中藥復方WCAP及拆方對人胰腺癌皮下移植瘤裸小鼠模型及IL?6/STAT3信號通路的影響

曹妮達，李朝燕，2，華逢春，3，馬芳琪，王 強，高 峰，朱瑩杰

1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院腫瘤一科（上海 200032）；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院中醫(yī)科（上海200025）；3.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院核醫(yī)學科（上海 200032）

胰腺癌是高度惡性的腫瘤之一，居我國惡性腫瘤發(fā)病率第11位，病死率第7位［1］。由于早期多為非特異性癥狀，約60%的胰腺癌患者在確診時已發(fā)生遠處轉移，25%的患者為局部晚期，不能行根治性切除，而接受姑息化療者的中位生存時間僅8.8～11.1 個月［2-5］，且已知藥物靶點如Ras 和BRCA 突變等在胰腺癌中發(fā)生率低下，靶向和免疫治療均尚未在胰腺癌中有腫瘤控制和生存期增加方面的顯著性突破［6-7］，預后極差。因此，探究胰腺癌的發(fā)病機制，尋找對胰腺癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉移等方面調控的信號通路，進而從分子水平尋求治療靶點仍是當前基礎研究的重點。

白介素-6/信號轉導和轉錄激活因子3（IL-6/STAT3）信號通路是參與免疫、細胞生長、細胞分化以及造血等多種生理過程的經典信號通路［8］。IL-6 是由位于腫瘤微環(huán)境中的多種細胞（包括免疫細胞、基質細胞和腫瘤細胞本身）產生的細胞因子，直接作用于腫瘤細胞并誘導STAT3 靶基因的表達，然后編碼驅動腫瘤細胞增殖和/或存活的蛋白質，介導STAT3的持續(xù)激活、腫瘤的發(fā)生、血管生成、免疫抑制及腫瘤的侵襲轉移等過程［9］。多項研究［10-14］顯示，在肝癌、胃癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、白血病等多種人及鼠的惡性腫瘤中有STAT3 的過度激活及表達，但在胰腺癌中的研究報道較少。

全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室導師、上海市名中醫(yī)邱佳信教授提出脾虛在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的重要作用，并創(chuàng)立中藥復方WCAP，臨床用于治療胰腺癌30 余年。WCAP 以健脾益氣為主，輔以清熱解毒、軟堅散結。前期相關研究［15-17］提示，與化療組比較，化療聯合中藥復方WCAP 組可降低晚期胰腺癌死亡風險48%，同時可改善根治術后患者的預后，提高患者生存質量，并能抑制BxPC-3裸小鼠皮下移植瘤的生長，提高血清自然殺傷（NK）細胞水平。為明確該復方中不同治則成分對腫瘤的抑制情況，以及單用清熱解毒藥或軟堅散結藥是否有更強的抑瘤作用，本研究通過BxPC-3細胞株懸液形成胰腺癌裸小鼠皮下接種瘤模型，觀察中藥復方WCAP 及其拆方對裸小鼠皮下腫瘤、瘤組織中IL-6/STAT3 通路及其下游靶基因mRNA 及蛋白表達水平的影響，探索中藥復方WCAP 中對胰腺癌的抑瘤機制，并為深入機制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胰腺癌BxPC-3 細胞株，購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 動物 6～8 周齡雄性裸小鼠（BALB/C）30 只，SPF 級，體質量17～22 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。動物生產合格證號：SCXK（滬）2012-0002。實驗動物按SPF 級動物實驗要求飼養(yǎng)并管理，飼養(yǎng)于復旦大學醫(yī)學院動物房。動物使用合格證號：SYXK（滬）2016-0004。

