專家評估在雜質(zhì)遺傳毒性（定量）構(gòu)效關(guān)系評價中的應(yīng)用

耿 雪，祝清芬，魏 霞，蘇昕宇，劉 娜，錢利民

（1. 山東省食品藥品檢定研究院·國家藥監(jiān)局仿制藥研究與評價重點實驗室·山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)中心，山東 濟南 250101； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355； 3. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院·山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟南 250014）

藥物遺傳毒性雜質(zhì)的控制是藥品質(zhì)量和風(fēng)險管理的重要方面。（定量）構(gòu)效關(guān)系［（Q）SAR］評價是目前藥物雜質(zhì)遺傳毒性評價的有效手段［1］，評價結(jié)果可作為雜質(zhì)遺傳毒性確定的依據(jù)及藥品注冊資料。人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（ICH）M7（R1）指導(dǎo)原則基于風(fēng)險評估的原則，按照物質(zhì)的致癌性和突變性風(fēng)險，將藥物雜質(zhì)分為1～5 類，規(guī)定評價程序為檢索文獻中雜質(zhì)的致突變性、致癌性數(shù)據(jù)，并分為1 類、2 類、5 類［2］。（Q）SAR 方法是根據(jù)警示結(jié)構(gòu)和對細(xì)菌回復(fù)突變試驗的預(yù)測進行分類，要求采用2 個互補的（Q）SAR 預(yù)測方法，分別基于專家規(guī)則和統(tǒng)計學(xué)［3］。目前，常用的商業(yè)化軟件包括Nexus 軟件、CASE Ultra 軟件、Model Applier 軟件等［4-5］。經(jīng)預(yù)測，若雜質(zhì)含有與原料藥或與原料藥相關(guān)的物質(zhì)相同的警示結(jié)構(gòu)如工藝中間體，且該原料藥或與原料藥相關(guān)的物質(zhì)經(jīng)測試為無致突變性，則可歸為4 類；若含有警示結(jié)構(gòu)，但有充分?jǐn)?shù)據(jù)認(rèn)為該警示結(jié)構(gòu)無致突變性或致癌性，或不含有警示結(jié)構(gòu)，則可歸為5 類；若含有與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)的警示結(jié)構(gòu)，但無致突變性數(shù)據(jù)，則可歸為3 類［6］。但（Q）SAR 預(yù)測結(jié)果并不能保證完全準(zhǔn)確，且在實際預(yù)測過程中，除出現(xiàn)陰性（4 類、5 類）、陽性（1 類、2 類、3 類）結(jié)果外，有時還會得到未分類結(jié)果。對此，ICH M7（R1）指導(dǎo)原則中提到，對計算機系統(tǒng)得到的任何陽性、陰性、相互矛盾或超出域的預(yù)測結(jié)果，如有必要申請人可根據(jù)專家知識進行綜合評估，提供進一步支持性證據(jù)，合理論證，并得出最終結(jié)論。應(yīng)用專家知識進行評估可獲得明確的分類結(jié)果，提高（Q）SAR 的預(yù)測性能及準(zhǔn)確性。Ames 試驗是化合物（Q）SAR 建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫的重要基礎(chǔ)［7］。專家評估可通過比較具有細(xì)菌回復(fù)突變試驗分析數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)類似的化合物（跨讀法），確定該化合物是否有可能與DNA 發(fā)生反應(yīng)，采用第三方軟件進行補充預(yù)測的方式［8-10］。ICH M7（R1）并未提供指定的專家評估程序，故利用專家知識評價挑戰(zhàn)性很強［11-13］，我國尚未見相關(guān)研究報道。為此，本研究中依據(jù)ICH M7（R1）指導(dǎo)原則相關(guān)要求，采用Derek Nexus（基于專家知識規(guī)則）和Sarah Nexus（基于統(tǒng)計學(xué)）軟件對實例化合物進行遺傳毒性雜質(zhì)評價，并進一步利用專家知識評估，提供合理論證，獲得最終分類結(jié)果，為藥品審評過程中專家評估的應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 軟件版本與方法

