基于NF-κB通路探究亞麻油干預(yù)心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制

耿 蕓,宋海燕,刁學(xué)織

心肌梗死是指急性心肌缺血壞死,是臨床常見的疾病。心肌梗死早期癥狀主要以疼痛為主,臨床表現(xiàn)主要是突然發(fā)作的胸口壓榨性疼痛,程度較重,持續(xù)時(shí)間長,可達(dá)數(shù)小時(shí)或更長,休息及含服硝酸甘油無效,疼痛可放射至下頜、頸部、背部;有時(shí)也可表現(xiàn)為全身癥狀、心律失常、胃腸道癥狀等[1-3]。心肌梗死后心臟會進(jìn)行心室重塑,細(xì)胞外膠原基質(zhì)不斷沉積,成纖維細(xì)胞增殖,導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化及細(xì)胞凋亡[4-5]。其中心肌纖維化在心室重塑中起重要作用,心肌纖維化是心肌的自我修復(fù)和炎癥反應(yīng)過程,如果纖維化加重,則心肌僵硬度增加,順應(yīng)性下降,導(dǎo)致心臟舒張功能受損,纖維化增加,使具有收縮功能的心肌細(xì)胞比例減少,從而導(dǎo)致心臟收縮功能受損[6-7]。心肌纖維化的發(fā)生和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、多種細(xì)胞因子及細(xì)胞自噬等各種因素相互作用有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一種廣泛的轉(zhuǎn)錄因子,能和很多基因結(jié)合,參與炎癥、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖凋亡等多種活動。有研究表明,心血管疾病的發(fā)生多與NF-κB信號通路有關(guān)[8]。亞麻籽富含α-亞麻酸、亞麻酸及木酚素等功能性成分,其中,α-亞麻酸是一種植物來源的n-3必需脂肪酸,是長鏈n-3不飽和脂肪酸二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的前體物質(zhì)。有研究表明,膳食補(bǔ)充α-亞麻酸對心血管疾病的預(yù)防和治療有重要的作用[9]。心肌纖維化會造成心室重塑,導(dǎo)致心功能下降,傳導(dǎo)障礙,誘發(fā)心律失常、心力衰竭等。因此,預(yù)防心肌纖維化是心肌梗死病人治療的關(guān)鍵。本研究基于NF-κB通路探究亞麻油干預(yù)心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 54只SD大鼠(雌雄各半),遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供,體質(zhì)量190～220 g,溫度(22±1)℃,分6籠飼養(yǎng),濕度45%～55%,大鼠活動飲水自由,給予1周時(shí)間習(xí)慣新環(huán)境,按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動物許可證號:SYXK(遼)2019-0034。

1.2 藥物、試劑與儀器 冷榨亞麻籽油(α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)56%)購自上海西格生物科技有限公司;卡托普利(國藥準(zhǔn)字H19993135,規(guī)格:每片25 mg)購自云南龍恩制藥有限公司;一抗、二抗購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;小動物超聲購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;Masson染色購自無錫菩禾生物醫(yī)藥;蛋白電泳儀購自北京德元國際科技公司;三乙醇胺(TBS)緩沖液購買自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司。

1.3 建模及分組 分組:將54只大鼠隨機(jī)分為6組,每組9只,假手術(shù)組(control group,CO組)、模型組(model group,MO組)、亞麻油低劑量組(linseed oil low dose group,LL組)、亞麻油中劑量組(linseed oil medium dose group,LM組)、亞麻油高劑量組(linseed oil high dose group,LH組)、卡托普利組(captopril group,CA組)。建模:術(shù)前禁食水,腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉,使大鼠充分麻醉后,經(jīng)喉氣管插管連接小動物呼吸機(jī),胸部備皮消毒后,沿左側(cè)3～4肋間間隙開胸,撕開心包膜后可見心臟。心臟大靜脈作為標(biāo)記,使用5-0帶線縫合針于左心耳下緣約2 mm位置結(jié)扎左冠狀動脈前降支。觀察左心室心肌的運(yùn)動及顏色變化,室壁運(yùn)動減弱、結(jié)扎部位及周圍心肌變白認(rèn)為手術(shù)結(jié)扎成功。術(shù)后第2天進(jìn)行心電圖檢查,圖紙中出現(xiàn)5～8個(gè)病理性Q波(觀察Ⅰ、aVL、V1～V6導(dǎo)聯(lián))、ST段抬高,表明模型制備成功。CO組大鼠則將手術(shù)線穿過肺動脈圓錐與左心耳之間,不進(jìn)行結(jié)扎,且無上述病理表現(xiàn)。

