復(fù)方黃柏液涂劑抑制銅綠假單胞菌毒力因子表達(dá)的作用機制

楊偉峰，李金澤,2，崔開宇，李東影，李 露，王 毅

復(fù)方黃柏液涂劑由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣組成，具有清熱解毒、消腫祛腐之功效，臨床上常采用濕敷法治療糖尿病足、外傷感染等，可減少分泌物、減輕紅腫疼痛、促進(jìn)傷口愈合，療效顯著[1-2]，但其療效的具體機制尚不明確。在這些臨床復(fù)雜感染中，一個不容忽視的關(guān)鍵問題是細(xì)菌的毒力起到非常重要的作用[3-4]，而創(chuàng)面感染病原菌種類及其藥物敏感性的改變是導(dǎo)致糖尿病足感染發(fā)生及影響預(yù)后的主要因素之一[5]。

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA 或PAO1)作為糖尿病足感染常見病原菌，在全部病原菌中占比約為10%～20%，且近年來呈明顯上升趨勢[6]；此外，PA 也是外科創(chuàng)面感染中是最常見的機會性致病菌之一[7]。其黏附力強，易形成生物膜，且可產(chǎn)生大量破壞宿主組織的毒力因子，如堿性蛋白酶、彈性蛋白酶、綠膿菌素、外毒素A 等[8]。這些受群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）調(diào)節(jié)的毒力因子，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)[9]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，損害宿主免疫防御[11]，導(dǎo)致傷口愈合緩慢，在其致病過程中起到關(guān)鍵性作用。PA 還可通過依靠自身鞭毛和纖毛進(jìn)行運動，并借助生物膜—浮游態(tài)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致感染擴(kuò)散、毒素傳播，致使病情惡化[12]。因此，PA 致病性與其表達(dá)和分泌的毒力因子直接相關(guān)，通過毒力因子進(jìn)而促進(jìn)銅綠假單胞菌在宿主體內(nèi)的感染是其主要手段。由于抗生素的不合理使用以及自身的固有耐藥，導(dǎo)致臨床上多藥耐藥菌株的出現(xiàn)，使得免疫低下或患有特殊疾病的患者感染后很難治愈[13-14]，而面對PA 的耐藥問題以及傳統(tǒng)抗生素治療效果的減弱，通過在非抑制細(xì)菌生長的條件下，采用降低細(xì)菌毒力因子表達(dá)，排除選擇壓力從而達(dá)到抑菌殺菌的作用已成為另一種治療細(xì)菌感染性疾病的方式[15]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實驗驗證的方法，首先檢索并收集復(fù)方黃柏液各組分中的有效成分并預(yù)測其靶點，結(jié)合文獻(xiàn)檢索、耐藥基因、毒力因子數(shù)據(jù)庫篩選出抗PA 的潛在作用靶點，并構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，通過生物過程與通路富集分析，進(jìn)一步探索復(fù)方黃柏液對PA 主要致病毒力因子及細(xì)菌生物膜的影響及作用機制，而后在結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，對其中涉及毒力因子的核心靶點進(jìn)行實驗驗證，為臨床采用復(fù)方黃柏液治療PA 所致感染提供理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方黃柏液對PA 毒力因子表達(dá)和細(xì)菌生物膜影響的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 復(fù)方黃柏液成分收集與靶點預(yù)測 結(jié)合文獻(xiàn)檢索以及質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)[16]，收集復(fù)方黃柏液各組分中的化學(xué)成分，利用STITCH 和Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫對其成分進(jìn)行靶點預(yù)測，其中STITCH 數(shù)據(jù)庫以“Pseudomonas aeruginosa”為篩選條件進(jìn)行靶點預(yù)測，并選取hight confidence，no more than 20 interactors 的作用靶點，Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫以“Pseudomonas aeruginosa”為篩選條件，選取Fit Score≥3 的作用靶點，對收集到的靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并整合去除重復(fù)值，最后結(jié)合文獻(xiàn)及VFDB、CARD 數(shù)據(jù)庫篩選得到復(fù)方黃柏液抗PAO1 的潛在作用靶點。