1.1.3 藥物與試劑 WCAP 方由太子參12 g、炒白術12 g、茯苓15 g、龍葵30 g、紅藤30 g、芙蓉葉30 g、生牡蠣30 g、夏枯草9 g、半夏9 g、壁虎4.5 g、雞內金15 g 組成。處方以健脾益氣、清熱解毒、軟堅散結為治則，故拆方為健脾藥、清熱解毒藥和軟堅散結藥。健脾藥物：太子參12 g，炒白術12 g，茯苓15 g，雞內金15 g；清熱解毒藥物：龍葵30 g，紅藤30 g，芙蓉葉30 g；軟堅散結藥物：生牡蠣30 g，夏枯草9 g，半夏9 g，壁虎4.5 g。復方組藥物即原方。所有藥物來自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房，單味生藥由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院藥劑科主任中藥師奚燕鑒定為正品。

5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司（批號：090906）；原癌基因c-myc（c-myc）蛋白、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、IL-6，美國Sigma公司（批號分別為ab32072、ab134175、ab46154、ab92536、ab6672）；磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3（p-STAT3），美國Santa Cruz Biotechnology 公司（批號：T5625）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，美國CST公司（批號：#5174）；山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，碧云天生物技術有限公司（批號：A0208）；山羊抗鼠HRP標記二抗，碧云天生物技術有限公司（批號：A0216）；SYBR GREEN qPCR Super Mix（qPCR 試劑盒），美國Thermo Fisher Scientific 公司（批號：#K0223）；逆轉錄試劑盒，美國Fermentas 公司（批號：#K1622）；氯仿，中國醫(yī)藥集團有限公司（批號：10023419）；TRIzol試劑，美國Invitrogen 公司（批號：1596-026）；蛋白質定量試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司（批號：PICPI23223）。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo 株式會社（型號：MCO-18AIC）；細胞計數儀，瑞士Roche 公司（型號：Cedex XS）；超凈工作臺，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司（型號：AlphaClean 1300）；PCR分析儀，美國ABI公司（型號：StepOne Plus）；蛋白垂直電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司（型號：Mini-PROTEAN Tetra Cell）；轉膜儀，美國Bio-Rad公司（型號：Trans-Blot Turbo）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)，美國UVP公司（型號：EC3 410）。

1.2 造模 建立人胰腺癌BxPC-3 細胞裸小鼠皮下移植瘤模型［18］。采用人胰腺癌細胞株BxPC-3 體外傳代培養(yǎng)，經胰酶消化制成細胞懸液，將1×106個（0.2 mL）細胞懸液接種于裸小鼠右前肢腋窩處皮下，每天觀察成瘤情況并記錄。

1.3 分組與干預 將30 只裸小鼠按隨機數字表法隨機分為空白對照組、5-FU組、復方組、健脾組、清熱解毒組和軟堅散結組，共6 組，每組5 只。以70 kg 成人體質量計算用藥劑量，按人與裸小鼠藥物等效劑量進行轉換［19］，折算每1 kg 裸小鼠需要的用藥劑量，按每10 g 小鼠體質量灌胃量體積0.2 mL，計算得到各組藥物煎煮濃度。不同干預組藥物于同一天、同一煎藥房分別進行煎煮。藥材以清水浸泡30 min，煎煮30 min 后倒出藥汁，將藥汁按所需藥物濃度進行濃縮。各組于裸小鼠造模后第2 天開始干預：復方組、健脾組、清熱解毒組、軟堅散結組分別給予相應的中藥煎劑灌胃（每只裸小鼠0.4 mL/d，以下灌胃藥液體積均同），并用質量分數為0.9%的氯化鈉溶液0.04 mL 腹腔內注射，1 次/周；5-FU 組予5-FU 0.04 mL（即1 mg）腹腔內注射，1 次/周，并用質量分數為0.9%的氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，1次/d；空白對照組予質量分數為0.9%的氯化鈉溶液灌胃，1 次/d，并用質量分數為0.9%的氯化鈉溶液0.04 mL 腹腔內注射，1次/周。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 裸小鼠皮下移植瘤抑瘤率 造模后第43 天，稱取裸小鼠體質量，采用頸椎脫臼法處理后，完整地剝出瘤體，去除表面脂肪組織，稱取瘤質量。抑瘤率=（空白對照組平均瘤質量-各治療組平均瘤質量）/空白對照組平均瘤質量×100%。

