牛FoxO1基因CDS區(qū)克隆及其在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)分析

宋雅萍,雷召雄,趙毅昂,姜 超,王興平,2,羅仍卓么,2,馬 云,2,魏大為,2,*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021; 2.寧夏大學(xué) 寧夏反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川 750021)

牛肉因其膽固醇低、蛋白質(zhì)高、其氨基酸組成更接近于人體需要等優(yōu)點(diǎn)而深受廣大消費(fèi)者的喜愛。近年來,隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的改變和生活水平的提高,牛肉的消費(fèi)量大幅度提高。然而,與發(fā)達(dá)國(guó)家相比,我國(guó)肉牛供不應(yīng)求、良種率低、優(yōu)質(zhì)牛肉緊缺等問題普遍存在,肉牛品種對(duì)外依存度高,優(yōu)質(zhì)、高檔牛肉等也主要依賴于進(jìn)口(澳大利亞、美國(guó)等國(guó))[1]。因此,改良和培育優(yōu)質(zhì)肉牛品種是中國(guó)肉牛業(yè)亟需解決的重要課題。脂肪組織在多種生理途徑(能量平衡、機(jī)體內(nèi)分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài)等)中發(fā)揮了重要作用,且脂肪組織在牛肉中的分布、比例等與肉質(zhì)密切相關(guān),如肌內(nèi)脂肪含量是影響牛肉質(zhì)量的關(guān)鍵檢驗(yàn)指標(biāo)[2-5]。脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育是通過脂肪細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行的復(fù)雜且精細(xì)的動(dòng)態(tài)調(diào)控,其過程受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控及信號(hào)通路等的影響。如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein,C/EBP)家族成員、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators activated receptors,PPARγ)、脂肪酸結(jié)合蛋白-4(fatty acid binding protein-4,FABP4)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)等均在脂肪細(xì)胞分化過程中有重要作用,其中PPARγ和C/EBP是脂肪生成主要的轉(zhuǎn)錄因子[6-10]。有關(guān)脂肪細(xì)胞分化的信號(hào)通路有:磷酯酰激醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylethanol 3-kinase/serine threonine protein kinase, PI3K/AKT)、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases/mitogen-activated protein kinase,ERK-MAPK)信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A,cAMP/PKA)信號(hào)通路和Hedgehog信號(hào)通路等[11-12]。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead box O1,FoxO1)作為Foxs超家族中FoxO亞家族重要且常見的轉(zhuǎn)錄因子之一,參與許多的生理過程,例如糖代謝、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、肌細(xì)胞的分化、生殖和腫瘤的發(fā)生等,影響機(jī)體的正常生長(zhǎng)和代謝[13-14]。FoxO1在哺乳動(dòng)物胰島素反應(yīng)組織(脂肪、胰腺、肝臟和骨骼肌等)和骨骼中高度表達(dá),其活性受磷酸化、乙?；头核鼗绒D(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控,是細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[15-16]。研究表明,FoxO1在脂肪細(xì)胞分化信號(hào)通路與轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用[17]。此外,FoxO1還調(diào)節(jié)脂肪因子的活性或產(chǎn)生,其對(duì)白色脂肪組織和棕色脂肪組織的調(diào)節(jié)具有雙重功能[14]。具體而言,FoxO1能通過白色脂肪組織中的能量?jī)?chǔ)存調(diào)節(jié)能量和營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài),且可促進(jìn)棕色脂肪組織中的能量消耗。研究報(bào)道,FoxO1的表達(dá)具有時(shí)空差異,因而在各組織器官中發(fā)揮的作用不同[18-19]。Chen等[19]報(bào)道,FoxO1在脂肪細(xì)胞分化的細(xì)胞周期控制中起主導(dǎo)作用。目前,有關(guān)FoxO1基因?qū)χ炯?xì)胞分化影響的研究在人和小鼠等動(dòng)物中均有涉及,有關(guān)牛FoxO1基因的研究近些年也在逐漸增多,如對(duì)牛FoxO1基因的組織表達(dá)分析、肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析等都有相關(guān)研究[20-21],但FoxO1基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化中的具體時(shí)序表達(dá)規(guī)律等尚不明晰。