1.1.2 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將整合好的化學(xué)成分與潛在作用靶點之間的相互關(guān)系編排成網(wǎng)絡(luò)文本，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件（https://cytoscape.org/），利用“Network Analyzer”插件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點的篩選 將復(fù)方黃柏液抗PAO1 的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）中的“Multiple Proteins”，選擇物種“Pseudomonas aeruginosa PAO1”進(jìn)行搜索，在“Settings”中選擇置信度“medium confidence”和隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點。更新數(shù)據(jù)后下載TSV 文本，并導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，利用“Network Analyzer”插件，在“Generate Style from Statistics”工具中選擇“Degree”作為節(jié)點顏色大小的指標(biāo)，“Combined_Score”作為邊的顏色粗細(xì)的指標(biāo)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。然后根據(jù)度值（degree）大小，其次是介度中心性（betweenness centrality,BC）和接近中心性（closeness centrality,CC）大小篩選出核心靶點。

1.1.4 GO 生物功能與KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對上述潛在作用靶點進(jìn)行GO 富集和功能注釋分析，選擇物種“Pseudomonas aeruginosa PAO1”，查看其分析結(jié)果并繪制成氣泡圖。

1.2 復(fù)方黃柏液對PA 主要致病毒力因子影響的實驗驗證

1.2.1 實驗菌株及藥物 PAO1（ATCC 15692）購自美國模式培養(yǎng)物庫。復(fù)方黃柏液涂劑：批號20031212，購自山東漢方制藥有限公司；注射用頭孢他啶（CAZ）：批號2004103，購自海南海靈化學(xué)制藥有限公司。

1.2.2 主要試劑和儀器 XTT：批號C12592530，購自上海麥克林生化科技有限公司；PMS：型號P9625，購自美國Sigma 公司；MH 肉湯、胰蛋白胨、酵母提取物、細(xì)菌蛋白胨：購自美國Oxoid 公司；瓊脂、氯化鈉：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；假單胞菌分離瓊脂：購自瑞楚生物科技（江蘇）有限公司；結(jié)晶紫：購自美國Solarbio 公司；脫脂牛奶：購自美國BioRuler 公司；TTC：購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，超純水配制；LB 固體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂20 g/L，超純水配制；堿性脫脂牛奶瓊脂平板：脫脂牛奶10 g/L、細(xì)菌蛋白胨1 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂20 g/L、pH=10；XTT-PMS 溶液：1 mg/mL XTT 與3.06 mg/mL PMS 按200∶1 混合，避光保存；0.4%CV溶液：結(jié)晶紫4 g/L，超純水配制。SW-CJ-1FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；THZ-D 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）；KBF-240 型恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder 公司）；V-1100 型紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；Synergy H1 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；ELX50 型全自動八道洗板機（美國伯騰儀器有限公司）；Allegra X-15R 醫(yī)用離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2.3 體外藥敏實驗 參考馬建鳳[17]等實驗方法，采用微孔板稀釋法檢測復(fù)方黃柏液對PA 的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。挑取PAO1 單菌落于4 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，LB 培養(yǎng)基稀釋菌懸液至OD600=0.02，取無菌96 孔板，采用微量稀釋法將復(fù)方黃柏液和CAZ 進(jìn)行倍比稀釋，使復(fù)方黃柏液最終濃度為1/256～1/2 原液濃度，CAZ 最終濃度為0.0625～8 μg/mL，每孔含100 μL 稀釋藥液和100 μL稀釋菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，每孔加30 μL TTC，室溫培養(yǎng)30 min，觀察顏色變化。實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 時間-生長曲線實驗 參考劉靜雪等[18]實驗方法，連續(xù)動態(tài)挑取PAO1 單菌落于4 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，將菌懸液按照1∶100 接種到LB 培養(yǎng)基，37 ℃、225 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)0.5 h，加入倍比稀釋藥液，使復(fù)方黃柏液終濃度為1/8～1/2 原液濃度，CAZ 終濃度為0.125 μg/mL，同時設(shè)置不含藥的空白對照組，37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 測定OD600值，觀察24 h 并繪制生長曲線，實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 瓊脂板測定復(fù)方黃柏液對PA 堿性蛋白酶的影響 參考Aybey 等[19]實驗方法，挑取PAO1 單菌落37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，用10 μL槍頭接種在堿性脫脂牛奶瓊脂平板上，其中含1/4～1/16原液濃度的復(fù)方黃柏液培養(yǎng)基為實驗組、不加藥的培養(yǎng)基為空白對照組，含0.125 μg/mL CAZ 的培養(yǎng)基為陽性對照組，各濃度梯度設(shè)3 個重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并測量各組透明圈的大小。