1.4 干預(yù)方法 建模成功后,LL組大鼠給予亞麻油0.025 g/kg灌胃,LM組大鼠給予亞麻油0.050 g/kg灌胃,LH組大鼠給予亞麻油0.150 g/kg灌胃,CA組大鼠給予卡托普利10 mg/kg灌胃,以上用藥均為每日1次,共干預(yù)4周,CO組及MO組大鼠不用藥,給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 超聲檢測大鼠心臟功能 以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,使用小動物超聲儀器繪制大鼠超聲心電圖,檢測大鼠心功能。探頭置于大鼠胸骨左緣3～4肋間,測量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室短軸縮短率(LVFS)參數(shù)。

1.6 心肌組織病理學(xué)和心肌纖維化程度觀察

1.6.1 心肌組織HE染色 用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,大鼠處死后分離心臟,取心肌組織,置于4%多聚甲醛液固定24 h,梯度乙醇脫水,透明,浸蠟包埋、切片取5 μm厚度,用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,水洗5 min,HE染色10 min,水洗,再次梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察心肌組織變化。

1.6.2 心肌組織Masson染色 取大鼠心肌組織,遵照Masson染色試劑盒操作說明處理,封片后通過顯微鏡觀察心肌纖維化程度(肌纖維呈紅色,膠原呈藍(lán)色)并照相保存;通過圖像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF),CVF(%)=(膠原面積/視野總面積)×100%,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野測量,取平均值。

1.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測大鼠心肌組織中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá) 取心肌組織50 mg放于酶EP管中,加入Trizol 1.0 mL,無核酸酶溶解,按照試劑盒提取總RNA后,進(jìn)行純化,收集純化后的總RNA。取RNA母液10 μL加焦磷酸二乙酯(DEPC)水990 μL稀釋100倍,采用紫外線分光光度儀器檢測RNA純度,并計(jì)算濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,獲得反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:42 ℃作用60 min,72 ℃作用5 min,4 ℃終點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,以β-actin為內(nèi)參,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)作用3 min,95 ℃作用5 s,58 ℃退火,40個(gè)循環(huán)。詳見表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.8 免疫印跡法檢測大鼠心肌組織中NF-κB、NF-κB p65、TNF-α蛋白的表達(dá) 取大鼠心肌組織,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后切碎,再加1 mL細(xì)胞裂解液裂解30 min,10 000 r/min、4 ℃離心5 min,取上清液,上樣,緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進(jìn)行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用雙辛可寧酸(BCA)法檢測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,然后全部轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再加入脫脂奶粉,全程封閉時(shí)長為1 h。加入一抗NF-κB、NF-κB p65、TNF-α(稀釋比例1∶1 000)后,TBS20(TTBS)漂洗,共3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶1 000),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用博士德生產(chǎn)的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒,在1 mL水中加A、B、C液各1滴,再加于膜上,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲檢測指標(biāo)比較 與CO組相比,MO組LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠超聲檢測指標(biāo)比較

2.2 HE染色結(jié)果 CO組大鼠左心室的心肌細(xì)胞彼此平行,且在光學(xué)顯微鏡下呈有序排列。細(xì)胞結(jié)構(gòu)未被破壞,大小正常,中心是橢圓形的核,橫向條紋明顯可見。MO組大鼠心肌細(xì)胞萎縮,細(xì)胞色素沉著,細(xì)胞質(zhì)增生,心肌纖維斷裂,炎性細(xì)胞大量浸潤,纖維細(xì)胞增加。LL組、LM組、LH組、CA組染色相對均勻,梗死部位的纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度較模型組改善,其中,LH組和CA組改善效果較LL組和LM組明顯。詳見圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)(×200)