1.4.2 IL-6/STAT3 通路及下游靶基因mRNA 的表達采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）法檢測小鼠瘤組織中IL-6/STAT3 通路及下游靶基因（c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6、p-STAT3）mRNA的表達。取得裸小鼠瘤體組織后，以TRIzol 法提取瘤組織總RNA，逆轉錄反應體系為25 μL，根據試劑說明書操作，按條件進行逆轉錄。反應條件：37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min。擴增引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成（見表1）。PCR 反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s；40個循環(huán)。以GAPDH的表達為內參，用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.4.3 IL-6/STAT3 通路及下游靶基因蛋白的表達 采用Western blot檢測IL-6/STAT3通路及下游靶基因涉及的c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6、p-STAT3 蛋白的表達。取得裸鼠瘤體組織后，將瘤體組織剪成細小的碎片，按每20 mg 組織加入150～250 μL 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱，采用蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度。部分上清加入4倍濃度上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，置于4%電泳濃縮膠濃縮，10%蛋白電泳分離膠分離，再經轉膜、封閉，加入相應的一抗4 ℃暗盒過夜，洗膜液洗膜3 次，10 min/次。加入相應的二抗37 ℃孵育1 h，洗膜液洗膜3 次，10 min/次，采用增強型化學發(fā)光試劑熒光底物進行化學發(fā)光、顯色，用凝膠成像儀拍照，以ImageJ 軟件進行灰度分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/同一樣本內參表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數據采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，均數間多重比較采用最小顯著差法（LSD 檢驗）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對裸小鼠皮下移植瘤抑瘤率的影響 與空白對照組比較，各治療組瘤質量均減輕，瘤體積均減小，抑瘤率由低到高分別為健脾組35.87%、清熱解毒組49.05%、軟堅散結組64.60%、復方組70.48%、5-FU 組78.25%，WCAP 復方及其拆方和5-FU 組均可抑制裸小鼠皮下移植瘤的生長（P<0.05）。與空白對照組比較，5-FU 組和軟堅散結組裸小鼠體質量降低（P<0.05），復方組、健脾組、清熱解毒組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。復方組抑瘤率高于各拆方組，各拆方組中，軟堅散結組抑瘤率最高（P<0.05）。與5-FU組比較，復方組、健脾組、清熱解毒組和軟堅散結組瘤體積較大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與5-FU 組比較，健脾組、清熱解毒組、軟堅散結組瘤質量較重，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但復方組瘤質量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與復方組比較，健脾組和清熱解毒組瘤體積較大，瘤質量較重，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但軟堅散結組瘤體積及瘤質量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與健脾組比較，清熱解毒組和軟堅散結組瘤體積較小，瘤質量較輕，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與清熱解毒組比較，軟堅散結組瘤體積較小，瘤質量較輕，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組裸小鼠皮下移植瘤抑瘤情況比較

表2 各組裸小鼠瘤質量、抑瘤率等比較（n=5，±s）

表2 各組裸小鼠瘤質量、抑瘤率等比較（n=5，±s）

注：5?FU 為5?氟尿嘧啶。與空白對照組比較，*P<0.05；與5?FU 組比較，#P<0.05；與復方組比較，△P<0.05；與健脾組比較，▽P<0.05；與清熱解毒組比較，▲P<0.05。

組別空白對照組5-FU組復方組健脾組清熱解毒組軟堅散結組體質量/g 24.82±0.26 23.44±0.26*22.98±0.78 23.35±1.07 24.61±0.49 23.11±0.13*瘤體積/mm3 2 095.64±216.00 281.22±31.21*606.73±68.37*#1 301.02±27.36*#△1 023.05±156.35*#△▽775.23±36.95*#▽▲抑瘤率/%-78.25 70.48 35.87 49.05 64.60瘤質量/g 2.10±0.18 0.46±0.19*0.62±0.04*1.35±0.07*#△1.07±0.11*#△▽0.73±0.03*#▽▲

