基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討祛濕化痰方治療冠心病的作用機制

侯時昭,許文靜,藍濤華,呂渭輝

冠心病(coronary heart disease,CHD)是全球最為常見的慢性病之一,《中國心血管病報告2018》[1]指出,目前我國有1 100萬例冠心病病人,心血管病死亡率居首位,早在2014年我國內(nèi)地冠心病病人應(yīng)用經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)治療已超過50萬例,但有研究發(fā)現(xiàn),仍有50%以上經(jīng)PCI術(shù)治療的病人出現(xiàn)心絞痛癥狀纏綿不愈的情況[2],而針對這種情況現(xiàn)代醫(yī)學尚未有明確的辦法予以改善。

祛濕化痰方是根據(jù)陳可冀院士多年醫(yī)治冠心病的臨床經(jīng)驗總結(jié)而成,對心絞痛具有較好的臨床療效,全方以不換金正氣散及二陳湯為基礎(chǔ),以“濕損血絡(luò)”為病機核心,主治胸痹心痛之濕證。本研究擬使用Hopkins提出的集合數(shù)據(jù)庫檢索、數(shù)據(jù)挖掘、靶點預(yù)測及模擬實驗室等多種研究手段,并結(jié)合中藥成分與靶點的分子對接構(gòu)象,多角度分析中藥成分-靶點間的相互聯(lián)系和作用,期望憑借網(wǎng)絡(luò)藥理學分析方法研究祛濕化痰方治療冠心病的分子機制及生物通路機制。

1 資料與方法

1.1 祛濕化痰方的主要化學成分及作用靶點 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)檢索祛濕化痰方中的每味藥物及其相應(yīng)的有效成分及作用靶點,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18作為基礎(chǔ)閾值來篩選,篩查出祛濕化痰方的主要作用靶點和化學成分。

1.2 祛濕化痰方的藥物作用靶點與冠心病的相關(guān)基因靶點的交集分析 應(yīng)用GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(http://omim.org)數(shù)據(jù)庫檢索冠心病的相關(guān)基因。檢索時將關(guān)鍵詞設(shè)定為“冠心病(coronary heart disease)”,再將兩個數(shù)據(jù)庫中找到的基因進行合并,剔除重復內(nèi)容,最終得出冠心病相關(guān)的基因靶點。結(jié)合祛濕化痰方中的藥物作用靶點,運用Venny軟件繪制祛濕化痰方治療冠心病的交集靶點韋恩圖。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI) 利用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析,并同步構(gòu)建“祛濕化痰方-化合物-靶點-冠心病”的網(wǎng)絡(luò)圖。具體操作步驟:首先,在STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中導入祛濕化痰方治療冠心病的交集靶點,以置信度大于0.9作為篩選條件,勾選“Multiple proteins”,將物種設(shè)定為“Homo sapiens”,構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。然后,將STRING庫中過濾出的基因靶點數(shù)據(jù),運用CytoNCA插件,通過Closeness、Network、Degree等6種評分來篩選,篩選出最核心的基因蛋白交互靶點。

1.4 基因本體(GO)生物過程及京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析 利用R語言程序分析祛濕化痰方治療冠心病的交集基因靶點,設(shè)定以Q-value<0.05、P-value<0.05為基礎(chǔ)閾值,完成GO生物過程以及KEGG通路富集分析。然后,選取GO生物過程分析中前10位以及KEGG信號通路富集分析中前30位,進一步做可視化處理。

1.5 分子對接分析 將最終篩選出來的核心基因?qū)?yīng)的化合物的小分子配體2D結(jié)構(gòu)通過PubChem網(wǎng)站下載,而其3D結(jié)構(gòu)則應(yīng)用Chemoffice軟件轉(zhuǎn)化,并最終得出mol2格式文件。核心基因?qū)?yīng)的蛋白名稱通過UniProt(https://www.uniprot.org/)翻譯,而三維結(jié)構(gòu)通過此名稱從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中找出,并最終以pdb格式保存。將蛋白三維結(jié)構(gòu)中的水分子及小分子配體使用PyMOL軟件刪除,僅保存蛋白受體三維結(jié)構(gòu)。通過AutodockTools軟件對蛋白受體進行加氫,計算電荷,將運算后的蛋白受體及小分子配體都以pdbqt格式文件保存,使用Grid Box設(shè)置蛋白受體的格點參數(shù)及坐標軸的大小,尋找小分子配體和蛋白受體的結(jié)合點。運用vina軟件,以模型≤20個,結(jié)合能≤5.0 kJ/mol為閾值,得出相應(yīng)的結(jié)合位點及結(jié)合能。最后,應(yīng)用PyMOL軟件進行可視化分析,繪制出分子對接構(gòu)象圖。

