生物酶在煙草工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

黃申,蘆堯,劉強(qiáng),趙聲辰,陳芝飛,毛多斌

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 煙草科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,河南 鄭州 450002

0 引言

生物酶因其催化條件溫和、催化效率和生物安全性高、作用效果顯著等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)[1]、食品加工[2]等行業(yè)[3]。

煙葉中普遍存在蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、纖維素等生物大分子,其含量過高會(huì)在卷煙燃吸過程中產(chǎn)生刺激性氣味及多種有害成分,從而對(duì)煙草制品的感官品質(zhì)產(chǎn)生不良影響[4],而蛋白酶[5]、淀粉酶[6]、果膠酶[7]、纖維素酶[8]等可將對(duì)應(yīng)底物催化水解生成香味物質(zhì)或其前體物,因此相應(yīng)的催化水解機(jī)制已成為煙草工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。西柏烯類[9]、類胡蘿卜素類[10]、糖苷類[11]等是煙草重要的香味前體物,其催化轉(zhuǎn)化過程也可由特定酶來完成。已有研究[12]表明,生物酶也可用于煙用香料的開發(fā)。生物酶的特點(diǎn)和功能決定其可在一定程度上改變煙草的化學(xué)組成,進(jìn)而改善卷煙的感官品質(zhì)。

合理利用生物酶處理煙葉及煙草制品能夠增加卷煙香氣、減少雜氣和刺激性、降低危害,達(dá)到改善卷煙感官品質(zhì)的目的[13]。因此,煙草生物酶的創(chuàng)制、應(yīng)用和催化功能研究具有重要意義。本文擬對(duì)煙草工業(yè)中生物酶的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述,分析生物酶在煙草領(lǐng)域應(yīng)用中存在的問題,展望本領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展,旨在為煙用酶制劑創(chuàng)制、功能開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 生物酶在煙葉處理中的應(yīng)用

近年來,生物酶主要被用來處理煙葉以降解蛋白質(zhì)、果膠、淀粉等生物大分子、降低煙葉雜氣和刺激性、提升煙葉品質(zhì)等,其種類分為單酶制劑、混合酶制劑及粗酶制劑。處理對(duì)象包括新鮮煙葉、單料煙、模塊煙等,處理階段包括煙葉初烤前、煙葉陳化后、在線制絲等環(huán)節(jié)。

將生物酶噴在初烤前新鮮成熟煙葉上,初烤過程中在烤房適合的溫濕度條件下,生物酶發(fā)揮催化作用,起到調(diào)節(jié)煙草化學(xué)組分,改善煙葉品質(zhì)的作用。樊文舉等[14-15]將果膠酶噴在新鮮成熟煙葉(NC99中部葉)上,晾干初烤后,發(fā)現(xiàn)煙葉中常規(guī)化學(xué)成分更協(xié)調(diào)、煙葉香氣總量及熱失重率增加,煙葉整體品質(zhì)明顯提升。雷亞芳[16]將α-淀粉酶和纖維素酶混合而成的復(fù)合酶噴施在新鮮成熟的陜南K326上部煙葉上,晾干初烤后,發(fā)現(xiàn)煙葉淀粉含量和總糖含量降低、還原糖含量增加,且香氣濃度增加、香氣質(zhì)量得到改善、雜氣和刺激性減少。王林等[11]將混合酶(中性蛋白質(zhì)酶、α-淀粉酶和糖化酶)噴在新鮮煙葉(中煙100上部葉)上,晾干初烤后,發(fā)現(xiàn)煙葉中可溶性糖含量及游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)中性香氣成分含量提高,煙葉品質(zhì)得到改善。S.S.Lin等[17]使用蛋白水解酶和木聚糖水解酶處理新鮮煙葉,初烤后,發(fā)現(xiàn)煙葉和卷煙煙氣中的煙堿分別降低了11.55%和21.85%。