2.3 Masson染色結(jié)果及CVF值 CO組大鼠心肌組織排列整齊,染色均勻,基本無膠原纖維;MO組大鼠心肌組織破壞嚴(yán)重,心肌細(xì)胞殘存較少,膠原纖維增加,出現(xiàn)明顯心室重塑表現(xiàn);各用藥組染色相對均勻,與MO組相比,完整的心肌細(xì)胞增多,膠原纖維不同程度減少,其中,LH組和CA組改善效果較LL組和LM組明顯,心肌纖維化程度較輕。詳見圖2。

圖2 Masson染色觀察各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)(×200)

通過Image J圖像分析軟件計(jì)算各組大鼠心肌CVF結(jié)果,CO組、MO組、LL組、LM組、LH組和CA組CVF分別為(0.91±0.15)%,(22.01±1.17)%,(13.15±3.24)%,(8.48±0.76)%,(5.63±1.07)%,(5.57±0.98)%。與CO組相比,MO組CVF值明顯升高(P<0.05);與MO組相比,其他藥物干預(yù)組CVF值明顯降低(F=203.700,P<0.05),各亞麻油治療組間CVF值隨亞麻油治療劑量增加而降低(P<0.05),LH組和CA組CVF值降低最明顯,組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.124,P=0.902)。詳見圖3。

MO組與CO組比較,＊ P<0.05;與MO組比較,#P<0.05;與LL組比較,△ P<0.05;與LM組比較,※ P<0.05。

2.4 各組大鼠心肌組織中HIF-1α、CTGF mRNA表達(dá)比較 與CO組相比,MO組大鼠心肌組織中CTGF mRNA表達(dá)增加,HIF-1α mRNA表達(dá)下降(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組HIF-1α mRNA表達(dá)增加,CTGF mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組HIF-1α mRNA表達(dá)增加,CTGF mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組HIF-1α mRNA表達(dá)增加,CTGF mRNA表達(dá)降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織HIF-1α、CTGF mRNA表達(dá)比較

2.5 各組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與CO組相比,MO組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與MO組相比,LL組、LM組、LH組、CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與LL組相比,LM組、LH組和CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與LM組相比,LH組和CA組NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05),LH組和CA組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB、TNF-α、NF-κBp65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

急性心肌梗死是心血管疾病死亡的主要原因之一,我國急性心肌梗死的發(fā)病率不斷升高,死亡率也呈整體上升趨勢,高額的醫(yī)藥費(fèi)用造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),同時(shí)也影響人們的生活質(zhì)量[10-11]。在心肌梗死發(fā)生后,缺血心肌釋放的細(xì)胞因子通過各種信號通路被激活,引起心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的過度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,最終誘發(fā)心肌炎癥反應(yīng)、心肌纖維化及心功能障礙,因此,抑制炎癥反應(yīng)可以減輕心臟纖維化程度及心肌損傷。有研究發(fā)現(xiàn),亞麻油對冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化造成的血管狹窄和堵塞所引起的心肌缺氧、壞死的心臟病有一定治療作用[12]。因此,本研究基于NF-κB通路探究亞麻油干預(yù)心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過亞麻油干預(yù)后,NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低,說明亞麻油對心肌梗死大鼠纖維化有保護(hù)作用,可以抑制炎癥反應(yīng),防止斑塊的形成、破裂,對心肌細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。卡托普利能作用于心臟的腎素-血管緊張素系統(tǒng),阻斷血管緊張素Ⅱ并下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β,從而抑制心肌梗死后的膠原增生,改善心肌纖維化。但是卡托普利有較多的不良反應(yīng),可引起心悸、蛋白尿、味覺遲鈍等。亞麻油對人體健康有益,具有增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防癌癥等多種功效[13]。近年來,心血管疾病的危險(xiǎn)因素研究中炎性因子引起眾多學(xué)者的關(guān)注,NF-κB廣泛存在于包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞中,具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用。急性心肌梗死發(fā)生時(shí)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)NF-κB激活,活化的NF-κB經(jīng)細(xì)胞外的正反饋途徑,增強(qiáng)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄,使TNF-α產(chǎn)生和釋放增多,而TNF-α作為NF-κB激活劑,再次激活NF-κB,導(dǎo)致最初的炎癥信號進(jìn)一步放大[14]。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,TNF-α通過促進(jìn)基質(zhì)蛋白溶解,抑制血管平滑肌細(xì)胞的膠原蛋白基因表達(dá)和膠原合成參與斑塊形成和破裂,從而促進(jìn)心肌梗死的發(fā)生發(fā)展和并發(fā)癥的發(fā)生。