2.2 對裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA 表達的影響 與空白對照組比較，復方組、軟堅散結組和5-FU 組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達降低（P<0.05）。而健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與5-FU 組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達升高（P<0.05）。與復方組比較，健脾組cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達升高（P<0.05），清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達升高（P<0.05）。與健脾組比較，軟堅散結組cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達升高（P<0.05）。與清熱解毒組比較，軟堅散結組c-myc、cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA表達升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA表達比較（n=5，±s）

表3 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA表達比較（n=5，±s）

注：c?myc為原癌基因c?myc基因，cyclin D1為細胞周期蛋白D1基因，VEGF 為血管內皮生長因子基因，MMP?2為基質金屬蛋白酶?2基因，IL?6為白介素?6基因，p?STAT3為磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3基因。5?FU 為5?氟尿嘧啶。與空白對照組比較，*P<0.05；與5?FU 組比較，#P<0.05；與復方組比較，△P<0.05；與健脾組比較，▽P<0.05；與清熱解毒組比較，▲P<0.05。

p?STAT3 0.59±0.11 0.12±0.01*0.19±0.03*0.51±0.04#△0.54±0.08#△0.30±0.01*#▽▲組別空白對照組5-FU組復方組健脾組清熱解毒組軟堅散結組c?myc 0.82±0.27 0.12±0.01*0.23±0.02*0.46±0.05#0.68±0.20#△0.32±0.01*▲cyclin D1 0.73±0.24 0.11±0.01*0.20±0.01*0.50±0.05#△0.64±0.15#△0.26±0.01*▽▲VEGF 1.15±0.30 0.20±0.02*0.36±0.02*0.88±0.08#△0.85±0.14#△0.56±0.02*#▽▲MMP?2 0.90±0.21 0.20±0.04*0.35±0.07*0.72±0.04#△0.78±0.15#△0.53±0.01*#IL?6 0.54±0.19 0.09±0.02*0.11±0.01*0.38±0.01#△0.49±0.14#△0.15±0.02*▽▲

2.3 對裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達的影響 與空白對照組比較，復方組和5-FU 組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6 和p-STAT3的蛋白表達均降低（P<0.05），軟堅散結組c-myc、MMP-2 和IL-6 的蛋白表達均降低（P<0.05）。健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6 和p-STAT3 的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與5-FU 組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc、VEGF 和IL-6的蛋白表達升高（P<0.05），軟堅散結組c-myc 和IL-6 的蛋白表達升高（P<0.05）。與復方組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc 和IL-6 的蛋白表達升高（P<0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達情況

表4 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達比較（n=5，±s）

表4 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達比較（n=5，±s）

注：c?myc為原癌基因c?myc，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，VEGF 為血管內皮生長因子，MMP?2為基質金屬蛋白酶?2，IL?6為白介素?6，p?STAT3為磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3。5?FU為5?氟尿嘧啶。與空白對照組比較，*P<0.05；與5?FU組比較，#P<0.05；與復方組比較，△P<0.05。

p-STAT3 3.18±0.89 1.16±0.11*1.37±0.25*2.76±0.77 2.73±0.74 2.13±0.76組別空白對照組5-FU組復方組健脾組清熱解毒組軟堅散結組c-myc 3.03±0.47 0.68±0.02*1.06±0.08*2.41±0.44#△2.43±0.50#△1.78±0.38*#cyclin D1 3.46±0.72 1.20±0.45*1.73±0.29*2.84±0.94 2.84±1.10 2.19±0.72 VEGF 3.05±0.68 1.11±0.44*1.42±0.30*2.46±0.59#2.63±0.56#2.04±0.37 MMP-2 2.65±0.45 8.20±0.42*1.29±0.39*2.17±0.64 2.16±0.61 1.69±0.31*IL-6 3.90±0.66 1.06±0.11*1.66±0.23*3.16±0.24#△3.05±0.50#△2.41±0.54*#