生物酶亦可用于催化處理陳化后烤煙煙絲,處理數(shù)小時(shí)后,煙絲中生物大分子含量明顯降低,煙絲感官品質(zhì)得以提高。朱曉蘭等[18]使用果膠甲酯酶、果膠裂解酶、半乳糖醛酸酶、纖維素復(fù)合酶分別處理烤煙煙絲(云南煙葉C3F)5 h后可有效降低煙葉中果膠含量,其中經(jīng)果膠裂解酶和纖維素酶處理后的煙葉中性香味成分分別提高了24.4%和21.9%。之后,該團(tuán)隊(duì)利用纖維素酶處理烤煙煙絲,發(fā)現(xiàn)煙絲中纖維素的降解率最高可達(dá)13.5%,苯丙氨酸降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和新植二烯等中性香味成分的含量均顯著增加,中性香味物質(zhì)總含量提升了50 μg/g[19]。沙云菲等[20]利用復(fù)合酶制劑(淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶)處理煙絲B2F(pH值為7.7、含水量54%),酶解時(shí)間5.5 h,淀粉和蛋白質(zhì)降解率分別達(dá)到19.54%和20.03%,酶處理后,煙葉的雜氣、勁頭和刺激性得到明顯改善。鄭娟娟[21]利用α-淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合成的復(fù)合酶制劑酶解煙絲(寶雞X3F和商洛B3F),酶解條件為溫度50 ℃、時(shí)間4 h,發(fā)現(xiàn)煙絲還原糖含量增加,揮發(fā)性香氣成分含量大幅提升,煙氣細(xì)膩柔和、甜感增加。羅丹等[22]使用α-淀粉酶和糖化酶在55 ℃條件下處理煙絲(云煙85 C3F,產(chǎn)地涼山)8 h,發(fā)現(xiàn)煙絲中直鏈淀粉和支鏈淀粉分別減少了34.5%和66.7%;但酶處理后煙葉組織結(jié)構(gòu)由于淀粉降解而出現(xiàn)塌陷,呈現(xiàn)大面積的凹凸不平區(qū)域。李洪濤等[23]利用蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、酸性木聚糖酶、脂氧合酶、纖維素酶混合成的復(fù)合酶制劑處理復(fù)烤山東TBO片煙(2009)7 d,發(fā)現(xiàn)處理后煙葉枯焦氣降低,煙香增加,余味得到改善。

也有研究人員利用篩選得到的可降解生物大分子微生物表達(dá)的酶處理煙葉,如王寶強(qiáng)等[24]在篩選產(chǎn)淀粉酶微生物的基礎(chǔ)上制備了淀粉酶,用該酶處理K326 B4F煙葉48 h,發(fā)現(xiàn)煙葉感官品質(zhì)得到改善。賀兆偉等[25]用疣孢青霉菌株TS63-9所產(chǎn)粗酶液處理煙絲(紅花大金元C3F),處理?xiàng)l件為40 ℃、8 h,發(fā)現(xiàn)其可顯著降低煙絲中果膠含量,煙葉感官品質(zhì)也得到一定程度改善。

此外,有研究[26]將復(fù)合生物酶應(yīng)用于在線制絲環(huán)節(jié)(酶解條件為50～60 ℃、4～6 h),發(fā)現(xiàn)處理后膨脹煙絲的木質(zhì)氣、枯焦氣明顯減輕,淀粉、蛋白質(zhì)和煙堿含量降低,膨脹煙絲的感官品質(zhì)和配伍性顯著提升,該研究為生物酶的在線應(yīng)用提供了例證。

由以上研究可知,近年來關(guān)于淀粉、果膠酶催化降解方面的相關(guān)研究取得了較大進(jìn)展,復(fù)合酶的作用效果多優(yōu)于單一酶,并且在煙草生物大分子降解的同時(shí)常常伴隨著煙葉感官品質(zhì)的提高,以及煙葉雜氣和刺激性的降低。但煙用生物酶創(chuàng)制、生物酶催化轉(zhuǎn)化機(jī)制、適應(yīng)卷煙生產(chǎn)條件酶制劑開發(fā)等相關(guān)研究鮮有報(bào)道,亟待深入研究。

2 生物酶在煙梗處理中的應(yīng)用

由煙梗制作的梗絲是卷煙配方的主要原料之一,具有提高燃燒性和降低煙堿、焦油的作用,但梗絲中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、果膠等生物大分子在燃燒過程中會(huì)產(chǎn)生木質(zhì)氣和刺激性,影響卷煙的感官品質(zhì)。生物酶處理煙梗還可以降低其中的木質(zhì)素和纖維素的含量。

