復(fù)方黃柏液涂劑治療糖尿病足潰瘍的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究

李雨峰，余 敏，孫偉浩，寧遵錫，王 毅，高慧媛，魏秀巖

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其中糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer, DFU）是其嚴(yán)重并發(fā)癥之一，病情發(fā)展后期常常導(dǎo)致患者被迫截肢，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。因此，開發(fā)促進(jìn)糖尿病足創(chuàng)面愈合的藥物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義[1-2]。

糖尿病足潰瘍患者因代謝異常引起下肢動(dòng)脈血管病變，導(dǎo)致血流量減少，降低生長因子活性并阻止血管新生，嚴(yán)重阻礙創(chuàng)面愈合；其次，創(chuàng)面一旦形成，極易受金黃色葡萄球菌感染，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，造成惡性循環(huán)。目前臨床上尚缺乏針對糖尿病足潰瘍治療的有效藥物[3]。復(fù)方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣五味中藥組成，其功能主治為清熱解毒、消腫祛腐，減輕傷口感染等[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該復(fù)方具有廣譜抑菌作用，消炎鎮(zhèn)痛，抗?jié)?，加快傷口愈合[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將傳統(tǒng)藥理學(xué)與生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合在一起的新興藥理學(xué)研究方法。由于中藥復(fù)方成分多，靶點(diǎn)多，故傳統(tǒng)藥理研究難以闡明其具體機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過收集藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，整體性和系統(tǒng)性地研究藥物與疾病間的作用，從而預(yù)測中藥的分子作用機(jī)制[6]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究探討復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1 復(fù)方黃柏液活性成分靶點(diǎn)篩選及“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 以黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/)，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥相似度（DL）≥0.18為條件，檢索有效化合物成分及靶點(diǎn)信息。查閱以往發(fā)表的文獻(xiàn)和資料補(bǔ)充有效成分，并利用SwissADME化學(xué)成分預(yù)測平臺(tái)(http://www.swissadme.ch/)篩選符合條件的成分，并通過PharmMapper（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）獲得潛在靶點(diǎn)信息，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)統(tǒng)一為基因名，使用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 糖尿病足潰瘍疾病靶點(diǎn)篩選 通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳（online mendelian inheritance in man, OMIM, https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，以“diabetic foot ulcers”為關(guān)鍵詞檢索疾病的靶點(diǎn)信息，利用Uniprot對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 藥物有效成分與疾病交集靶點(diǎn)的篩選及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html） 對藥物有效成分靶點(diǎn)和DFU靶點(diǎn)進(jìn)行重合，得出二者交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)上傳至STRING11.0（https://www.string-db.org/） 平臺(tái)，物種限定為“Homo sapiens”，置信分?jǐn)?shù)＞0.4，獲得PPI，并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行可視化，使用CytoNCA功能篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析 將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析（GO）和KEGG通路富集分析，根據(jù)核心通路富集程度探討復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的可能作用機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)研究

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體質(zhì)量（260±20）g，由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（遼）2020-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：210726211100601251。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25℃，12 h無光照/12 h人工光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)程序遵循沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的指導(dǎo)原則。

2.2 藥品與試劑 復(fù)方黃柏液涂劑（山東漢方制藥有限公司，規(guī)格：150 mL/瓶，國藥準(zhǔn)字Z 10950097，批號：202312）；金黃色葡萄球菌（沈陽藥科大學(xué)微生物教研室提供）；鏈脲佐菌素（STZ，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號:01030A）；檸檬酸（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號:20201123）；檸檬酸鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號:20201003）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20220123）；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢博士德有限公司。

2.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（賽默飛科技有限公司）、血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）、組織自動(dòng)脫水機(jī)及石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、石蠟切片機(jī)（上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）。