1.1 軟件版本

Nexus：2.5.0，英國Lhasa 公司（http：// www. lhasalimited. org/）旗下Derek，Sarah，Vitic，Meteor，Zeneth 等軟件的整合平臺。Derek Nexus 版本：6.1.1；數(shù)據(jù)庫：Derek KB 2020；數(shù)據(jù)庫版本：1.0。Derek用于雜質(zhì)遺傳毒性預(yù)測，基本設(shè)置為，物種（species）設(shè)置為細(xì)菌（bacterium），預(yù)測終點（endpoints）設(shè)置為遺傳毒性（genotoxicity）項下的致突變性（mutagenicity）。Sarah Nexus 版本：3.2.0；模型：Sarah Model-2022.1；模型版本：1.9。

1.2 方法

繪制實例1、實例2、實例3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖，輸入Nexus 軟件，采用ICH M7（R1）分類模式對雜質(zhì)進行遺傳毒性預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 實例1

雜質(zhì)實例1：預(yù)測結(jié)果Derek為陰性（Incative），Sarah為陽性（Positive），軟件分類為3 類。Sarah 陽性可信度為23%，基于軟件標(biāo)注，提供了4 個結(jié)構(gòu)陽性假說，hypotheses ID分別為H-32，H-248，H-285，H-254（表1）。根據(jù)軟件內(nèi)置的專家評價機制，按Lhasa 公司的警示結(jié)構(gòu)- 預(yù)測假設(shè)關(guān)聯(lián)規(guī)則，依據(jù)與雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似度排序，采用Derek分析相似度最大的17個遺傳毒性陽性化合物，發(fā)現(xiàn)其造成雜質(zhì)遺傳毒性陽性的警戒結(jié)構(gòu)包括代號分別為329，344，326，664，027，007 的芳香硝基化合物、1，2-二羰基化合物或前體、偕二鹵、α，β不飽和化合物、烷化劑、N-硝基或N-亞硝基化合物，均不存在于雜質(zhì)實例1（表2）。人為添加軟件中的討論意見18 內(nèi)容見圖1。最終經(jīng)軟件評價和專家評估，將雜質(zhì)實例1預(yù)測為遺傳毒性陰性，分類為5類（表3）。

圖1 討論意見18內(nèi)容Fig.1 Content of arguments opinion 18

表1 雜質(zhì)實例1 Sarah預(yù)測假說Tab.1 Sarah prediction hypothesis of impurity case 1

表2 雜質(zhì)實例1相似遺傳毒性化合物信息Tab.2 Information of genotoxic compounds similar to impurity case 1

表3 雜質(zhì)實例1遺傳毒性預(yù)測結(jié)果Tab.3 Genotoxicity prediction results of impurity case 1

2.2 實例2

化合物實例2 預(yù)測結(jié)果Derek 為陰性（Inactive），Sarah為模棱兩可（Equivocal），軟件未得到分類結(jié)果。基于軟件標(biāo)注，Sarah提供了1個結(jié)構(gòu)陰性假說（hypotheses ID 為H - 243）和1 個結(jié)構(gòu)陽性假說（hypotheses ID 為H-275），詳見圖2。根據(jù)軟件內(nèi)置的專家評價機制，按照Lhasa 公司的警示結(jié)構(gòu)-預(yù)測假設(shè)關(guān)聯(lián)規(guī)則，依據(jù)與雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似度排序，陽性假說H-275 中相似度最大50 個化合物中有25 個化合物遺傳毒性為陽性（表4），對這25 個化合物分別利用Derek 分析后，發(fā)現(xiàn)其造成化合物遺傳毒性陽性的警戒結(jié)構(gòu)代號分別為820，842，074，073，318，070，304，072，794，638，318，617，repidprototype 154，317 的芳香硝基化合物、1，2 -二羰基化合物或前體、偕二鹵、烷化劑、N-硝基或N-亞硝基化合物、異氰酸酯或異硫氰酸鹽、環(huán)氧化物、鹵代硫醇衍生物、羥基脲/胍/氨基甲酸酯、疊氮化物、鹵代烯烴、苯胺或前體、芐基二甲基三氮烯，均不存在于雜質(zhì)實例2。人為添加軟件中的討論意見33內(nèi)容見圖3。最終經(jīng)軟件評價和專家評估，將雜質(zhì)實例2判定為遺傳毒性為陰性，分類為5類（表5）。