鑒于此,本試驗(yàn)克隆牛FoxO1的編碼區(qū)序列,利用生物信息學(xué)軟件和在線工具預(yù)測(cè)FoxO1的理化性質(zhì)和功能,進(jìn)一步采用熒光定量PCR檢測(cè)了FoxO1在牛脂肪細(xì)胞分化中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律。以期為探討牛FoxO1基因的功能及其在脂肪細(xì)胞分化中作用機(jī)理提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

用于克隆和時(shí)序表達(dá)分析的脂肪細(xì)胞均采自秦川牛皮下脂肪組織(18月齡,n=3),利用無菌器械采集后立刻置于含雙抗體積分?jǐn)?shù)為1%的PBS中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試驗(yàn)試劑

Trizol、PMD-18T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)等由TaKaRa公司(大連)提供;DL 4500 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒(離心柱型)和質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)等購自天根生物科技有限公司(北京);瓊脂糖Agarose、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等由索萊寶科技有限公司(北京)提供;DMEM/High-Glucose、PBS、青霉素/鏈霉素抗體(以下簡(jiǎn)稱雙抗)和胰酶等購自?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司(北京);胎牛血清(FBS)購自賽默飛世爾科技有限公司(中國(guó));羅格列酮、地塞米松和IBMX均購自Sigma公司;無水乙醇、甲醛、氯仿和異丙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成

參照Trizol RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA。選用完整性良好的RNA樣品作為模板(以1 μL RNA為模板),按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列信息,利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物后交由通用生物技術(shù)有限公司(安徽)進(jìn)行合成。

1.2.3 牛FoxO1基因的克隆

以上述步驟反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系共15 μL,包括Taq酶PCR Master Mix 7.5 μL;ddH2O 5.5 μL;cDNA 1 μL;上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火70 ℃ 30 s,38個(gè)循環(huán);延伸72 ℃ 90 s。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,將檢驗(yàn)合格的產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行純化后與PMD-18T載體過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后,挑選3～5個(gè)陽性克隆,提取質(zhì)粒,送至楊凌奧科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.4 牛FoxO1基因的生物信息學(xué)分析

牛FoxO1基因的生物信息學(xué)分析軟件及在線工具見表2。牛FoxO1和其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹序列信息見表3。

表2 牛FoxO1基因的生物信息學(xué)分析軟件及在線工具Table 2 Bioinformatics analysis software and online tool of bovine FoxO1 gene

表3 牛FoxO1和其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹序列信息Table 3 Phylogenetic tree sequence information of bovine FoxO1 and other species

1.2.5 牛脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及油紅O染色

分離培養(yǎng):將采集的牛皮下脂肪細(xì)胞參考郭紅芳等[22]的方法進(jìn)行分離;分離的脂肪細(xì)胞加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1% 雙抗+10% FBS+89% DMEM/High Glucose)于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱環(huán)境參數(shù)為37℃,5% CO2。

誘導(dǎo)分化:參考雷召雄等[9]的方法誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)基:10 μg·mL-1胰島素、1 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1IBMX和1 μmol·L-1羅格列酮;維持分化培養(yǎng)基:10 μg·mL-1胰島素、1 μmol·L-1羅格列酮。

油紅O染色:脂肪細(xì)胞分化完成后,棄培養(yǎng)基;PBS清洗3～4次后,加入4%多聚甲醛固定5 min;棄去4%多聚甲醛,加同等體積的4%多聚甲醛,室溫條件下孵育30 min;棄4多聚甲醛,60%異丙醇清洗;待到培養(yǎng)皿完全干燥后,加入油紅O工作液 (60%油紅O儲(chǔ)存液和40% PBS),室溫孵育20 min;棄油紅O染液,PBS立即清洗3～4次;最后在顯微鏡下觀察脂滴形成數(shù)量和大小來判斷脂肪細(xì)胞的分化情況并拍照記錄。

