芪黃益腎方對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)和血-視網(wǎng)膜屏障功能的影響

袁麗莎，張寧 ，任秋月 ，楊榮祿 ，劉世巍 ，柳詩意 ，石凱峰 ，孟祥飛 ，于芳寧

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，約占糖尿病患者的三分之一，是全球范圍內(nèi)視力喪失和失明的主要原因[1-2]。早期非增殖性DR（NPDR）以視網(wǎng)膜血管擴張、迂曲，毛細血管閉塞及血管通透性增加為特征[3]。血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）破壞是導(dǎo)致DR血管通透性增加、黃斑水腫的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，是DR患者視力喪失的重要原因[4]。細胞間屏障連接如ZO-1 的表達在維持BRB 正常功能中發(fā)揮重要作用，ZO-1表達降低直接導(dǎo)致BRB完整性破壞，使毛細血管通透性增加、水液滲漏，組織水腫。

目前尚缺乏針對DR的特異性治療方案，較高的糖化血紅蛋白（HbA1c）和血壓被認為是視力障礙的危險因素[5]，西醫(yī)治療早期以控制血糖、血壓為主，抗血管內(nèi)皮生長因子藥物和全視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)僅適用于晚期增殖性DR（PDR）患者，且反復(fù)玻璃體注射給患者帶來極大痛苦，增加感染風(fēng)險[6]。

中醫(yī)學(xué)認為，DR是由消渴病日久，陰虛燥熱發(fā)展為氣陰兩傷，氣虛致瘀，導(dǎo)致瘀血阻于目絡(luò)，病機以氣陰兩虛為本，絡(luò)脈瘀阻為標(biāo)。本團隊前期基于臨床實踐，以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)為核心治法，擬芪黃益腎方用于糖尿病并發(fā)癥的治療，在治療糖尿病腎病方面有保護腎小球屏障功能、保護足細胞、降低尿蛋白、延緩腎功能進展的作用[7-9]。本實驗通過觀察芪黃益腎方對DR模型大鼠HbA1c水平、視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)、視網(wǎng)膜微血管形態(tài)、血-視網(wǎng)膜屏障功能及視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達的影響，探討其干預(yù)DR的作用和潛在機制。

1 實驗材料

1.1 動物

6周齡SPF級雄性SD大鼠48只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院動物實驗中心，溫度（23±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h/12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。高脂高糖飼料，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會實驗動物倫理分委員會批準(zhǔn)（BUCM-4-2021092303-3174）。

1.2 藥物及制備

芪黃益腎方由黃芪、太子參、生地黃、山萸肉、丹參、當(dāng)歸等組成[10]，飲片購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房，由北京首兒藥廠加工為顆粒劑，1劑原方相當(dāng)于顆粒劑24 g，用蒸餾水配制成0.5 g/mL藥液，臨用前稀釋為0.125、0.25 g/mL。羥苯磺酸鈣膠囊，Klocke Pharma Service，批號0607699，0.5 g/粒，使用前用蒸餾水配制成0.015 g/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，德國Sigma 公司，貨號S0130），檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液（北京普利萊，貨號B1213-1），2%伊文斯藍染色液（北京酷來博，貨號SL7203），F(xiàn)AS 眼球固定液（武漢Servicebio，貨號G1109-100ML），HbA1c檢測試劑盒（武漢云克隆，貨號CEA190Ra），ZO-1 抗體（美國Proteintech，貨號21773-1-AP），GAPDH抗體（美國Proteintech，貨號60004-1-1g），HE 染液（武漢Servicebio，貨號G1003），胰蛋白酶消化液（武漢Servicebio，貨號G4004），PAS染色液（武漢Servicebio，貨號G1008）。脫水機（意大利DIAPATH，型號Donatello），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），染色機（意大利DIAPATH，型號Giotto），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號Eclipse E100），成像系統(tǒng)（日本尼康，型號NIKON DS-U3），酶標(biāo)儀（美國Thermo，型號muLISKANMK3），熒光掃描儀（匈牙利3DHISTECH，型號Pannoramic MIDI）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

