補骨脂乙素治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子作用機制

楊 提, 李 珊, 鄧生瓊

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院, 上海 200135)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC) 是一種由免疫調(diào)節(jié)功能紊亂引發(fā)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病, 可導(dǎo)致腸道炎癥或潰瘍, 增加結(jié)直腸癌風(fēng)險[1-2]. 目前, 臨床上治療UC 的藥物主要是氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素等藥物通過阻礙引起腸道炎癥的免疫炎癥途徑發(fā)揮作用,但復(fù)發(fā)率高、副作用明顯. 隨著臨床上關(guān)于中藥治療UC 的研究增多, 中藥治療UC 的優(yōu)勢逐漸凸顯. 四神丸、寧腸湯和理脾愈瘍湯在治療UC 有一定的療效[3-5], 而補骨脂是上述3 種方劑的君藥, 具有納氣、止瀉、收斂、溫腎、助陽等功效. 補骨脂乙素是一種從補骨脂中提取獲得的天然査爾酮類小分子化合物, 具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性藥理作用[6]. 研究表明, 補骨脂乙素能夠有效降低UC 小鼠結(jié)腸炎癥因子水平, 起到抗UC 的作用[7]. 因此, 明確補骨脂乙素抗UC 的確切作用機制是有必要的. 本工作旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合UC 患者結(jié)腸黏膜活檢樣本高通量測序結(jié)果以及分子對接技術(shù)探索補骨脂乙素干預(yù)UC 的潛在靶點,為補骨脂乙素抗UC 的作用機制研究提供新的思路.

1 方 法

1.1 補骨脂乙素靶點獲取

首先, 以“isobavachalcone” 為檢索詞, 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫[8]檢索補骨脂乙素的SMILES (simplified molecular input entry system) 結(jié)構(gòu); 其次, 根據(jù)其SMILES 結(jié)構(gòu)依次導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫[9]、PharmMapper 數(shù)據(jù)庫[10]預(yù)測補骨脂乙素的結(jié)果作用靶點; 然后, 以isobavachalcone 作為檢索詞于CTD 數(shù)據(jù)庫[11]獲取補骨脂乙素作用靶點; 最后,將三者結(jié)果取并集去重后得到補骨脂乙素所有可能的作用靶點.

1.2 UC 靶點獲取

以“ulcerative colitis”為檢索詞,通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫[12]、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫[13]、OMIM數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫[14]、CTD 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫[15]檢索UC 相關(guān)治療靶點.

1.3 基于GEO 數(shù)據(jù)庫的UC 差異表達基因

GSE87466 數(shù)據(jù)集包含了87 例UC 和21 例健康成人結(jié)腸黏膜活檢樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù), 用4.1.2 版本R 軟件中的limma 包對UC 組和健康對照組進行基因表達差異分析,其差異標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|≥1.5 且P <0.05, 結(jié)果以火山圖和熱圖呈現(xiàn).

1.4 補骨脂乙素干預(yù)UC 靶點預(yù)測

將獲得的UC 治療靶點與GSE87466 數(shù)據(jù)集差異基因合并后去重, 得到的UC 治療靶點, 并與補骨脂乙素治療靶點取交集, 繪制交集韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/, venn2.1.0), 交集即為補骨脂乙素可能的抗UC 作用靶點.

1.5 靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和富集分析

將補骨脂乙素-UC 的共同靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/, version 11.0), 物種選擇“Homo Sapiens”, 閾值選擇“Medium Confidence”, 進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI) 的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建. 將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中可視化, 根據(jù)經(jīng)驗, 以一級網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)包含節(jié)點的中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、連接度(degree) 的中位數(shù)為篩選條件, 篩選出二級網(wǎng)絡(luò)圖. 同樣, 以二級網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)的中位數(shù)為篩選條件, 得到三級網(wǎng)絡(luò), 最終篩選出核心靶點. R4.1.2 軟件中clusterProfiler 包對預(yù)測靶點進行基因本體(gene ontology, GO) 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 富集分析, 結(jié)果以條形圖和氣泡圖可視化.

1.6 分子對接

在Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取的補骨脂乙素SDF 文件,從PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取核心靶點對應(yīng)的3D 結(jié)構(gòu), 利用AutoDockTools 1.5.6 軟件對蛋白加氫、計算電荷等處理后與補骨脂乙素分別進行模擬對接, 記錄對接分?jǐn)?shù)最低構(gòu)象的結(jié)合能, 對接結(jié)果利用PyMOL軟件可視化. 對接結(jié)果根據(jù)自由能判斷結(jié)合強度, 小于?5.0 kcal/mol 表示具有較好的結(jié)合活性, 小于?7.0 kcal/mol 表示具有強烈的結(jié)合活性.

2 結(jié) 果

2.1 補骨脂乙素靶點篩選

圖1 為PubChem 中獲取的補骨脂乙素結(jié)構(gòu). 從SwissTargetPrediction、PharmMapper、CTD數(shù)據(jù)庫分別獲取了103、291、4 個補骨脂乙素作用靶點, 取并集后去重共得到366 個靶點.