1.2.6 比色法測定復(fù)方黃柏液對PA 綠膿菌素的影響 參考Yang 等[20]實驗方法，挑取PAO1 單菌落37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，取1 mL PAO1 菌液倒入制備好的假單胞菌分離瓊脂平板，其中含1/2～1/16 原液濃度復(fù)方黃柏液的培養(yǎng)基為實驗組、不加藥的培養(yǎng)基為空白對照組，含0.125 μg/mL CAZ 培養(yǎng)基為陽性對照組，各濃度梯度設(shè)3 個重復(fù)。37 °C 恒溫恒濕培養(yǎng)24 h 后，稱取各平板中10 g瓊脂，加入10 mL 氯仿，37 ℃震搖2 h，使綠膿菌素充分溶解，離心取5 mL 上清液并加入1 mL 0.2 mol/L HCL 振蕩混勻，取上清液200 μL 測量OD520值。實驗重復(fù)3 次。

1.2.7 微孔板法測定復(fù)方黃柏液對PA 成熟生物膜的影響 參考邢亞君等[21]實驗方法，挑取PAO1單菌落，37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期，LB 培養(yǎng)基稀釋菌懸液至OD600=0.1，無菌96 孔板加稀釋菌液每孔100 μL，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，洗去孔中的浮游菌，將藥液進(jìn)行2 倍稀釋，使復(fù)方黃柏液最終濃度為1/4～1/16 原液，CAZ 最終濃度為0.125 μg/mL，各濃度梯度做3 個復(fù)孔，每孔加入100 μL 稀釋藥液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用0.9%氯化鈉溶液洗板2 次，分別加入0.4%CV 和XTTPMS 試劑，酶標(biāo)儀檢測總菌量（CV，590nm）和活菌量（XTT-PMS，450nm/655nm）的OD 值。實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃柏液抑制PA 毒力表達(dá)和細(xì)菌生物膜的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析

2.1.1 復(fù)方黃柏液有效成分及其潛在作用靶點篩選 通過文獻(xiàn)檢索及VFDB、CARD 數(shù)據(jù)庫篩選得到復(fù)方黃柏液抗PAO1 的有效成分共62 個，潛在作用靶點共31 個，其中黃柏抗PAO1 潛在作用靶點8個，連翹潛在作用靶點9 個，金銀花潛在作用靶點9個，蒲公英潛在作用靶點6 個，蜈蚣潛在作用靶點21 個，見表1。

表1 復(fù)方黃柏液各組分抗PAO1 的潛在作用靶點

2.1.2 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將復(fù)方黃柏液有效成分與潛在作用靶點之間的相互關(guān)系編排成網(wǎng)絡(luò)表格和屬性表格，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。圖1 中共98個節(jié)點，202 條邊，其中節(jié)點的形狀大小和透明度代表其相應(yīng)的度值（degree），反映該節(jié)點與其他節(jié)點相互作用的程度，度值越大表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越突出。從圖1 中可以看出，黃柏所含Cynaroside、protocatechuic acid、γ-fagarine，連翹所含forsythenside A、forsythialan B、quercetin，金銀花所含 Lonijaposide E、Lonijaposide B、Lonijaposide A，蒲公英所含 Caffeic acid ethyl ester、Chlorantholide A、Luteolin 及蜈蚣所含Alanine、Lysine、Arginine 等與多個靶點相互作用，提示這些化合物可能是復(fù)方黃柏液發(fā)揮抗銅綠假單胞菌作用的主要成分。同時靶點也與多個成分相互連接，顯示了中藥多成分，成分多靶點，協(xié)同發(fā)揮功效的特點。此外，利用“Network Analyzer”插件得到了度值較高的靶點信息，如algD、amiE、nirS、fptA、eta等，提示這些靶點可能是復(fù)方黃柏液中發(fā)揮抗PA作用的主要靶點。

圖1 復(fù)方黃柏液中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點的篩選 為了進(jìn)一步明確復(fù)方黃柏液抗PAO1 靶點的相互作用關(guān)系，將篩選得到的31 個潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為“Pseudomonas aeruginosa PAO1”進(jìn)行檢索，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI，如圖2 所示。結(jié)果表明除pvcC、pagL、bphP、gshA、opdE、phzB2、mexR、kynA、fpvA 無交集靶點外，共得到22 個節(jié)點，30 條邊。其中，節(jié)點的形狀大小和顏色代表其相應(yīng)的“degree”值，線條的粗細(xì)和顏色代表其相應(yīng)的“combined score”值。節(jié)點由大到小，線條由粗到細(xì)，顏色由淺橙色到淺藍(lán)色，表示相應(yīng)的“degree”值和“combined score”值也由大到小。從圖2 中可以直觀地觀察到phnW、lysC、aprA、glmS、murC、gbuA 等度值較大，提示這些可能是復(fù)方黃柏液抗PA 的關(guān)鍵靶點。