近年來,煙梗中木質(zhì)素的降解多采用漆酶、氧化物酶和仿酶,高溫(45～55 ℃)條件下處理數(shù)小時(shí),可明顯降低木質(zhì)素的含量。楊云[27]使用不同產(chǎn)地漆酶處理煙梗絲,發(fā)現(xiàn)白腐菌產(chǎn)的漆酶DENYKEM PAP-5對(duì)煙梗中木質(zhì)素降解效果最好,降解率可達(dá)15.92%,且處理后的煙梗感官品質(zhì)明顯提升。于建軍等[28]研究發(fā)現(xiàn),漆酶降解梗絲木質(zhì)素的條件為溫度45 ℃、漆酶用量20.0 U/g,處理梗絲3 h后木質(zhì)素理論降解率為55.05%,且酶解后的梗絲表面更加光滑、毛突減少,香氣量提高、香氣質(zhì)和余味得到改善。魏登輝[29]利用Fe-CA仿酶和漆酶分別處理梗絲發(fā)現(xiàn)梗絲中木質(zhì)素降解率分別達(dá)到53.03%和55.05%,香氣質(zhì)和香氣量得以提升、木質(zhì)氣減少、刺激性降低。但也有研究[30]表明,使用生物酶處理煙梗漿料后,梗絲的物理結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞。

宋自力等[31-32]使用白腐菌產(chǎn)漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基篩選出多株漆酶高產(chǎn)菌,使用篩選出的血紅密孔菌發(fā)酵粗酶液和菌絲對(duì)煙梗進(jìn)行生物降解,發(fā)現(xiàn)漆酶可以有效降解煙梗中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠,且使用漆酶、纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶處理煙?？蛇_(dá)到同樣效果,該方法可大幅降低漆酶用量,減少工業(yè)成本。姜林峰[5]將漆酶和中性蛋白酶混合后酶解煙梗,發(fā)現(xiàn)酶處理既降低了煙梗中木質(zhì)素含量又抑制了其中蛋白質(zhì)含量的增加。Y.Zhu等[33]研究表明,漆酶降解煙梗木質(zhì)素的機(jī)制可能是它可以破壞煙梗木質(zhì)素酚型苯環(huán)間的β-O-4連接鍵,從而加速木質(zhì)素的氧化解聚。

此外,亦有利用糖苷酶(纖維素酶、果膠酶等)處理煙梗以降低其纖維素、半纖維素和果膠含量的報(bào)道。趙夢(mèng)醒等[34]用纖維素酶和半纖維素酶處理煙梗浸提液可明顯改善煙梗打漿性能。徐達(dá)等[35]使用復(fù)合酶制劑(復(fù)合植物水解酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶)酶解梗絲4 h后,其水溶性總糖和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量分別提高了23.31%和196.3%,果膠含量降低了17.26%,將處理后的梗絲按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的摻配比例添加到金圣卷煙葉組中,葉組焦油含量降低了0.25 mg/支。楊乾栩等[36]利用酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶組成的復(fù)合酶處理煙梗24 h后,煙梗中的大分子物質(zhì)總水解率達(dá)28.34%,煙梗刺激性降低,雜氣得以改善,余味也有所提升,其感官品質(zhì)和工業(yè)可用性得到提高。鄒芳等[37]使用篩選出的枯草芽孢桿菌YC-2降解煙草秸稈(與梗絲成分接近)7 d后,發(fā)現(xiàn)煙稈降解率為10.14%,酶學(xué)特性表明該酶穩(wěn)定性較好,有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。Y.Y.Han等[38]利用果膠酶對(duì)預(yù)爆和搓絲處理的煙梗進(jìn)行酶解后發(fā)現(xiàn),半乳糖醛酸的含量明顯提高,但煙梗的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。

綜上所述,單獨(dú)使用漆酶可有效降低煙梗中木質(zhì)素含量,但同時(shí)會(huì)增加蛋白質(zhì)含量,增大梗絲的刺激性、雜氣,且在一定程度上破壞梗絲的物理結(jié)構(gòu),影響其可用性,因此漆酶與蛋白酶搭配使用效果更佳。其他水解酶的復(fù)合物可一定程度降解煙梗中的大分子物質(zhì)、增加可溶性糖含量,進(jìn)而降低梗絲的雜氣和刺激性。此外,對(duì)煙梗進(jìn)行酸處理、堿處理、汽爆處理等預(yù)處理后再進(jìn)行酶解處理,可顯著提高酶解效果。