2 結(jié) 果

2.1 祛濕化痰方主要活性化合物成分及其基因靶標預(yù)測 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫,擬定DL≥0.18、OB≥30%為閾值,發(fā)現(xiàn)陳皮、蒼術(shù)、半夏、莪術(shù)、石菖蒲、厚樸分別含有5個、9個、13個、3個、4個、2個活性化合物成分,整個復方合計36個祛濕化痰方主要活性化合物成分(見表1)。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索祛濕化痰方藥物,排除重復后得到416個對應(yīng)的潛在作用靶點,通過UniProt網(wǎng)站將其轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱。

表1 祛濕化痰方活性化合物信息

2.2 篩選冠心病基因靶點 通過OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫,共篩選出7 264個與冠心病關(guān)聯(lián)緊密的基因靶點。

2.3 祛濕化痰方與冠心病交集靶點 將416個藥物潛在作用靶點及7 264個疾病基因靶點錄入Venny軟件,計算得出140個祛濕化痰方與冠心病的交集蛋白靶點,并繪制祛濕化痰方與冠心病交集靶點蛋白韋恩圖。詳見圖1。

圖1 祛濕化痰方與冠心病交集靶點蛋白的韋恩圖

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4.1 構(gòu)建“祛濕化痰方-化合物-靶點-冠心病”交集網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.7.2軟件計算得出“祛濕化痰方-化合物-靶點-冠心病”交集網(wǎng)絡(luò)。圖中圓形節(jié)點代表藥物化學成分,用不同顏色代表化合物來源,藍綠色、藍色、綠色、紫色、紅色分別代表蒼術(shù)、陳皮、莪術(shù)、厚樸、半夏。藍色方形節(jié)點代表冠心病基因靶點,而基因靶點與藥物化學成分的聯(lián)系緊密程度與藍色節(jié)點面積大小成正比;這兩者的相互關(guān)系則使用連線來代表。詳見圖2。

圖2 祛濕化痰方-主要成分-靶點-冠心病交集網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 構(gòu)建祛濕化痰方與冠心病共表達PPI網(wǎng)絡(luò)圖 繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn),共有118個基因蛋白靶點,連線表示蛋白相互作用關(guān)系,共826條。詳見圖3。

圖3 共表達蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.3 篩選核心基因蛋白靶點 采用Cytoscape 3.7.2軟件中CytoNCA插件,多重評分逐步過濾出雌激素受體α(ESR1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、JUN、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、腫瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶B1(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)共7個核心基因蛋白靶點。詳見圖4。

圖4 核心基因靶點篩選

2.5 GO生物過程及KEGG信號通路富集分析

2.5.1 GO生物過程富集分析 GO生物過程富集分析是由分子功能(molecular function,MF)、細胞組成(cellular component,CC)和生物過程(biological process,BP)3個部分共同組成的。在MF方面,祛濕化痰方治療冠心病與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活子結(jié)合、核受體活性等有關(guān);在CC方面,祛濕化痰方治療冠心病與細胞突觸前膜及后膜的組成部分、細胞質(zhì)囊泡腔、質(zhì)膜小腔等有關(guān);在BP方面,該治療與氧化應(yīng)激反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的響應(yīng)等有關(guān)。詳見圖5。

圖5 GO生物過程富集分析圖

2.5.2 KEGG信號通路富集分析 繪制KEGG信號通路氣泡圖(見圖6)以及KEGG信號通路與核心基因靶點列表(見表2)。在KEGG通路富集分析結(jié)果中包括170條信號通路,可分為三大類別:①直接信號通路,包括雌激素信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路等;②感染相關(guān)通路,包括人巨細胞病毒感染、麻疹、弓形蟲病等;③癌癥相關(guān)通路,包括小細胞肺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等。這些信號通路與多種機制相關(guān),包括細胞凋亡、Th17細胞分化、內(nèi)分泌抵抗等。

