙鏈DNA 熒光定量測定試劑盒方法檢測細胞上清中游離DNA 含量。稀釋標準品及樣品，每孔100 μL 加入到96 孔板，每孔加入100 μL 稀釋的PicoGreen 工作液，混勻，室溫避光2～5 min，采用熒光酶標儀檢測信號強度，激發(fā)、發(fā)射光波長分別為480 nm、520 nm。利用標準品繪制標準曲線并計算各組dsDNA/NETs 含量。

1.2.7 Cit-H3 檢測 將中性粒細胞以1×106/mL 接種于激光共聚焦小皿。如上處理細胞，培養(yǎng)6 h，加入4%多聚甲醛固定20 min。棄上清，PBS 洗滌3次。使用5% FBS 的封閉緩沖液，37 ℃孵育1 min；使用Cit-H3 兔重組多克隆抗體（1∶250），4 ℃孵育過夜。PBS 洗3 次，加入Alex Fluor?488 標記山羊抗兔抗體（1∶600），室溫孵育1 h。PBS 洗3 次，加入DAPI，激光共聚焦顯微鏡檢測Cit-H3 表達。

1.2.8 活性氧檢測 將中性粒細胞以2×106/mL 接種于6 孔板，如上處理細胞培養(yǎng)3 h，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；將收集的細胞重懸于1 mL 的DCFH-DA 探針(1∶1 000) 中培養(yǎng)20 min；洗滌后將重懸細胞接種于96 孔板，采用熒光酶標儀檢測信號強度，激發(fā)、發(fā)射光波長分別為485 nm、530 nm。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對中性粒細胞活性的影響 紫草素在0.125～1 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對中性粒細胞活性無影響，見表1。與對照組比較，2 μg/mL 紫草素組OD 值有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學意義，但依然存在一定抑制作用。1、0.5、0.25 μg/mL 紫草素組OD 值與對照組較為接近，因此，后續(xù)實驗采用1、0.5、0.25 μg/mL作為紫草素高、中、低濃度組。

表1 不同濃度紫草素干預8 h 對中性粒細胞活性的影響

2.2 紫草素對中性粒細胞NETs 的影響 與對照組比較，模型組中NETs 相對熒光強度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，DNase I組及紫草素高、中、低濃度組的中NETs 相對熒光強度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2。

表2 不同濃度紫草素對中性粒細胞NETs 水平及dsDNA 含量的影響

2.3 紫草素對中性粒細胞dsDNA 含量的影響 與對照組比較，模型組dsDNA/NETs 含量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，DNase I組及紫草素高、中、低濃度組的dsDNA/NETs 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2。

2.4 紫草素對中性粒細胞Cit-H3 表達的影響 與對照組比較，模型組中性粒細胞綠色熒光顯著增強，Cit-H3 表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，DNase I 組及紫草素高、中、低濃度組的中性粒細胞綠色熒光顯著減弱，Cit-H3 表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1、表3。

表3 不同濃度紫草素對中性粒細胞Cit-H3 表達及ROS 水平的影響

2.5 紫草素對中性粒細胞ROS 生成的影響 與對照組比較，模型組中性粒細胞ROS 生成顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，DNase I 組及紫草素高、中、低濃度組的ROS 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表3。

3 討論

糖尿病微環(huán)境激活中性粒細胞并釋放大量NETs[10]。NETs 是一把雙刃劍，高濃度的NETs 成分（組蛋白、殺菌肽、蛋白酶和ROS）可造成組織損傷，從而導致糖尿病創(chuàng)面愈合遲緩[11]。與健康人的中性粒細胞相比，糖尿病足潰瘍患者的中性粒細胞更容易形成NETs，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病足潰瘍患者血液中NETs 及其相關(guān)生物標志物（Cit-H3、NE）的表達顯著升高[12]。因此，抑制NETs 生成對于治療糖尿病足潰瘍至關(guān)重要。

PMA、細菌、損傷相關(guān)分子模式（DAMP）和細胞因子可通過TLR2、TLR4 或蛋白激酶1（RIPK1）/RIPK3/混合系激酶區(qū)域樣蛋白（MLKL）途徑激活PAD4，也可通過蛋白激酶C(PKC)、RAF/MEK/ERK途徑誘導ROS 和MPO 生成并激活PAD4[13-15]。GMCSF、脂多糖、病原相關(guān)分子模式（PAMP）和C5a 誘導ROS 和MPO 產(chǎn)生并激活PAD4。以上途徑均導致中性粒細胞PAD4 的激活，從而促進NETs 的形成[13]。此外，細胞外冷誘導RNA 結(jié)合蛋白（eCIRP）與髓系細胞觸發(fā)受體1（TREM-1）結(jié)合并誘導細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達，ICAM-1 介導Rho 激活，從而促進NETs 的釋放[16]。此外，無論是無菌性創(chuàng)面中DAMP 介導的NETs 生成，還是感染性創(chuàng)面中PAMP 介導的NETs 生成，各種途徑產(chǎn)生的ROS均可激活PAD4，引起染色質(zhì)解聚并釋放NETs。