3 生物酶在煙草薄片生產(chǎn)中的應(yīng)用

再造煙葉濃縮液是煙草及其制品的水提濃縮物,其中含有大量的煙草生物大分子物質(zhì),但香味物質(zhì)含量較少,在用其制備造紙法生產(chǎn)煙草薄片時(shí)會(huì)影響煙草薄片的品質(zhì)[39]。在煙草薄片工業(yè)生產(chǎn)中,可以應(yīng)用生物酶對(duì)再造煙葉濃縮液中的生物大分子香味前體物等進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化,以提升其品質(zhì)和可用性。

馬科等[40]利用中性蛋白酶處理再造煙葉濃縮液,發(fā)現(xiàn)濃縮液中蛋白質(zhì)、還原糖、總糖和氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大幅降低,新增4-環(huán)戊烯-1,3-二酮、β-紫羅蘭酮等10種香味物質(zhì),煙草薄片的香氣、諧調(diào)性、刺激性、余味等均得到改善。許春平等[41-42]利用由微紫青霉(Penicilliumjanthinellumsw09)產(chǎn)生的果膠酶分別處理再造煙葉原料煙梗末與煙梗,在最優(yōu)處理?xiàng)l件下煙梗末及煙梗中果膠降解率分別達(dá)到38.92%和41.35%,對(duì)酶解后煙梗的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)苯乙酮含量增加、乙酸含量減少、香味物質(zhì)吡咯含量升高。C.Chen 等[43]為提高再造煙葉片的品質(zhì),采用弱堿強(qiáng)化漆酶水解的方法去除煙梗中的木質(zhì)素,發(fā)現(xiàn)漆酶、弱堿和吐溫80協(xié)同作用能顯著提高木質(zhì)素降解率(高達(dá)40.3%)。徐菲菲等[44]依次使用蛋白酶和果膠酶處理再造煙葉濃縮液4 h后,香氣成分總量增加了22%,刺激性降低的同時(shí)煙氣品質(zhì)得到了提升。趙夢(mèng)醒等[30,34]利用纖維素酶和半纖維素酶預(yù)處理煙梗5 h,其漿料中纖維素的相對(duì)含量增加,而煙堿類物質(zhì)相對(duì)含量減少,煙梗漿料的熱穩(wěn)定性得以提高。王茜茜等[45]將混合酶(纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶等)應(yīng)用于梗二級(jí)提取段過程,可有效減少再造煙葉濃縮液中大分子物質(zhì)含量,提高再造煙葉內(nèi)在品質(zhì)及使用價(jià)值,但該酶制劑組成復(fù)雜,成本較高。劉恩芬等[46]利用混合酶(淀粉酶、蛋白酶、果膠酶及纖維素酶)對(duì)煙梗膏稀釋液進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化處理,可在一定程度上控制煙梗提取液中大分子物質(zhì)的含量,為生產(chǎn)過程中煙梗提取液的品質(zhì)提升奠定一定的理論依據(jù)。

綜上所述可知,因?yàn)樵僭鞜熑~濃縮液為有水環(huán)境,相較于煙葉、煙梗和煙絲,生物酶處理再造煙葉濃縮液具有處理時(shí)間短、效率高、作用效果顯著等優(yōu)點(diǎn),是生物酶應(yīng)用于煙草工業(yè)的重要應(yīng)用窗口。

4 生物酶在生物產(chǎn)香中的應(yīng)用

近年來,利用酶進(jìn)行生物產(chǎn)香的研究逐漸成為煙草行業(yè)的熱點(diǎn)之一,且多數(shù)集中在利用水解酶和氧化還原酶處理煙草提取物,以產(chǎn)生新的香味成分,并將其制備成煙用香料。

劉彩紅[47]采用淀粉酶和β-淀粉酶水解煙草廢棄物7 h,將酶解液與L-丙氨酸進(jìn)行美拉德反應(yīng),反應(yīng)物中檢測(cè)出與煙草相關(guān)的香味成分57種,兩種酶對(duì)卷煙香氣有較好的修飾作用。許春平等[48]利用纖維素酶與木瓜蛋白酶處理煙末水提物并進(jìn)行美拉德反應(yīng),反應(yīng)物檢測(cè)出與煙草相關(guān)的香味成分38種,且反應(yīng)物能降低卷煙煙氣的刺激性,諧調(diào)香味。劉珊等[49]利用黃嘌呤氧化酶催化氧化降解β-胡蘿卜素,生成了煙草及煙草制品中的重要香氣物質(zhì)(如異佛爾酮、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮及二氫獼猴桃內(nèi)酯等)。白家峰等[12]用酶降解煙草花蕾,然后進(jìn)行美拉德反應(yīng),產(chǎn)物中軟脂酸、肉豆蔻酸、苯甲醇、苯乙醛、三環(huán)烯等物質(zhì)含量較高,二氫獼猴桃內(nèi)酯、大馬士酮、油酸酰胺、2-正戊基呋喃等致香物質(zhì)含量提高,對(duì)煙草香氣貢獻(xiàn)突出,但作者并未交代酶的種類和來源。