48只大鼠隨機取8只大鼠作為正常組，其余大鼠采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ腹腔注射建立DR模型[11]。高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠禁食12 h，予1%STZ溶液（以檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液pH=4.2配制，現(xiàn)用現(xiàn)配）30 mg/kg（3 mL/kg）低溫、避光腹腔注射。72 h后，3次檢測尾靜脈隨機血糖，≥16.7 mmol/L即為DR模型建立成功。正常組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)及等體積檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。將40只成模大鼠隨機分為模型組、羥苯磺酸鈣組和芪黃益腎方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組8只。

2.2 給藥

中藥中劑量按照人與大鼠等效劑量（1∶6.25）換算，低、中、高劑量按1∶2∶4比例計算，即中藥低、中、高劑量組每日灌胃1.25、2.5、5 g/kg芪黃益腎方藥液，羥苯磺酸鈣組按人與大鼠等效劑量0.15 g/kg灌胃，灌胃體積1 mL/100 g，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水。連續(xù)12周。

2.3 糖化血紅蛋白檢測

干預(yù)結(jié)束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取全血2 mL，室溫靜置20 min，2 000×g離心15 min，取上層血清，置于-20 ℃冰箱保存，按照試劑盒說明書檢測HbA1c含量。

2.4 HE染色

取大鼠眼球組織，置于FAS眼球固定液中固定，石蠟包埋，制備3 μm石蠟切片，常規(guī)HE染色，采用CaseViewer 2.1軟件觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化。每組取3張切片，每張切片隨機取3個視野，測量視網(wǎng)膜總厚度。

2.5 PAS染色

視網(wǎng)膜胰蛋白酶消化血管網(wǎng)鋪片PAS染色可直接觀察視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)形態(tài)。取大鼠眼球組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h以上。取出固定的眼球，洗去固定液，用細針頭沿鋸齒緣扎破，使房水流出，用眼科剪沿鋸齒緣環(huán)形剪開虹膜，剝離角膜和晶狀體，浸入PBS中洗掉玻璃體，以視神經(jīng)乳頭為中心，將杯狀眼球壁均勻分成3～4份，用尖頭鑷子輕輕剝離內(nèi)壁的視網(wǎng)膜層，在PBS溶液中浸洗0.5～12 h，放入胰蛋白酶消化液中，37 ℃烤箱消化過夜。吸管吸出視網(wǎng)膜，放入純水中反復(fù)吹打，直至視網(wǎng)膜血管網(wǎng)呈現(xiàn)透明狀，吸取視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，放置于載玻片上，自然晾干，常規(guī)PAS染色。

2.6 視網(wǎng)膜屏障功能檢測

大鼠麻醉后，尾靜脈注射2%伊文思藍（40 mg/kg），大鼠全身變藍后，脫頸處死，摘除眼球，4%多聚甲醛固定48 h以上。沿角鞏膜緣平分剪開眼球，輕輕剝離晶狀體和玻璃體，以視神經(jīng)乳頭為中心，將杯狀眼球壁均勻分成3～4份，用尖頭鑷子輕輕剝離內(nèi)壁的視網(wǎng)膜層，平鋪到載玻片上，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡掃描。

2.7 Western blot檢測

取出大鼠眼球后，用細針頭沿鋸齒緣扎破角膜，環(huán)形剪開，剝離晶狀體和玻璃體，取出視網(wǎng)膜，液氮速凍，-80 ℃冰箱凍存。取視網(wǎng)膜組織，加入裂解液，冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100 ℃變性處理5 min后上樣，進行凝膠電泳，4 ℃下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入ZO-1一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST充分洗膜，加入二抗，37 ℃搖床孵育2 h。加入顯影劑，全自動化學(xué)發(fā)光儀曝光拍照。采用Image J 1.8軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算ZO-1蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 芪黃益腎方對模型大鼠糖化血紅蛋白含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠HbA1c含量顯著增加（P＜0.001）；與模型組比較，芪黃益腎方中劑量組大鼠HbA1c 含量顯著減少（P＜0.01）；與羥苯磺酸鈣組比較，芪黃益腎方中劑量組大鼠HbA1c 含量顯著減少（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠HbA1c含量比較（±s，%）