圖2 雜質(zhì)實例2 Sarah預(yù)測假說Fig.2 Sarah prediction hypothesis of impurity case 2

圖3 討論意見33內(nèi)容Fig.3 Content of arguments opinion 33

表4 雜質(zhì)實例2相似遺傳毒性化合物信息Tab.4 Information of genotoxic compounds similar to impurity case 2

表5 雜質(zhì)實例2遺傳毒性預(yù)測結(jié)果Tab.5 Genotoxicity prediction results of impurity case 2

2.3 實例3

化合物實例3 預(yù)測結(jié)果Derek 為陰性（Incative），Sarah 為陰性（Negative），軟件預(yù)測結(jié)果為陰性。Sarah 可信度為33%，基于軟件標(biāo)注，提供了1 個結(jié)構(gòu)陰性假說（hypotheses ID為H-235），數(shù)據(jù)集中有11個結(jié)構(gòu)類似化合物，詳見圖4。根據(jù)軟件內(nèi)置數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該化合物有致癌性和致突變性試驗數(shù)據(jù)，致癌性為陽性，Ames試驗中TA98菌株既有陽性結(jié)果也有陰性結(jié)果（圖5）?；谄渲掳┬燥L(fēng)險，人為添加軟件中的討論意見39內(nèi)容見圖6。最終經(jīng)軟件評價和專家評估，將雜質(zhì)實例3預(yù)測為遺傳毒性為陽性，分類為1類（表6）。

圖4 雜質(zhì)實例3 Sarah預(yù)測假說Fig.4 Sarah prediction hypothesis of impurity case 3

圖5 Ames試驗菌株結(jié)果示意圖Fig.5 Schematic diagram of the Ames test result

圖6 討論意見39內(nèi)容Fig.6 Content of arguments opinion 39

表6 雜質(zhì)實例3遺傳毒性預(yù)測結(jié)果Tab.6 Genotoxicity prediction results of impurity case 3

3 討論

ICH M7（R1）指導(dǎo)原則建議使用互補（Q）SAR 模型作為Ames 試驗的高通量替代檢驗方法來評估藥物雜質(zhì)的致突變潛力，還指出在必要時應(yīng)使用專家知識回顧來為任何陽性、陰性的未分類或有沖突的預(yù)測結(jié)果提供明確的理論依據(jù)，并得到最終結(jié)論。一項美國食品和藥物管理局（FDA）對2017 年4 月至2019 年3 月在藥品監(jiān)管申請中評估的1 002 種雜質(zhì)的回顧性分析中，評估了專家審查對（Q）SAR 預(yù)測的影響，專家知識回顧推翻了26%的錯誤預(yù)測，解決了91%的模棱兩可（Equivocal）的預(yù)測和75% 的超出域（Outside domain）的結(jié)果［14］。261個被推翻的預(yù)測中，15%的預(yù)測上調(diào)至“模棱兩可”或“陽性”，79%的預(yù)測下調(diào)至“模棱兩可”或“陰性”［14］。

應(yīng)用專家知識對預(yù)測結(jié)果進行評價取決于預(yù)測結(jié)果的質(zhì)量，如是否可信度較高、是否存在無法正確判斷的結(jié)構(gòu)等信息。對于兩類軟件給出了一致的預(yù)測結(jié)果，專家評估較易給出結(jié)論，但對于兩類軟件結(jié)果不一致、模棱兩可、超出域等情況，進行專家評估需要研究者具備深厚的專業(yè)知識的和豐富的工作經(jīng)驗。利用專家知識進行評估時，依據(jù)要充分，特別是將陽性預(yù)測結(jié)果評價為陰性時，一定要充分考慮被評價雜質(zhì)的風(fēng)險［15］。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注專家評估，并給出了經(jīng)典案例［11，16］。本研究中提供的3 個案例均為筆者在雜質(zhì)遺傳毒性評價工作中遇到的實際案例，不僅包含了2 類軟件結(jié)果不一致、未得到分類結(jié)果，還包含了1 個一致陰性預(yù)測結(jié)果被推翻的實例，可為藥物雜質(zhì)遺傳毒性評價中應(yīng)用專家知識評估提供參考。