1.2.6 熒光定量PCR

參照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的牛GAPDH(NM_001034034.2)、FoxO1(XM_025000053.1)、PPARγ(NM_181024.2)、C/EBPα(NM_176784)、C/EBPβ(NM_176788)、FABP4(NM_174314.2)、LPL(NM_001075120.1)的mRNA序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物后交由安徽通用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成(表1)。利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus, TaKaRa)試劑盒,參照其說明書檢測(cè)FoxO1和PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP4、LPL在脂肪細(xì)胞分化第0、2、4、6、10天表達(dá)水平(n=3)。反應(yīng)體系為:TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)7.5 μL;cDNA模板2.0 μL;上下游引物各0.3 μL;ddH2O 4.9 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用2-ΔΔCT法分析熒光定量的結(jié)果,數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差 (one-way ANOVA) 分析,**表示極顯著差異(P<0.01),*表示顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛FoxO1基因CDS區(qū)克隆

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增獲得的牛FoxO1基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)1 998 bp(圖1),經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),與GenBank所公布的牛FoxO1的CDS序列(登錄號(hào):XM_025000053.1)完全一致,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

M泳道為DL4500 Maker,1泳道為目的片段。Lane M is DL4500 Maker, lane 1 is the destination segment.圖1 牛FoxO1基因的CDS區(qū)克隆Fig.1 Cloning of CDS region of Bovine FoxO1 gene

2.2 牛FoxO1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 牛FoxO1結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源性分析

通過Bioedit軟件及Protparam工具進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),牛FoxO1基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C3016H4711N871O979S35,分子量為69 958.93 u,半衰期為30 h,理論等電點(diǎn)為6.38,不穩(wěn)定指數(shù)為59.53(>40.00)。因此,推測(cè)牛FoxO1基因編碼的蛋白質(zhì)是一種不穩(wěn)定蛋白。對(duì)牛FoxO1蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),牛FoxO1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲(66.47%)、α-螺旋(23.91%)、延伸鏈(5.71%)和β-轉(zhuǎn)角(3.91%)構(gòu)成(圖2-A);其三級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果基本相同(圖2-B),推斷出牛FoxO1蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,α-螺旋次之。對(duì)牛FoxO1蛋白的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),牛FoxO1蛋白與AKT1、AKT2、AKT3、SIRT1、PRKACA、CDK2和MAPK8等蛋白之間存在互作效應(yīng)(圖2-C)。采用MEGA 5軟件對(duì)牛、豬、綿羊、山羊、人、小鼠、瘤牛和長(zhǎng)臂猿FoxO1基因的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,牛與綿羊、山羊在進(jìn)化樹中最近,同源性最高(圖2-D),這一結(jié)果說明FoxO1在進(jìn)化中的功能非常重要且極度保守。

2.2.2 牛FoxO1功能預(yù)測(cè)

牛FoxO1蛋白質(zhì)跨膜螺旋預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,牛FoxO1不存在跨膜區(qū)域,其第1～665位氨基酸存在于細(xì)胞膜外,屬于非跨膜蛋白(圖3-A)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,牛FoxO1蛋白存在95個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中,絲氨酸(serine,Ser)、蘇氨酸(threonine,Thr)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)各有68個(gè)、23個(gè)、4個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)(圖3-B)。此外,牛FoxO1蛋白不存在信號(hào)肽(圖3-C),推測(cè)其為非分泌性蛋白。親/疏水性預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),牛FoxO1蛋白在第101～102位氨基酸疏水性最強(qiáng),分值為2.067;在第260位氨基酸親水性最強(qiáng),分值為-2.767。從親水性/疏水性總體來看,親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸(圖3-D)。由此推斷,牛FoxO1蛋白屬于親水性蛋白。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,牛FoxO1蛋白在第169～259位氨基酸存在一個(gè)FH(Forkhead)保守結(jié)構(gòu)域的,而其第37～69、90～108、126～160、272～287、384～405和420～431位氨基酸殘基為低復(fù)雜性區(qū)域(圖3-E)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,牛FoxO1基因編碼蛋白在細(xì)胞核、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、囊泡分泌系統(tǒng)和高爾基體中發(fā)揮生物學(xué)作用的可能分別為69.6%、13.0%、8.7%、4.3%和4.3%(表4)。由此推測(cè),牛FoxO1基因最有可能定位于細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用,其次為質(zhì)膜。