表1 各組大鼠HbA1c含量比較（±s，%）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01；與羥苯磺酸鈣組比較，▲▲P＜0.01

HbA1c 0.95±0.12 1.80±0.40***1.74±0.27 1.21±0.17##▲▲1.55±0.26 1.73±0.23組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組羥苯磺酸鈣組只數(shù)555555

4.2 芪黃益腎方對模型大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)的影響

正常組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，層次清晰，各層細胞排列緊密規(guī)整；模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，層次不清，各層細胞排列松散不規(guī)則；與模型組比較，中藥各劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)有不同程度改善。見圖1。與正常組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜厚度顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，中藥中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜厚度顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度比較（±s，每組3只）

4.3 芪黃益腎方對模型大鼠視網(wǎng)膜微血管形態(tài)的影響

PAS染色結(jié)果顯示，正常組大鼠視網(wǎng)膜血管走行規(guī)則，周細胞清晰完整，無閉塞毛細血管；模型組大鼠視網(wǎng)膜血管走行迂曲，周細胞減少，出現(xiàn)閉塞毛細血管；與模型組比較，中藥各劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜微血管形態(tài)有不同程度改善。見圖3。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)形態(tài)（PAS染色，×400）

4.4 芪黃益腎方對模型大鼠血-視網(wǎng)膜屏障功能的影響

伊文思藍染色結(jié)果顯示，正常組大鼠視網(wǎng)膜組織幾乎無滲漏；模型組大鼠視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)明顯斑點、團片狀、彌散性滲漏區(qū)域；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜組織滲漏明顯減輕。見圖4。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織滲漏檢測（伊文思藍染色，×100）

4.5 芪黃益腎方對模型大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1 蛋白表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）；與羥苯磺酸鈣組比較，中藥中劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1 蛋白表達顯著升高（P＜0.001）。見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白免疫印跡

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達比較（±s，每組3只）

5 討論

DR是糖尿病累及微血管的并發(fā)癥，糖尿病病程較長，高血糖、高血壓是明確的危險因素，較高的HbA1c水平與DR的進展顯著相關(guān)[5]，強化血糖控制可以降低DR發(fā)病率，延緩惡化。DR分為早期NPDR和晚期PDR 2個階段，NPDR以血管內(nèi)皮損傷、微動脈瘤和斑點狀視網(wǎng)膜內(nèi)出血為主要臨床特征，BRB破壞是其主要的病理生理基礎(chǔ)。