圖6 KEGG信號通路富集分析圖

表2 KEGG信號通路與核心基因靶點

冠心病與PI3K-AKT、雌激素信號通路關(guān)系較為密切。因此,繪制相關(guān)通路圖的時候采用這兩條通路來進行分析,并將與本研究相關(guān)的基因蛋白靶點在通路圖中標紅來注明(見圖7、圖8)。如圖所示,獲得的核心基因蛋白靶點位于這兩個信號通路中。因此可以推斷,PI3K-AKT與雌激素信號通路與祛濕化痰方治療冠心病的生物通路機制密切相關(guān)。

圖7 雌激素信號通路圖

圖8 PI3K-Akt信號通路圖

2.6 分子對接結(jié)果 分子對接需要受體和配體進行配對,本研究中受體正是核心基因蛋白,配體是作用于核心基因蛋白受體對應(yīng)的小分子化合物。通過這兩者的配對,列出核心基因與小分子化合物配體配對情況(見表3)。冠心病關(guān)聯(lián)緊密的基因蛋白及相應(yīng)的小分子化合物是通過文獻檢索獲得,再進行分子對接,呈現(xiàn)出可視化的分子對接構(gòu)象(見圖9)。通過配對結(jié)果可知,結(jié)合能(≤-8.0 kJ/mol)較小的是ESR1、AKT1與柚皮苷(naringenin),MAPK14與漢黃芩素(wogonin)這兩組。同時,他們之間的分子構(gòu)象較為穩(wěn)定。

圖9 小分子化合物與基因蛋白分子對接構(gòu)象

表3 核心基因與小分子化合物配對情況

3 討 論

冠心病屬中醫(yī)學“卒心痛”“真心痛”“胸痹”“心痛”等病癥范疇?！靶乇浴辈C在《金匱要略》一書中歸納為“陽微陰弦”,這一點在現(xiàn)代醫(yī)家研究冠心病時被多次提及,成為一種公認的基本病機。然而在疾病具體的病理病機發(fā)展中,各位醫(yī)家又有不同的見解,許多醫(yī)家認為當以血瘀為主,也有醫(yī)家認為當以痰濁或虛損為主,但少有關(guān)于濕證的研究。《癥因脈治·胸痹》有云:“胸痹之因,飲食不節(jié),饑飽損傷,痰凝血滯,中焦混濁,則閉食悶痛之癥作矣”;又如明代《醫(yī)學正傳》有云:“津液黏稠,為痰為飲,積久滲入脈中,血為之濁”,可知胸痹心痛的病機是濕濁入脈,阻礙氣血運行,血液久滯而渾濁,導致?lián)p傷心之脈絡(luò)。

祛濕化痰方是陳可冀院士總結(jié)多年醫(yī)治冠心病的臨床經(jīng)驗所創(chuàng),本方以“濕損血絡(luò)”為病機核心,以不換金正氣散及二陳湯為基礎(chǔ),主治胸痹心痛之濕癥。方中以厚樸和蒼術(shù)共為君藥,厚樸溫中下氣、破血化滯,蒼術(shù)除濕理氣、總解諸郁,二藥合用,著重在除中焦之濕濁,溫煦行氣,使脈中之濕盡去,并推動脈中血液運行,以奏寬中理氣、除濕開郁之功。陳皮、法半夏為臣藥,與二陳湯中的用法雷同,可燥濕化痰、理氣散結(jié),而與二陳湯相比,祛濕化痰方中法半夏之量比陳皮多,故燥濕之力比二陳湯更甚。莪術(shù)主治心膈痛,為治積聚諸氣之要藥,可行氣活血通絡(luò),在祛濕化痰方佐助君藥祛瘀行氣。石菖蒲取其氣味,引氣入心經(jīng),舒心氣之妙藥,可行氣祛濕開竅,引領(lǐng)諸藥進入心經(jīng),直達病位。君臣佐使合參,共奏祛濕化痰、行氣活血之功。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析祛濕化痰方治療冠心病的具體效應(yīng)靶點。獲得核心化合物成分包括漢黃芩素、柚皮苷、川皮苷、β-谷甾醇、黃芩苷元等,大多可以起到改善冠心病病人癥狀的作用。有研究顯示,β-谷甾醇可降低心肌炎癥反應(yīng),抑制心肌細胞凋亡,緩解心肌損傷[3]。川皮苷可以顯著緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡信號通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達水平[4]。有研究發(fā)現(xiàn),漢黃芩素防治冠心病的作用機制包括抑制心肌缺血再灌注損傷、抗炎和抗氧化[5-6]。有研究表明,柚皮苷可減少細胞凋亡/焦亡,從而減輕心肌超微結(jié)構(gòu),抑制心室重構(gòu),改善心功能[7-8]。