2.4 動(dòng)物分組及造模

2.4.1 動(dòng)物分組 將30只健康SD大鼠分為正常潰瘍組、糖尿病潰瘍模型組和復(fù)方黃柏液治療組，每組10只。

2.4.2 糖尿病模型的建立 除正常潰瘍組外，其他兩組大鼠均一次性腹腔注射55 mg/kg劑量的濃度為1%的STZ。正常潰瘍組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。誘導(dǎo)7 d后，自尾靜脈采血，測量隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L并出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象為糖尿病模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3 糖尿病足潰瘍模型的建立 麻醉糖尿病模型建立成功的大鼠，將5 g圓形砝碼置于酒精燈上方烘烤20 s，待炙熱后接觸右足背部皮膚15 s，并于足趾部注射0.1 mL金黃色葡萄球菌。燙傷部位出現(xiàn)腫脹，水泡，24 h后潰瘍創(chuàng)面形成，即成功建立糖尿病足潰瘍模型[7-8]。

2.5 實(shí)驗(yàn)給藥 模型建立成功次日開始藥物治療，正常潰瘍組及糖尿病潰瘍模型組給予20 mL生理鹽水沖洗創(chuàng)面，給藥組給予20 mL復(fù)方黃柏液沖洗潰瘍表面。每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。

2.6 檢測指標(biāo) 末次給藥后，將所有大鼠麻醉，剪切潰瘍創(chuàng)面周圍組織，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行病理學(xué)檢測；ELISA法檢測白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮細(xì)胞生長因子（EGF）的含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并使用Graphpad prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖。計(jì)量資料以±s 表示，多樣本間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物活性成分靶點(diǎn)的獲取及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)篩選后共獲得藥物有效成分88種，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)518 個(gè)，利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)由604個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 732條邊組成，反映了化合成分與作用靶點(diǎn)的相互作用。

圖1 復(fù)方黃柏液活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 糖尿病足潰瘍疾病潛在靶點(diǎn) 通過OMIM獲取糖尿病足潰瘍疾病靶點(diǎn)279個(gè)，GeneCards獲取糖尿足病潰瘍疾病靶點(diǎn)2 509個(gè)，篩掉重復(fù)靶點(diǎn)后，共有2 739個(gè)糖尿病足潰瘍疾病靶點(diǎn)。

3.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Venny2.1.0分析得到藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)225個(gè)，并繪制Venny圖，獲得的交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)共有225個(gè)節(jié)點(diǎn)，4 813條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為42.8，見圖2。

圖2 藥物和疾病交集靶點(diǎn)Venny圖

3.4 靶蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape3.9.1軟件對PPI網(wǎng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得?24個(gè)節(jié)點(diǎn)，4 813條邊。根據(jù)CytoNCA網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的計(jì)算結(jié)果，篩選出AKT1、TNF、TP53、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3、CTNNB1、IL1B、SRC、MMP9、MYC、FN1、EGF、CXCL8為核心靶點(diǎn)。PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選見圖3，靶點(diǎn)信息見表1。

表1 核心靶點(diǎn)信息

圖3 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 GO功能富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，在GO分析條目中，分別選取生物過程（biological process, BP）、細(xì)胞組成 (cellular components, CC）、分子功能（molecular function, MF）中顯著性排名前10的功能信息繪制柱狀圖，如圖4，分析得到BP主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達(dá)的正向調(diào)控、凋亡過程的正調(diào)控等。CC主要涉及細(xì)胞外隙、胞外區(qū)、大分子復(fù)合物等。MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、生長因子活性等。

圖4 復(fù)方黃柏液治療DFU的GO功能富集分析

3.6 KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得88條信號通路（P<0.05），結(jié)果按照P值從小到大排序，取排名前20條通路繪制KEGG氣泡圖，主要涉及MAPKA信號通路、TNF信號通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號通路和AGE-RAGR信號通路等（圖5）。

圖5 復(fù)方黃柏液治療DFU的KEGG通路富集分析

3.7 復(fù)方黃柏液對大鼠血清中VEGF及EGF含量的影響 與正常潰瘍組比較，糖尿病潰瘍組血清中的VEGF及EGF含量明顯降低；與糖尿病潰瘍組相比，復(fù)方黃柏液治療組血清中的VEGF和EGF水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

圖6 各組大鼠血清中VEGF、EGF表達(dá)水平比較

3.8 復(fù)方黃柏液對糖尿足潰瘍大鼠血清中炎性因子的影響 與正常潰瘍組相比，糖尿病潰瘍組血清中的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平升高；黃柏液治療組血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平比糖尿病潰瘍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖7。