圖2 復(fù)方黃柏液與PAO1 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

利用“Network Analyzer”插件，選擇度值（degree）、介度中心性（BC）和接近中心性（CC）這3個重要參數(shù)作為核心靶點篩選的指標(biāo)。結(jié)果選取排名前10 的靶點作為復(fù)方黃柏液抗PA 的核心靶點，依次為 phnW、lysC、aprA、murC、glmS、gbuA、eta、pvdA、adk、ftsZ，見表2。

表2 部分核心靶點基本信息

2.1.4 GO 富集分析與KEGG 通路注釋分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對31 個潛在作用靶點進(jìn)行GO 分子功能、GO 生物過程、GO 細(xì)胞組分富集分析以及KEGG 通路注釋分析（P＜0.05），將P值和基因富集數(shù)量比率進(jìn)行排序，并將數(shù)據(jù)結(jié)果繪制成氣泡圖，結(jié)果顯示，GO 富集分析共得到7 個條目，其中分子功能2 個，主要與丙氨酸消旋酶活性和磷酸吡哆醛結(jié)合有關(guān)；生物過程4 個，主要與銅綠假單胞菌鐵載體（pyoverdine）生物合成過程、鐵離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞壁組織、發(fā)病機制有關(guān)；細(xì)胞組分1 個，主要與細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。KEGG 通路注釋分析共得到5 條信號通路，主要與D-丙氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、代謝途徑、精氨酸和脯氨酸代謝和萬古霉素耐藥信號通路有關(guān)，見圖3。

圖3 GO 分子功能(A)、生物過程(B)、細(xì)胞組分(C)和KEGG 通路富集分析(D)

2.2 復(fù)方黃柏液影響PA 毒力因子的實驗驗證結(jié)果

2.2.1 復(fù)方黃柏液和CAZ 的MIC 及其對PAO1 的時間-生長曲線 體外藥敏實驗結(jié)果顯示CAZ 對PAO1 的MIC 值為2 μg/mL，而復(fù)方黃柏液的MIC值則未能測出。時間-生長曲線結(jié)果顯示，1/2～1/8原液濃度復(fù)方黃柏液和0.125 μg/mLCAZ 的生長曲線與空白對照組基本重合，提示1/2～1/8 原液濃度復(fù)方黃柏液對PAO1 生長無影響，見圖4。

圖4 復(fù)方黃柏液和CAZ 的PAO1 生長曲線

2.2.2 復(fù)方黃柏液對PAO1 堿性蛋白酶的影響 結(jié)合2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析及2.2.1 體外藥敏實驗和生長曲線結(jié)果，選擇對PAO1 生長無抑制作用的1/4～1/16 原液濃度的復(fù)方黃柏液進(jìn)行堿性蛋白酶測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，1/4～1/8 原液濃度的復(fù)方黃柏液可顯著減小透明圈直徑（P＜0.05），且隨藥物濃度的升高，所產(chǎn)生抑制作用增強的透明圈直徑逐漸減?。欢?.125 μg/mL CAZ 的透明圈無顯著差異，見表3、圖5。

圖5 復(fù)方黃柏液對PAO1 堿性蛋白酶的影響

表3 復(fù)方黃柏液對堿性蛋白酶及綠膿菌素的影響

2.2.3 復(fù)方黃柏液對PAO1 綠膿菌素的影響 與空白組相比，陽性對照0.125 μg/mL CAZ 組對綠膿菌素?zé)o抑制作用；而1/4～1/16 濃度的復(fù)方黃柏液可以有效地抑制綠膿菌素產(chǎn)生（P＜0.01），其抑制率分別為41.15%、10.67%、16.88%，見表3。

2.2.4 復(fù)方黃柏液對PAO1 成熟生物膜的影響 與空白組相比，1/8～1/16 原液濃度的復(fù)方黃柏液可顯著抑制成熟生物膜的生物總菌量和膜內(nèi)活菌量（P＜0.01），1/4 原液濃度的復(fù)方黃柏液可顯著抑制成熟生物膜的生物總菌量（P＜0.01）；0.125 μg/mL CAZ 對PAO1 生物膜總量和活菌量也有明顯抑制作用（P＜0.01），見圖6。