3 討論

目前，外科手術是唯一可能治愈胰腺癌的手段，但由于胰腺癌隱匿性高、缺乏早期臨床特異性癥狀，只有小部分患者在診斷時適合進行手術切除；而即便已行切除，仍因其對傳統(tǒng)治療手段欠敏感、局部復發(fā)與遠處轉移率高的特征，患者的5年生存率不足10%。中醫(yī)古典文獻中并無“胰腺癌”的具體病名，但有類似胰腺癌的論述，例如“脾病，當臍有動氣，按之牢若痛。動氣筑筑然，堅牢如有積而硬，若似痛也，甚則亦大痛，有是則脾虛病也”（《脾胃論》），相關描述與胰腺癌上腹痛和腹塊癥狀相似。

“邪之所湊，其氣必虛”，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與脾密切相關，究其根源是脾虛所致。李東垣在《蘭室秘藏》中指出：“推其百病之源，皆因飲食勞倦，而胃氣元氣漸散，不能滋榮百脈、灌溉臟腑、衛(wèi)護周身之所致也。”健脾扶正是中醫(yī)治療胰腺腫瘤的基本法則，WCAP 是邱佳信教授及其團隊以健脾法為主，辨證結合清熱解毒、軟堅散結等法形成的治療胰腺癌的中藥復方。臨床研究［16］提示，遵循該法則的中藥復方是影響胰腺癌患者生存期的獨立預后因素，可以改善根治術后以及晚期胰腺癌患者的生存期，西醫(yī)綜合治療聯合中藥的晚期胰腺癌患者生存期為12.7 個月，較單純西醫(yī)綜合治療患者的9.9個月顯著延長。

現代研究發(fā)現，胰腺癌的發(fā)生與局部慢性炎癥密切相關。為探討單用清熱解毒或軟堅散結等“祛邪”藥物力量能否取得與復方類似的腫瘤抑制作用，課題組開展了本次復方與拆方的研究。本研究通過BxPC-3細胞株懸液制備胰腺癌裸小鼠皮下接種瘤模型，研究中藥復方WCAP 及其拆方對裸小鼠皮下腫瘤的影響，觀察復方WCAP中對人胰腺癌BxPC-3細胞株裸小鼠皮下瘤產生影響的可能成分。本研究結果顯示，抑瘤率由低到高分別為健脾組、清熱解毒組、軟堅散結組、復方組、5-FU 組，提示WCAP 及其拆方和5-FU 組均可抑制裸小鼠皮下移植瘤的生長（P<0.05）；各拆方組中，軟堅散結組抑瘤率最高。而裸小鼠體質量結果顯示，5-FU組和軟堅散結組裸小鼠體質量降低（P<0.05），復方組、健脾組、清熱解毒組則差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與臨床所見化學療法患者干預早期多見腫瘤明顯縮小，但后期多合并有體質量下降等惡病質相似；各拆方組中，健脾組抑瘤率雖遜于軟堅散結組，但后者小鼠體質量也明顯降低，而加入健脾藥物的復方組抑瘤率高于軟堅散結組，小鼠體質量也無顯著降低，體現出中醫(yī)治療注重整體觀念，扶正和祛邪并重，不可一味攻邪，不拘泥于一時瘤體的大小。本研究提示，復方WCAP 組方合理，健脾益氣藥物扶助人體正氣為治本，清熱解毒聯合軟堅散結祛邪外出為治標，寓攻于補，一方面使機體不斷適應內在環(huán)境，達到新的“穩(wěn)態(tài)平衡”，另一方面可充分調節(jié)體內抗瘤機制，聯合化療使腫瘤生長速度減慢，甚至使腫瘤縮小。這與臨床上接受中醫(yī)藥干預的化療患者較單純化療患者消化道反應、骨髓抑制等不良反應減少、生活質量改善的現象相符；這也提示臨床，腫瘤前期及中期，如人體正氣尚強，在扶正基礎上，清熱解毒、軟堅散結等祛邪藥物劑量可稍大，以達抗瘤的目的，而至腫瘤晚期，正氣耗損，則需注重扶正健脾對改善生活質量、長期生存的重要作用。