孫治霞等[15]通過對心肌梗死大鼠的研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死后NF-κB信號通路相關(guān)炎性因子TNF-α、NF-κB表達(dá)增加,NF-κB DNA結(jié)合活性增加,提示心肌梗死后NF-κB通路被激活,同時(shí)TNF-α、NF-κB表達(dá)降低,可以防止心肌細(xì)胞的損傷,抑制心肌梗死大鼠心肌纖維化。已有研究表明,亞麻油中α-亞麻酸對血栓的形成有一定的抑制作用,能夠改變血液流動性,預(yù)防心腦血管疾病,同時(shí)亞麻油中的亞麻籽蛋白可以保護(hù)心臟[16]。Ni等[17]研究發(fā)現(xiàn),亞麻油可以增強(qiáng)免疫力,同時(shí)亞麻油中α-亞麻酸可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的腸道微生物群,降低脂多糖引起的局部炎癥,有較好的抗炎作用。

本研究發(fā)現(xiàn),MO組大鼠LVFS、LVEF降低,LVESD、LVEDD升高,說明心肌梗死大鼠心臟舒張功能受損。經(jīng)過亞麻油干預(yù)后LVFS、LVEF升高,LVESD、LVEDD降低,說明亞麻油可改善大鼠心臟的收縮和舒張功能,減輕心肌纖維化損傷,保護(hù)心肌。HE染色顯示,MO組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松且有斷裂、排列紊亂、炎性細(xì)胞增多,有明顯出血壞死。Masson 染色可見MO組大鼠大片藍(lán)色的心肌膠原沉積于心肌細(xì)胞及血管周圍;MO組大鼠心肌纖維化指標(biāo)CVF較CO組顯著升高,說明MO組心肌纖維化嚴(yán)重、心肌肥厚顯著。經(jīng)過亞麻油干預(yù)后發(fā)現(xiàn),亞麻油可以增加心室壁的順應(yīng)性,改善大鼠心功能,抑制心室重構(gòu),逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。亞麻油具有抑制心臟成纖維細(xì)胞DNA的合成,從而減輕膠原增生,抑制心肌纖維化作用。有研究表明,亞麻油在預(yù)防冠心病、糖尿病、結(jié)腸癌和減重等方面有一定的效果[18]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)亞麻油干預(yù)后,HIF-1α mRNA表達(dá)增加、CTGF mRNA表達(dá)降低,說明大鼠心功能得到了改善,亞麻油可提高HIF-1α的表達(dá),降低CTGF的表達(dá),從而對心肌梗死大鼠心肌纖維化起到抑制作用。有研究認(rèn)為,引起心肌纖維化的主要機(jī)制是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活,該系統(tǒng)中的關(guān)鍵活性成分為血管緊張素Ⅱ,其可以激活和促進(jìn)一系列生長因子(如TNF-α、CTGF等)表達(dá),最終引起細(xì)胞外基質(zhì)的大量積聚,導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。HIF-1α是在低氧條件下產(chǎn)生的一種內(nèi)源性關(guān)鍵的氧敏感轉(zhuǎn)錄因子,在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)控多種基因表達(dá),從而發(fā)揮機(jī)體對低氧或缺血的保護(hù)性適應(yīng)。CTGF是與各種器官組織纖維化過程密切相關(guān)的細(xì)胞因子.能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α可以降低炎性因子的表達(dá),并且其作用機(jī)制和抑制NF-κB通路有關(guān)。HIF-1α活化后能夠降低心肌酶活性,改善心肌組織形態(tài),抑制心肌細(xì)胞凋亡,降低心肌梗死面積,從而改善心肌梗死后心肌纖維化損傷[19]。Parikh等[20]通過對心肌梗死大鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過亞麻油干預(yù)后,大鼠心律失常的發(fā)生率降低,心肌纖維化及TNF-α表達(dá)降低,說明亞麻油可以預(yù)防和治療心肌梗死后的心律失常,同時(shí)還能保護(hù)心肌,與本研究結(jié)果一致。

綜上所述,亞麻油可以抑制大鼠心肌纖維化,改善心功能,對心肌梗死大鼠心肌起保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB相關(guān)信號通路有關(guān)。