A,跨膜區(qū);B,磷酸化位點(diǎn);C,信號(hào)肽;D,親/疏水性;E,結(jié)構(gòu)域。A, Transmembrane region; B, Phosphorylation sites; C, Signal peptide; D, Hydrophilic/hydrophobic; E, Domain.圖3 牛FoxO1 蛋白功能預(yù)測(cè)Fig.3 Functional prediction of bovine FoxO1 protein

表4 牛FoxO1亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Prediction results of subcellular localization of bovine FoxO1 protein

2.3 牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O染色

本試驗(yàn)成功分離牛脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化(圖4),未誘導(dǎo)分化時(shí)(第0天)脂肪細(xì)胞呈梭狀,其大小均勻,分散分布且脂滴數(shù)量較少。隨著分化進(jìn)程的不斷推進(jìn),脂肪細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞內(nèi)部脂滴數(shù)量逐漸增多并充盈增大。第10天時(shí),視野中可明顯地觀察到大量脂肪滴,且其余小脂滴呈聚集趨勢(shì)。進(jìn)一步使用酶標(biāo)儀檢測(cè)脂肪分化前后510 nm吸光值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞分化后期吸光值顯著性高于分化前。這一結(jié)果說明本次分離并誘導(dǎo)分化的牛脂肪細(xì)胞,從分化效果、細(xì)胞形態(tài)等指標(biāo)檢測(cè),其分化效果較好,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A,未分化前細(xì)胞;B,誘導(dǎo)分化后第10天油紅O染色;C,510 nm 處D值?！?*”,P<0.01;“*”,P<0.05。下同。A, Pre-differentiated cells; B, Oil red O staining 10 days after induced differentiation; C. D value at 510 nm. “**”, P<0.01;“*”, P<0.05. The same as below.圖4 牛脂肪細(xì)胞第0、10天分化情況Fig.4 Differentiation of bovine adipocytes at 0 and 10 days

2.4 脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)量檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因(PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP4、LPL)在牛脂肪細(xì)胞分化第0、2、4、6和10天時(shí)的表達(dá)量。如圖5所示,PPARγ在分化第0天就有表達(dá),其分化第2、10天表達(dá)量顯著高于第0天(P<0.05),分化第4、6天極顯著高于第0天(P<0.01);C/EBPα隨分化進(jìn)程的不斷推進(jìn)表達(dá)量逐漸升高,分化第6天有所下調(diào),隨后回升,其在分化第2、4、6和10天表達(dá)量都極顯著高于第0天(P<0.01);C/EBPβ在分化第4、6天極顯著高于第0天(P<0.01),其表達(dá)量呈“下降-上升-下降-上升”

圖5 牛脂肪細(xì)胞分化各階段標(biāo)志基因的時(shí)序表達(dá)Fig.5 Sequential expression of marker genes at different stages of adipocyte differentiation

趨勢(shì);FABP4在分化第0、2天表達(dá)量較低,于分化第4天表達(dá)量上升達(dá)峰值(P<0.01),隨后下調(diào),其分化第6、10天的表達(dá)量顯著高于未誘導(dǎo)分化的第0天(P<0.05);LPL隨分化進(jìn)程推進(jìn)表達(dá)量不斷上升,其分化第2、4天表達(dá)量顯著高于分化第0天(P<0.05),分化第6、10天的表達(dá)量極顯著高于第0天(P<0.01)。

2.5 牛FoxO1時(shí)序表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)牛FoxO1基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量。如圖6所示,在牛脂肪細(xì)胞分化過程中,與分化第0天相比,FoxO1在分化第2天(P<0.05)和第4天(P<0.01)時(shí)逐漸下調(diào),但在第6天表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),此后下調(diào)(P<0.05)。

圖6 牛FoxO1基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的時(shí)序表達(dá)Fig.6 Sequential expression of bovine FoxO1 gene during adipocyte differentiation