圖6 復(fù)方黃柏液對PAO1 成熟生物膜總量和活菌量的影響

3 討論

本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對復(fù)方黃柏液有效成分進(jìn)行靶點預(yù)測，找到抗PA 潛在作用靶點31個，并根據(jù)度值得到phnW、lysC、aprA、murC、glmS、gbuA、eta、pvdA、adk、ftsZ 等核心靶點。有研究表明，phnW、murC、ftsZ 等靶點涉及細(xì)菌細(xì)胞壁合成、耐藥、細(xì)菌分裂等方面。其余靶點多與細(xì)菌毒力因子調(diào)控相關(guān)，其中堿性蛋白酶（aprA）是PA 主要的毒力因子之一，它可以降解宿主蛋白并抑制中性粒細(xì)胞功能，還能促進(jìn)另一種毒力因子—綠膿菌素的產(chǎn)生[22]。此外，gbuA 靶點也與QS 系統(tǒng)調(diào)控的綠膿菌素表達(dá)密切相關(guān)[23]。有研究表明，lysC 和adk 的失活可以抑制浮游菌向生物膜的轉(zhuǎn)變，是治療PA 生物膜相關(guān)的良好靶點[24]。因此，根據(jù)預(yù)測結(jié)果靶向分析，本研究選擇堿性蛋白酶、綠膿菌素、生物膜指標(biāo)進(jìn)行檢測，其結(jié)果也驗證了復(fù)方黃柏液可以有效地抑制這些毒力因子表達(dá)。

通過對潛在作用靶點進(jìn)行GO 富集和KEGG通路注釋分析，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞組分中31 個潛在作用靶點主要分布在細(xì)胞質(zhì)，分子功能的丙氨酸消旋酶活性和磷酸吡哆醛結(jié)合主要與細(xì)胞壁的重要成分D-丙氨酸合成相關(guān)?，F(xiàn)已證實當(dāng)丙氨酸消旋酶活性受到抑制后會干擾細(xì)胞壁的合成，從而起到抗菌作用[25]。生物過程預(yù)測結(jié)果提示復(fù)方黃柏液有效成分可能與PAO1 的鐵載體pyoverdine 生物合成過程及其鐵離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞壁組織、發(fā)病機制有關(guān)，其中鐵載體pyoverdine 是PAO1 獲取鐵離子的主要方式，它能夠使自身免受活性氧（ROS）的威脅，還可以調(diào)控生物膜的形成，是引發(fā)疾病的重要毒力因子[26-27]。KEGG 通路注釋分析提示復(fù)方黃柏液與PAO1 的丙氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、代謝途徑、精氨酸和脯氨酸代謝和萬古霉素耐藥信號通路有關(guān)，上述可能是復(fù)方黃柏液抗PAO1 的主要代謝通路。

對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點預(yù)測結(jié)果進(jìn)行實驗驗證的結(jié)果表明，復(fù)方黃柏液在低于1/2 原液濃度下對PAO1 的生長無抑制作用。在不影響細(xì)菌生長濃度下的復(fù)方黃柏液可以有效地抑制PA 主要致病毒力因子堿性蛋白酶和綠膿菌素的表達(dá)。此外，低于1/2原液濃度的復(fù)方黃柏液可不同程度抑制PA 成熟生物膜總量及膜內(nèi)活菌量。頭孢他啶作為第3 代頭孢菌素類抗生素，為臨床治療PA 感染的一線用藥，在本實驗中發(fā)現(xiàn)其對成熟期生物膜也有較好的抑制作用，與以往報道結(jié)果一致[28-29]，但對PA 主要致病毒力因子如堿性蛋白酶、綠膿菌素等并無抑制作用。相比于經(jīng)典抗生素，復(fù)方黃柏液因其對病原菌生長無影響，可有效緩解由于藥物選擇壓力而出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性；同時還可有效抑制毒力因子，因而減輕疾病過程中毒力因子引起的機體損傷、促進(jìn)組織愈合。

復(fù)方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣組成，已有研究表明黃柏、連翹等清熱解毒類中藥可以不同程度地降低PA 毒力因子的表達(dá)，抑制生物膜形成以及集群運動[18,30]，這可能是復(fù)方黃柏液中發(fā)揮抑制PA 主要致病因子（堿性蛋白酶、綠膿菌素等）的主要有效成分。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)潛在作用靶點篩選結(jié)果提示復(fù)方黃柏液中所含的金銀花、蒲公英、蜈蚣等也可能具有相應(yīng)作用，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，對于臨床PA 所致的感染創(chuàng)面，復(fù)方黃柏液在其中作為一種非殺菌劑，通過抑制PA 主要致病毒力因子堿性蛋白酶、綠膿菌素表達(dá)，抑制成熟細(xì)菌生物膜的細(xì)菌總量和活菌量，在臨床廣泛用于治療糖尿病足、外傷感染等治療。