圖1 補骨脂乙素結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of isobavachalcone

2.2 UC 靶點數(shù)據(jù)庫篩選

從CTD 數(shù)據(jù)庫中篩選“Inference Score ≥30” 的147 個靶點, 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲篩選“Relevance.score ≥5” 的545 個靶點, 從OMIM、TTD、DrugBank 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫分別獲得2、30、56、308 個靶點, 取并集后共得到1 088 個UC 治療靶點.

2.3 UC 組和健康對照組基因表達差異分析

以P < 0.05 和|lgFC|≥1.5 為臨界值, 從GSE87466 數(shù)據(jù)集中共篩選出315 個UC 差異基因, 其中196 個為上調(diào)基因, 115 個為下調(diào)基因. 圖2 為差異基因表達譜的火山圖. 對差異表達處于前25 位的基因繪制熱圖以可視化, 結(jié)果如圖3 所示.

圖2 UC 患者和正常結(jié)腸組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異基因表達譜的火山圖Fig.2 Volcano map of differential gene expression profiles of colonic tissue transcriptome data from UC patients and normal controls

圖3 UC 患者和正常結(jié)腸組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異基因前25 位基因表達譜熱圖Fig.3 Heatmap of top 25 differential Gene expression profiling of colonic tissue transcriptome data from UC patients and normal controls

2.4 補骨脂乙素干預(yù)UC 靶點預(yù)測

把UC 組相比健康對照組的差異基因與數(shù)據(jù)庫預(yù)測UC 靶點整合去重后取并集, 得到了1 088 個治療靶點, 再與補骨脂乙素靶點取交集, 共得到107 個補骨脂乙素干預(yù)UC 的潛在靶點(見圖4).

圖4 潰瘍性結(jié)腸炎和補骨脂乙素靶點交集韋恩圖Fig.4 Venn diagram of UC and isobavachalcone target intersection

2.5 靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

把107 個靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò), 下載該網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件, 共得到107個節(jié)點(nodes) 和1171 條邊(edges). 圖5 為蛋白質(zhì)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖. 將PPI 網(wǎng)絡(luò)TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件中可視化, 使用NetworkAnalyzer 工具計算各個節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)Degree (DC)、BC、CC, 即以DC≥17, BC≥0.003 以及CC≥0.512 為條件, 篩選出二級網(wǎng)絡(luò)圖(包含41 個節(jié)點和497 條邊). 同樣, 以二級網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)的中位數(shù)為篩選條件, 即以DC≥35、BC≥0.009 以及CC≥0.573 為條件, 得到三級網(wǎng)絡(luò)(包含14 個節(jié)點和89 條邊). 最終篩選出6 個靶點作為補骨脂乙素-UC 的核心靶點, 結(jié)果圖5 和6 所示.

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.5 PPI network

圖6 核心靶點篩選流程圖Fig.6 Flowchart of core targets screening

2.6 富集分析

對107 個靶點進行富集分析, 結(jié)果如圖7 所示. 由圖7 可知: 生物過程(bioprocess, BP)顯著富集于炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對細菌源性分子的應(yīng)答及細胞對化學(xué)應(yīng)激的應(yīng)答過程等; 細胞組分(cellular component, CC) 顯著富集于囊腔、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒腔、脂筏及膜微區(qū)等; 分子功能(molecular function, MF) 顯著富集于絲氨酸內(nèi)肽酶活性、絲氨酸酶活性、絲氨酸水解酶活性及酪氨酸激酶活性等. KEGG 富集分析顯著富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、P13K-AKT 信號通路、肺癌蛋白多糖、RAS 信號通路等(見圖8).

圖7 GO 富集分析Fig.7 GO enrichment analysis

圖8 KEGG 分析Fig.8 KEGG analysis results

2.7 分子對接

對6 個核心靶點完成模擬分子對接操作后, 發(fā)現(xiàn)除PTGS2 以外, 其他靶點與補骨脂乙素均有結(jié)合潛力(見表1). 圖9 為核心靶點分子對接結(jié)果. 可以看出, 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9, MMP9)、表皮因子生長受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor I,IGFI) 和非受體酪氨酸激酶(SRC) 與補骨脂乙素有良好的結(jié)合能力.

表1 6 個核心靶點分子對接結(jié)果Table 1 Docking results of 6 core targets

圖9 核心靶點分子對接結(jié)果Fig.9 Molecules docking results of core targets

3 討 論

本研究共發(fā)現(xiàn)107 個補骨脂乙素干預(yù)UC 的潛在治療靶點, 表明補骨脂乙素可能介導(dǎo)多靶點發(fā)揮著抗UC 的作用. GO 富集分析可知這些潛在作用靶點主要參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激應(yīng)答及細胞對化學(xué)應(yīng)激的應(yīng)答等, 且很可能發(fā)生于囊腔、分泌顆粒腔、脂筏及膜微區(qū)等.分子功能主要包括絲氨酸內(nèi)肽酶活性、絲氨酸酶活性、絲氨酸水解酶活性及酪氨酸激酶活性等. KEGG 富集分析顯著富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、P13K-AKT 信號通路、RAS 信號通路、Rap1 信號通路等. 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)的中位值, 經(jīng)過3 輪篩選出了6 個關(guān)鍵靶點, 再經(jīng)過分子對接模擬驗證, 它們與補骨脂乙素均可結(jié)合, 其中AKT1、MMP9、EGFR、IGF1 及SRC 有良好的結(jié)合能力.