3 討論

動(dòng)物體脂肪沉積是脂肪細(xì)胞增殖與分化的結(jié)果,與生脂相關(guān)基因的表達(dá)水平息息相關(guān)。FoxO1基因作為Fox亞家族最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積有重要影響。如Nakae等[23]研究發(fā)現(xiàn),FoxO1在激素激活信號(hào)通路與促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)的整合中起著重要作用。此外,已有研究表明,FoxO1在脂肪細(xì)胞中大量表達(dá),組織與脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[24-25]。因此,研究牛FoxO1基因序列、編碼蛋白特征及FoxO1基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化的時(shí)序表達(dá)規(guī)律,有助于我們深入了解牛脂肪形成的分子機(jī)理,增加調(diào)節(jié)牛脂肪生成的關(guān)鍵候選基因。

CDS區(qū)的克隆于基因功能的研究而言有重要意義[26]。本試驗(yàn)克隆得到牛FoxO1基因完整的CDS區(qū),其全長(zhǎng)為1 998 bp,編碼655個(gè)氨基酸,這與NCBI數(shù)據(jù)庫已公布信息一致。蛋白質(zhì)的半衰期和其穩(wěn)定性密切相關(guān)[27]。本研究預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),牛FoxO1半衰期為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)較高,為59.53(>40.00),推測(cè)其屬于不穩(wěn)定蛋白。再者,牛FoxO1二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲(結(jié)構(gòu)相對(duì)較松散)占比高達(dá)66.47%,而對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要影響的α-螺旋僅含23.91%,也進(jìn)一步證明牛FoxO1為不穩(wěn)定蛋白。此外,與本研究不一致的是,孫雨佳[20]研究表明,牛FoxO1二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比75.42%,α-螺旋占比17.30%。在使用同一二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具SOPMA進(jìn)行分析出現(xiàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象,推測(cè)是因FoxO1蛋白序列略有差異或SOPMA工具版本更新使預(yù)測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確等原因所致。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,牛FoxO1最有可能定位于細(xì)胞核(69.6%)發(fā)揮生物學(xué)作用,這與Lettieri Barbato等[25]報(bào)道一致,FoxO1主要在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。FH域是一個(gè)大約由110個(gè)氨基酸所組成的高度保守序列,其可作為DNA結(jié)合域發(fā)揮作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn),牛FoxO1蛋白在第169～259位氨基酸存在一個(gè)FH保守結(jié)構(gòu)域,該FH域存在91個(gè)保守的氨基酸。在分析FoxO1基因在不同物種中的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),牛與瘤牛、綿羊和山羊等物種具有較高同源性,在系統(tǒng)進(jìn)化樹上距離最近,我們推測(cè)FoxO1在不同物種中有相近的生物學(xué)功能。韓琦[29]研究發(fā)現(xiàn),綿羊FoxO1與牛有較高的同源性。此外,FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化的調(diào)節(jié)。具體而言,磷酸化的FoxO1通過核排斥進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并失去其轉(zhuǎn)錄活性[30]。我們通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牛FoxO1存在95個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

通過蛋白互作預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),牛FoxO1蛋白與AKT1、AKT2、AKT3、SIRT1、PRKACA、CDK2、MAPK8等蛋白之間存在緊密互作關(guān)系。已有研究表明,AKT1、AKT2是體內(nèi)脂肪維持所必須的,而AKT3在分化的脂肪細(xì)胞中表達(dá)[31-32];SIRT1在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中控制脂肪細(xì)胞的發(fā)育,若SIRT1缺失則會(huì)導(dǎo)致C-Myc激活、脂肪細(xì)胞增生和脂肪細(xì)胞代謝失調(diào)[33-34];此外,有報(bào)道稱PPKACA在草魚脂肪組織中高度表達(dá),但該蛋白具體對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待研究[35];促進(jìn)CDK2的表達(dá)會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖,抑制脂肪細(xì)胞分化,減少脂滴形成[36];而MABK8所在的家族MAPK可級(jí)聯(lián)控制C/EBPβ和C/EBPδ基因的早期表達(dá)來刺激LIF受體,使前脂肪細(xì)胞進(jìn)行最終分化[37]。因而,我們可以看出,以上蛋白都與脂肪細(xì)胞的增殖或分化等密切相關(guān),進(jìn)而推測(cè)出與以上蛋白有互作效應(yīng)的FoxO1與脂肪細(xì)胞的分化有著密不可分的聯(lián)系,對(duì)這一推測(cè)還需后期試驗(yàn)進(jìn)行FoxO1在脂肪細(xì)胞增殖分化過程中基因功能驗(yàn)證,并鑒定其靶基因。