胰腺癌的發(fā)生是多環(huán)節(jié)、多步驟參與的復雜過程，尤其炎癥反應在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，IL-6是STAT3 重要的細胞活化因子，通過自分泌或旁分泌途徑作用于受體IL-6 Rα 和共同受體gpl30 激活JAK/STAT 信號通路，從而誘發(fā)腫瘤［20-21］。其信號通路受細胞因子、生長因子等細胞外信號刺激，作用于細胞核內特異的DNA結合位點，調節(jié)特定基因的表達，影響細胞的增殖、分化、凋亡和侵襲轉移。c-myc 基因編碼蛋白質是一種短半衰蛋白，能調節(jié)乳酸脫氫酶（LDH-A）、細胞周期蛋白（cyclin）、凋亡相關蛋白Bax的表達［22］，從而介導細胞外的傳入生物信號向細胞核內傳遞，調控細胞的增殖和凋亡［23］。cyclin D1 是細胞周期調節(jié)的正性調控因子，同時又是STAT3 的靶作用物之一。cyclin D1 在一定的條件下可被STAT3 激活，異常高表達cyclin D1可明顯減少G1期，促進細胞通過G-S調控點，引發(fā)細胞周期的紊亂和增殖失調［24-25］。持續(xù)性激活的STAT3 信號轉導通路在血管重建、浸潤轉移等過程中起重要作用，磷酸化STAT3蛋白可使MMP-2過度表達，導致基質降解，進而有利于腫瘤細胞的浸潤轉移。VEGF 是促進血管新生的生長因子，STAT3 在VEGF基因啟動子區(qū)有結合位點，持續(xù)激活STAT3能誘導VEGF表達，導致腫瘤形成新生血管［26］。本實驗通過觀察IL-6/STAT3信號通路上相關靶基因的表達，探討中藥復方WCAP 及其拆方治療胰腺癌的分子機制。結果顯示，中藥復方WCAP 可下調c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的mRNA 和蛋白表達，說明WCAP 有抑制胰腺癌增殖及轉移的作用，與前期WCAP 可抑制胰腺癌生長的研究結果一致［18］。與此同時，各拆方組中，僅軟堅散結組藥物體現出c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的mRNA 表達降低和c-myc、MMP-2 蛋白的表達降低，其他拆方組則未顯示出差異，這也與軟堅散結組小鼠在所有拆方組中體質量最輕、瘤體最小的情況相符。從另一角度提示，各拆方可通過協同作用，將抗腫瘤的整體作用最大化，使得WCAP 復方在抑瘤率、小鼠帶瘤體質量及IL-6/STAT3 通路及其下游靶基因調控方面作用更好。同時WCAP 可下調IL-6及p-STAT3的mRNA 和蛋白的表達，顯示出WCAP 的抗腫瘤作用機制可能是通過抑制IL-6/STAT3 信號通路的活化并下調相關基因c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的表達來實現。

綜上所述，本研究從IL-6/STAT3 信號通路角度闡述中藥復方WCAP 及其拆方治療胰腺癌的分子機制，為臨床應用提供了一定的實驗支持。進一步完善針對該信號通路的靶向治療機制，可能對治療胰腺癌起到積極的作用，進而達到穩(wěn)定、緩解乃至更加理想的治療效果。但是，由于胰腺癌的發(fā)病機制復雜，涉及多條通路、多靶點的共同作用，需在進一步的實驗中探尋中藥復方WCAP 抑制胰腺癌細胞的具體靶點，為中藥治療胰腺癌尋找更適合的途徑。