目前以NETS 為靶向的治療正成為促進傷口愈合的潛在趨勢。DNase I 可降解NETs 結(jié)構(gòu)，促進糖尿病小鼠創(chuàng)面再上皮化，從而加速傷口愈合[17]。治療性抗瓜氨酸蛋白抗體（tACPA）可特異性地與組蛋白2A（Cit-H2A）和Cit-H4 中Cit3 的瓜氨酸結(jié)合，通過抑制中性粒細胞NETs 生成或促進巨噬細胞對NETs 的攝取與清除，減輕慢性炎癥和局部組織損傷[18]?？寡趸瘎┝蚧瘹渫ㄟ^抑制ROS 介導的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2 和p38 的激活來抑制NETs 生成，并改善糖尿病創(chuàng)面的愈合[19]。含有PAD4 酶抑制劑的海藻酸-明膠甲基丙烯酰胺-支架可以抑制Cit-H3 表達，從而促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合[20]。

皮膚傷口愈合是多因素共同參與，并高度協(xié)調(diào)、相互調(diào)控的復雜過程，包括止血、炎癥、增殖和重塑四個階段，涉及中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等多種細胞[21-22]。紫草具有涼血、活血、解毒透疹之功效，常用于治療濕疹、皮炎、皮膚創(chuàng)面（瘡瘍、水火燙傷）及黏膜損傷等多種炎癥性疾病。紫草素作為紫草的有效成分，通過抑制炎癥介質(zhì)的分泌，上調(diào)細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）和表皮生長因子（EGF）的產(chǎn)生，促進成纖維細胞增殖和遷移。紫草素可通過TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子-κβ(NF-κβ)信號通路抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥、下調(diào)氧化應激、降低半胱天冬氨酸酶-1(Caspase-1)活性抑制NLRP3 和AIM2 炎癥小體的活化，發(fā)揮抗炎效應，促進人角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞增殖，有助于皮膚創(chuàng)傷愈合[7,23-25]。

中性粒細胞激活后，ROS 的生成是NETs 釋放的關(guān)鍵[18]。PAD4 促使組蛋白上的精氨酸殘基發(fā)生瓜氨酸化，這對于隨后的染色質(zhì)解聚和NETs 釋放到細胞外環(huán)境中是必要的。本研究表明紫草素可抑制PMA 誘導的糖尿病小鼠中性粒細胞ROS 的生成，下調(diào)Cit-H3 水平從而抑制NETs 的生成，抑制炎癥反應，來促進糖尿病創(chuàng)面愈合。

目前已知的靶向NETs 的藥物主要是干擾NETs 結(jié)構(gòu)和組分蛋白，包括DNase I、抗組蛋白抗體、PADs 抑制劑、NE 抑制劑以及ROS 清除劑等[26]。DNase I 只能清除已經(jīng)生成的NETs，并不能從根本上阻止NETosis 的發(fā)生和蛋白水解導致的組織損傷[27]。PADs 抑制劑Cl-amidine 對PAD 缺乏選擇性，體內(nèi)半衰期短，活性相對較低、生物利用度有限且不良反應未知[28]。以NETs 為靶點的生物制劑具有穩(wěn)定性差、制備復雜、價格昂貴等局限性，其治療作用、毒性和耐藥性仍有待大樣本研究證實[29]。相比以上生物制劑，紫草素具有多靶點、多途徑、療效好、可持續(xù)、資源易得等優(yōu)點[30]，有望作為NETs抑制劑用于糖尿病創(chuàng)面的治療。

本研究結(jié)果提示，紫草素在體外可通過下調(diào)PMA 誘導的糖尿病小鼠骨髓來源的中性粒細胞ROS 水平，抑制Cit-H3 表達，從而抑制NETs 釋放，發(fā)揮抗炎作用，提示紫草素可用于與NETs 相關(guān)的糖尿病足潰瘍等疾病的治療，為臨床進一步開發(fā)應用紫草素提供了實驗依據(jù)。