圖7 各組大鼠血清中炎性因子含量比較

3.9 復(fù)方黃柏液對糖尿病足潰瘍大鼠肉芽組織生成的影響 正常潰瘍組結(jié)構(gòu)完整，肉芽組織增加，成纖維細(xì)胞排列完整，數(shù)量較多，毛細(xì)血管增多（圖8A）。糖尿病潰瘍組表皮輪廓模糊，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，排列混亂，可見炎癥細(xì)胞浸潤，肉芽組織及新生毛細(xì)血管較少（圖8B）。黃柏液治療組表皮界限清楚，肉芽組織及新生毛細(xì)血管增加，成纖維細(xì)胞排列規(guī)則，數(shù)量增加，炎癥細(xì)胞減少（圖8C）。

圖8 各組大鼠足部潰瘍組織病理檢查結(jié)果（HE染色，×200）

4 討論

糖尿病足患者多有血管、神經(jīng)病變，足部創(chuàng)面常伴隨氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物、炎性因子等微環(huán)境異常，這些因素可使創(chuàng)面遷延不愈，其中血管病變及炎癥反應(yīng)是延長傷口愈合的關(guān)鍵因素[9]。

復(fù)方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣五味中藥組成。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為黃柏及連翹在此方中共為君藥，具有清熱解毒、排膿散結(jié)的作用，并享有“瘡瘍靈藥”的美譽(yù)；金銀花和蒲公英在此方中共為臣藥，主要助君藥排毒，解熱之功。蜈蚣可攻毒散結(jié)、退炎治瘡[10]。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)等特性，因此要闡明其作用機(jī)制需要大量的實(shí)驗(yàn)研究。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建藥物與疾病之間的作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)信息進(jìn)行預(yù)測，最終確定AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、JUN、CASP3、CTNNB1、IL1B、SRC、MMP9、MYC、FN1、EGF、CXCL8作為復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)，富集分析顯示MAPKA信號通路、TNF信號通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號通路、AGE-RAGR信號通路是該復(fù)方發(fā)揮作用的主要通路。

炎癥反應(yīng)在創(chuàng)面愈合過程中起著重要作用，創(chuàng)面愈合困難與反復(fù)的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和重塑期延遲有關(guān)，因此本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病足潰瘍組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子分泌增多，加重組織損傷，創(chuàng)口愈合減慢，給予復(fù)方黃柏液治療后，大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平比糖尿病足潰瘍組顯著降低，該結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測一致，表明復(fù)方黃柏液可減輕糖尿病足潰瘍大鼠的炎癥反應(yīng)。

血管生成是傷口愈合過程中必不可少的過程，VEGF和EGF在促進(jìn)血管新生中起著關(guān)鍵作用，VEGF和EGF可激活MAPK 通路誘導(dǎo)細(xì)胞分化[11]。糖尿病足潰瘍患者由于組織供血供氧不足，抑制了VEGF和EGF的表達(dá)與生成[12-13]，導(dǎo)致新生血管形成受損，使傷口的愈合延遲，因而上調(diào)VEGF和EGF可以有效治療糖尿病足潰瘍[14-15]。有研究表明，復(fù)方黃柏液對難愈性蛇傷潰瘍具有較好的治療效果，可明顯升高體內(nèi)VEGF、EGF和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）的含量，從而促進(jìn)血管重塑，加速傷口愈合[16]。本研究結(jié)果提示，復(fù)方黃柏液可顯著提高糖尿病足潰瘍組大鼠血清中VEGF及EGF的含量，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。病理結(jié)果提示，復(fù)方黃柏液可增加糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管的數(shù)量，促進(jìn)肉芽組織生成，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方黃柏液對糖尿病足潰瘍愈合的促進(jìn)作用。

綜上所述，復(fù)方黃柏液涂劑可通過多靶點(diǎn)、多通路促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能通過炎癥信號通路、MAPKA信號通路及其他通路發(fā)揮作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方黃柏液可以降低炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，提高VEGF和EGF的表達(dá)。此研究為復(fù)方黃柏液治療糖尿病足潰瘍提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。