UC 是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD) 的類型之一, 其病因與環(huán)境刺激、遺傳、免疫等多個因素有關(guān)[16-18], 其中免疫機制的紊亂是機體多種促炎細胞因子與抗炎細胞因子作用失衡的結(jié)果[19-20]. 炎性相關(guān)細胞因子的調(diào)控和釋放與PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)[21]. PI3K/AKT 活化后, 可激活核因子kB, 調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達, 如上調(diào)炎癥細胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) 等基因的表達, 促進細胞因子的產(chǎn)生和釋放, 誘導(dǎo)細胞因子的失衡, 引發(fā)腸道部位的炎癥反應(yīng)和粘膜損傷, 加劇UC 的進一步惡化[22]. 黃曉麗等[23]通過給予UC 患者結(jié)腸粘膜組織PI3K/AKT 信號通路抑制劑干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)明顯減輕.AKT 是PI3K-AKT 信號通路的核心因子, 在細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、代謝、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄等多種細胞活動中起關(guān)鍵作用[24-25]. AKT1 作為AKT 家族重要成員之一, 具有促進和維持成肌細胞分化的作用, AKT1 缺失會導(dǎo)致多種組織生長遲緩和細胞凋亡的增加[26-27]. 分析結(jié)果表明, AKT1可能作為補骨脂乙素抗UC 的潛在作用靶點, 但仍需進一步實驗驗證. 金屬基質(zhì)蛋白酶家族(matrix metalloproteinase, MMP) 參與IBD 病變組織的重建和破壞過程. 研究發(fā)現(xiàn), MMP9在UC 患者中持續(xù)性高表達且在實驗?zāi)Ｐ椭锌赏ㄟ^激活肌球蛋白輕鏈激酶破壞結(jié)腸上皮的通透性以及刺激骨髓細胞向病變結(jié)腸上皮細胞處募集, 刺激促炎因子TNF 的生成, 誘發(fā)炎癥發(fā)應(yīng)[28-29]. 李亞蘭等[30]發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方葛根芩連湯可通過抑制MMP-9、TNF-α、IL-1β 的表達,阻斷p38-MAPK 信號通路的激活, 增加結(jié)腸組織緊密連接蛋白的表達, 從而修復(fù)腸道黏膜屏障. EGFR 是原癌基因erbB1 編碼的一種受體酪氨酸激酶, 其配體表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF) 與EGFR 結(jié)合后, 啟動p85 基因并激活位于細胞膜附近的p110, 催化細胞膜內(nèi)表面的PIP2 轉(zhuǎn)化為PI3P; PI3P 充當(dāng)?shù)诙攀? 促進下游信號通路AKT、GSK3β 及Wnt 等的活化, 促進結(jié)腸上皮細胞的生長和增殖[31-33]. SRC 是一種編碼酪氨酸激酶的原癌基因, 參與調(diào)節(jié)多個生物學(xué)過程, 包括細胞增殖、存活、分化、黏附和侵襲等[34]. 研究發(fā)現(xiàn), SRC可通過影響其下游蛋白STAT3 信號通路, 對結(jié)腸炎相關(guān)癌癥早期的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵性作用[35-36]. IGF1 是一種由肝細胞分泌的一種蛋白多肽, 正常狀態(tài)下具有促進上皮細胞生長、修復(fù)的作用. 在UC 發(fā)生過程中, 機體處于炎癥狀態(tài)時, IGF1 的表達水平顯著下調(diào), 結(jié)腸上皮細胞損傷無法及時修復(fù)而進一步加劇UC 的惡化[37]. 炎癥刺激會誘導(dǎo)UC 患者黏膜內(nèi)間質(zhì)細胞向纖維原性表型的細胞轉(zhuǎn)化, 纖維原性表型細胞的活化和持續(xù)性增殖導(dǎo)致腸道組織發(fā)生纖維化病變[38]. IGF1 參與調(diào)控纖維細胞的活化、增殖, 與UC 的發(fā)生密切相關(guān)[39]. 提示補骨脂乙素可能通過調(diào)控IGF1 的表達影響炎癥反應(yīng)發(fā)揮其抗UC 的作用, 具體作用機制需要進一步實驗驗證.

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合GEO 測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)補骨脂乙素干預(yù)UC 過程是通過多靶點、多通路來實現(xiàn)的, 分子對接進一步驗證了關(guān)鍵靶點與補骨脂乙素結(jié)合的可能性, 為補骨脂乙素治療UC 提供了理論基礎(chǔ). 本工作主要以大數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析結(jié)果為基礎(chǔ), 后續(xù)擬進一步展開細胞及動物實驗, 以期明確補骨脂乙素治療UC 的關(guān)鍵作用靶點及信號通路.