BRB是視網(wǎng)膜與體循環(huán)之間的保護屏障，是維持視網(wǎng)膜正常微環(huán)境的必要結(jié)構(gòu)。BRB包括視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的內(nèi)血-視網(wǎng)膜屏障（iBRB）及視網(wǎng)膜外層的外血-視網(wǎng)膜屏障（oBRB）。oBRB由脈絡(luò)膜、Bruch's膜和視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞組成，作為脈絡(luò)膜血管與視網(wǎng)膜之間的物質(zhì)交換屏障；iBRB由視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞、周細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，是視網(wǎng)膜內(nèi)部微血管系統(tǒng)與視網(wǎng)膜間的重要屏障。BRB破壞以周細胞丟失和細胞間連接破壞為特征。周細胞是iBRB的重要組成部分，圍繞在視網(wǎng)膜毛細血管周圍，主要作用是維持內(nèi)皮細胞正常結(jié)構(gòu)和iBRB的屏障功能。DR期間，高糖和高級糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）會導(dǎo)致周細胞凋亡脫落，內(nèi)皮細胞增殖失控，血管生成失調(diào)，損害iBRB[12]。通過視網(wǎng)膜胰蛋白酶消化PAS染色，可以直觀地觀察視網(wǎng)膜微血管網(wǎng)形態(tài)，包括血管走行、周細胞、內(nèi)皮細胞、無細胞毛細血管、閉塞毛細血管等。內(nèi)皮細胞間和RPE 細胞間的緊密連接蛋白，如ZO-1、occludin、Claudin-5，是維持iBRB和oBRB完整性的重要分子蛋白。在DR期間，AGEs和活性氧產(chǎn)生增加，誘導(dǎo)炎癥因子和趨化因子上調(diào)，導(dǎo)致ZO-1和Claudin-5下調(diào)[13]，同時，毛細血管收縮和閉塞導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血[14]，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）產(chǎn)生增加，導(dǎo)致ZO-1和occludin表達降低[15]，BRB破壞，血管通透性增加，液體和蛋白質(zhì)滲漏，從而出現(xiàn)黃斑水腫和出血。伊文思藍染料是一種廣泛使用的非放射性血管內(nèi)示蹤劑，在血液中不可逆與血漿白蛋白結(jié)合，當(dāng)血漿蛋白從血管滲出時，伊文思藍-白蛋白復(fù)合物就會滲入周圍組織，可以通過熒光掃描直接觀察，常用于血管通透性檢查，被用于BRB功能的定性和定量評估[16]。羥苯磺酸鈣具有抗氧化、抗自由基和血管保護作用，被用于糖尿病微血管并發(fā)癥特別是DR的治療，可以抑制毛細血管通透性，抑制炎性因子，改善微血管瘤、視網(wǎng)膜滲出和出血，保護BRB[17]。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠HbA1c顯著增加，表明模型組大鼠血糖顯著升高；與模型組比較，中藥中劑量組大鼠HbA1c顯著減少，表明芪黃益腎方可以降低DR大鼠血糖。與正常組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜厚度顯著減少，閉塞毛細血管增多，出現(xiàn)明顯伊文思藍滲漏；與模型組比較，中藥中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜厚度有不同程度增加，閉塞毛細血管和伊文思藍滲漏明顯改善。Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達顯著下調(diào)，提示模型大鼠視網(wǎng)膜緊密連接破壞，BRB分子結(jié)構(gòu)受損，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠視網(wǎng)膜組織ZO-1蛋白表達不同程度升高，以中藥中劑量組升高最為明顯，提示芪黃益腎方可以上調(diào)緊密連接蛋白表達，保護DR大鼠BRB功能。

根據(jù)臨床癥狀，DR可歸屬中醫(yī)學(xué)“雀目”“視瞻昏渺”“消渴目病”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為，DR病機以消渴病陰虛燥熱為基礎(chǔ)，逐漸發(fā)展為氣陰兩虛，中氣虧虛，致精氣不能升舉于目，故視物不清。久病多瘀，且氣虛致瘀，瘀血阻于目絡(luò)，導(dǎo)致出現(xiàn)微血管瘤、視網(wǎng)膜出血和新生血管[18]，故氣陰兩虛、血瘀阻絡(luò)為關(guān)鍵病機。芪黃益腎方是本團隊基于多年臨床實踐創(chuàng)制的治療糖尿病微血管并發(fā)癥的經(jīng)驗方，方中黃芪、太子參益氣升提健脾，生地黃、山萸肉滋腎養(yǎng)陰填精，丹參、當(dāng)歸活血祛瘀通絡(luò)。全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功。藥理研究表明，黃芪甲苷可增加DR大鼠視網(wǎng)膜鋪片周細胞數(shù)量，減輕DR大鼠氧化應(yīng)激損傷[19]；丹參具有顯著抗氧化特性[20]，丹參提取物可以抑制內(nèi)皮細胞凋亡[21]和視網(wǎng)膜新生血管生成[22]；當(dāng)歸提取物可以抑制VEGF產(chǎn)生[23]及視網(wǎng)膜新生血管形成[24]。

綜上所述，芪黃益腎方可改善DR模型大鼠視網(wǎng)膜病理損害，改善微血管形態(tài)，減輕視網(wǎng)膜滲漏，可能通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1表達發(fā)揮對BRB的保護作用。本研究可為芪黃益腎方治療DR提供實驗依據(jù)。