核心基因與小分子化合物配對顯示,藥物及疾病的交集核心基因共有7個,其中ESR1、AKT1、MAPK1、MAPK3、MAPK14這5個基因與冠心病關(guān)聯(lián)最為緊密。MAPK1、MAPK3、MAPK14均是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的重要信號分子,通過干預(yù)MAPK信號通路參與了細胞肥大、增生、凋亡的過程[9]。多項研究顯示,心肌ESR1在褐家鼠心血管組織中的表達較多,可以激活MAPK信號通路,影響PI3K-AKT信號通路的傳導,增強其抗氧化能力,縮小梗死面積,減少心肌細胞凋亡,減輕炎癥和氧化應(yīng)激,誘導血管擴張和增加新生血管[10-12]。眾所周知,心肌細胞凋亡和存活與AKT信號通路密切相關(guān)。有研究認為,AKT1作為AKT信號通路重要的信號分子,除了具有調(diào)控細胞凋亡的作用外,還可能通過促進炎癥反應(yīng),干涉成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化,從而影響心肌纖維化[13-14]。

本研究通過分子對接運算后顯示,柚皮苷與ESR1、AKT1,漢黃芩素與MAPK3、MAPK14均具有較小的結(jié)合能,且分子構(gòu)象穩(wěn)定,說明祛濕化痰方可能主要通過影響ESR1、AKT1、MAPK3、MAPK14等靶基因的表達來發(fā)揮治療冠心病的作用。通過GO生物過程及KEGG通路富集分析,并結(jié)合冠心病疾病發(fā)展的特點,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激機制、細胞凋亡機制、雌激素通路、PI3K-AKT信號通路等與冠心病關(guān)聯(lián)最為密切,且富集較多,極有可能是祛濕化痰方治療冠心病的潛在機制及通路。多項研究表明,在雌激素通路中,雌激素可以多途徑來激活PI3K-MAPK信號通路,調(diào)節(jié)細胞凋亡機制、氧化應(yīng)激反應(yīng)機制、減輕病理性心肌肥大等[10,15-17]。研究顯示,PI3K-AKT信號通路是一個強表達的生物信號系統(tǒng),在心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用,并調(diào)控缺血再灌注損傷,影響氧化應(yīng)激損傷,改善心肌細胞超微結(jié)構(gòu),與心肌細胞及心功能的恢復有關(guān)[18-20]。在PI3K-AKT信號通路及雌激素信號通路中,發(fā)現(xiàn)大量與本研究相關(guān)的基因蛋白靶點,尤其是核心基因蛋白靶點AKT1及ESR1占據(jù)信號通路中的重要部分,可見祛濕化痰方極有可能通過影響AKT1及ESR1信號通路的傳導來調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷干預(yù)冠心病的進展。

綜合分析本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),祛濕化痰方中存在柚皮苷、漢黃芩素等小分子化合物,通過分子對接技術(shù)證明,其可以穩(wěn)定結(jié)合ESR1、AKT1、MAPK1等基因受體,很有可能干預(yù)到雌激素信號通路及PI3K-AKT信號通路的傳導,起到調(diào)節(jié)細胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用,從而改善冠心病及其臨床癥狀。后續(xù)將繼續(xù)完善相關(guān)臨床試驗,進一步驗證祛濕化痰方治療冠心病的分子機制及生物通路機制,為臨床治療冠心病心絞痛提供新的選擇。