由以上研究可知,目前煙草行業(yè)利用酶進(jìn)行生物產(chǎn)香主要有3種途徑:一是利用水解酶降解煙草生物大分子物質(zhì)(包括蛋白質(zhì)和多糖類成分),所產(chǎn)生的氨基酸和糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)生成香氣物質(zhì);二是利用糖苷水解酶催化轉(zhuǎn)化煙草香味前體物生成香氣物質(zhì);三是利用氧化還原酶直接催化香味前體物產(chǎn)香,但是該方向尚缺乏系統(tǒng)性研究,產(chǎn)香機(jī)制也尚未完全闡明。

5 生物酶在煙草工業(yè)中其他方面的應(yīng)用

目前,亦有利用生物酶降解煙草有害成分及利用煙草資源生產(chǎn)高附加值酶等方面的報(bào)道。劉興余等[50]將生物酶用于卷煙和再造煙葉生產(chǎn)過程,酶解后煙葉中NNK(4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮)釋放量選擇性降低了23.2%,且酶解煙葉所制卷煙的感官評(píng)價(jià)結(jié)果與對(duì)照組無明顯差異。L.Z.Liu等[51]將過氧化氫酶固定在聚丙烯酰胺殼中制備的納米膠囊能有效清除煙草煙霧中90%的自由基。C.W.Dong等[52]利用來自假單胞菌的煙堿羥化酶催化6-羥基-3-琥珀酰吡啶轉(zhuǎn)化成2,5-二羥基吡啶,后者是抗癌藥物5-氨基乙酰丙酸的前體物。Y.X.Zheng 等[53]使用固定化米根霉發(fā)酵煙草工業(yè)廢水以生產(chǎn)內(nèi)、外切聚半乳糖醛酸酶(可水解木質(zhì)纖維素果膠),實(shí)現(xiàn)果膠降解酶的高效生產(chǎn)。G.Zhang等[54]從雪茄茄衣中分離出龍舌蘭桿菌,該菌可表達(dá)堿性果膠酶,果膠酶活性最高可達(dá)1370 U/mL。

從以上研究可知,生物酶在煙草工業(yè)中的應(yīng)用還包括:利用生物酶催化轉(zhuǎn)化煙草有害物以降低其含量,催化轉(zhuǎn)化尼古丁以獲得藥物前體物,以及從煙草源微生物中挖掘重要功能基因等。

6 結(jié)論與展望

目前,生物酶在煙草工業(yè)中的研究多集中于利用生物酶處理煙草及煙草制品,以降低煙草中生物大分子物質(zhì)含量和有害物含量,以及增加香味物質(zhì)含量等方面,而關(guān)于煙草生物大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶制劑的創(chuàng)制及酶催化轉(zhuǎn)化機(jī)制的闡明等方面研究較少。因此,對(duì)于生物酶在煙草工業(yè)中的應(yīng)用,今后的研究主要應(yīng)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

1)在煙草加工過程中,煙葉生物大分子物質(zhì)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化,從而導(dǎo)致研究者無法選擇最合適的生物酶。所以,表征調(diào)制及醇化過程中煙草生物大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和存在形式,建立煙草中生物大分子物質(zhì)的檢測(cè)方法,對(duì)于生物酶的篩選、煙用生物酶的創(chuàng)制、生物酶特異性和效率提高等具有重要意義。

2)基于酶的結(jié)構(gòu)特異性,開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的特異性催化煙草生物大分子物質(zhì)的新型生物酶,提高酶的底物特異性,降低成本,加快產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

3)卷煙的加工環(huán)境具有高溫、低水分、高滲透壓及高煙堿等特點(diǎn),這種環(huán)境抑制了現(xiàn)有生物酶的催化效率。針對(duì)該問題,可對(duì)現(xiàn)有生物酶進(jìn)行基因工程改造使其適應(yīng)卷煙環(huán)境,進(jìn)而拓寬其使用范圍,提高其催化效率。