PPARγ和C/EBP是作為促進(jìn)脂肪細(xì)胞早期分化的關(guān)鍵因子,其能激活并調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的下游基因的表達(dá),從而精細(xì)調(diào)控細(xì)胞分化成熟[19,38]。研究發(fā)現(xiàn),FoxO1可負(fù)調(diào)控PPARγ和C/EBP的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性,如FoxO1活性降低會(huì)促進(jìn)PPARγ的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[19]。FABP4主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,主要功能是介導(dǎo)脂肪酸的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),在脂肪細(xì)胞分化過程中,其表達(dá)和活性均會(huì)增加,以此促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[39-40]。脂蛋白脂肪酶(LPL)是由脂肪等組織分泌的一種酶,與動(dòng)物脂質(zhì)的含量密切相關(guān),此外LPL基因表達(dá)開始于脂肪細(xì)胞發(fā)育的早期并在分化細(xì)胞中維持表達(dá),被用作脂肪細(xì)胞分化的早期標(biāo)記基因[41]。因此,在本試驗(yàn)中分離牛皮下脂肪細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化,檢測(cè)在脂肪細(xì)胞分化過程中各標(biāo)志基因(PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP4、LPL)的表達(dá)模式,以判斷脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化是否成功。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,PPARγ在脂肪細(xì)胞分化早期就開始表達(dá),隨分化進(jìn)程推進(jìn),其表達(dá)量不斷上升,于第4天表達(dá)量達(dá)到高峰(P<0.01),此后下調(diào),這與陳曉佩等[42]報(bào)道相似,但表達(dá)量達(dá)峰值的時(shí)間略有不同,推測(cè)可能與選擇的不同物種脂肪細(xì)胞分化成熟時(shí)間不同有關(guān)。C/EBPα在第0天表達(dá)量較低,但其在誘導(dǎo)分化各階段表達(dá)量都極顯著高于第0天(P<0.01)。C/EBPβ在細(xì)胞分化第4天和第10天達(dá)到峰值。對(duì)于脂肪細(xì)胞分化的另一個(gè)關(guān)鍵基因FABP4,其在脂肪細(xì)胞分化前期表達(dá)量極低,但隨著分化進(jìn)程不斷推進(jìn),其表達(dá)量開始上升,這與Schlottmann等[40]的報(bào)道一致。LPL隨分化進(jìn)程推進(jìn)表達(dá)量持續(xù)上調(diào),此變化趨勢(shì)與郭紅芳等[22]的報(bào)道一致。說明本次誘導(dǎo)分化的牛脂肪細(xì)胞效果較好。

Zou等[43]報(bào)道,FoxO1在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)“S型”激活模式。與此一致的是,本研究通過qPCR發(fā)現(xiàn),牛FoxO1的表達(dá)呈現(xiàn)“下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)”的趨勢(shì)。分化前期FoxO1表達(dá)量下調(diào)可能是細(xì)胞重新進(jìn)入了細(xì)胞周期和克隆擴(kuò)增所致[19]。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證明了FoxO1基因?qū)χ炯?xì)胞的分化有一定的影響,對(duì)于其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步對(duì)FoxO1基因功能進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了牛FoxO1基因的CDS區(qū)序列,對(duì)牛FoxO1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、功能及互作蛋白等進(jìn)行了預(yù)測(cè),分析了FoxO1基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律,為探究牛FoxO1基因調(diào)控脂肪生成的分子機(jī)制提供參考信息。