嬰幼兒配方乳粉中核苷酸含量檢測(cè)條件優(yōu)化研究

謝繼輝

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051）

核苷酸是由含氮雜環(huán)堿基、五碳糖和磷酸基團(tuán)組成的一類化合物。生物的遺傳信息存儲(chǔ)于DNA和RNA中，而核苷酸是DNA和RNA的合成前體。此外，核苷酸還具有代謝調(diào)節(jié)、組成輔酶、參與糖原和糖蛋白的合成過(guò)程。遺傳信息傳遞成功，對(duì)人類生命活動(dòng)極其重要。研究表明，喂養(yǎng)強(qiáng)化核苷酸配方奶粉的嬰幼兒在體重、身長(zhǎng)、頭圍、腸道耐受性等指標(biāo)上，與母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒數(shù)據(jù)更為接近。另有研究顯示核苷酸還具有降低腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)生率、提高免疫力、改善腸道微生態(tài)、改善嬰兒血脂組成、增強(qiáng)嬰幼兒對(duì)疫苗的反應(yīng)等功能。

由于核苷酸可在人體內(nèi)合成，對(duì)于成年人來(lái)說(shuō)無(wú)需專門補(bǔ)充核苷酸。但嬰幼兒身體生長(zhǎng)速度快，身體合成機(jī)能發(fā)育還不完善，故其體內(nèi)核苷酸的合成速度不能滿足其生長(zhǎng)的需求。目前，嬰幼兒配方奶粉多以牛乳、羊乳為原料制成。牛乳和羊乳中核苷酸的濃度和種類與人類母乳有明顯差異。母乳是嬰兒的最佳食物，含有較高濃度的核苷酸，為使嬰幼兒配方奶粉盡可能地接近母乳，需要在其中額外添加核苷酸。自1965年起，日本、歐盟、美國(guó)先后允許將核苷酸添加在嬰幼兒配方食品當(dāng)中。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880——2012）[1]規(guī)定，核苷酸作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，可被用于嬰幼兒配方食品，含量范圍為0.12～0.58 g·kg-1（以核苷酸總量計(jì)）。嬰幼兒乳粉中通常使用的核苷酸有5種，分別是胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）和腺嘌呤核苷酸（AMP）。目前在中國(guó)的市場(chǎng)上，半數(shù)以上的嬰幼兒配方奶粉的產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分表上都標(biāo)示添加了核苷酸。

由于嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量關(guān)乎下一代的健康成長(zhǎng)，我國(guó)市場(chǎng)監(jiān)管部門在每年的食品抽檢中對(duì)其非常重視，所抽檢的樣品要按照抽樣細(xì)則指定方法按營(yíng)養(yǎng)成分表逐項(xiàng)檢驗(yàn)。文獻(xiàn)報(bào)道的核苷酸檢測(cè)方法有離子色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法[3-5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6]等，但在近年的食品抽檢中，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸含量的測(cè)定指定的檢驗(yàn)方法是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40——2016）[7-9]。該方法的原理是用水提取樣品，調(diào)節(jié)pH值沉淀蛋白質(zhì)后，借助高效液相色譜儀檢測(cè)。然而，在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中，往往發(fā)現(xiàn)用該方法得出的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于實(shí)際值，其原因是色譜分析中有雜質(zhì)沒(méi)有被完全分離，導(dǎo)致檢出值偏高。故本研究主要考察影響分離效果的主要因素，以優(yōu)化此方法，使得檢驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP），上海安譜；質(zhì)控樣品：QCIP-714嬰兒配方乳粉中核苷酸定量分析質(zhì)控樣品，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；冰乙酸、磷酸氫二鉀，國(guó)藥；四丁基硫酸氫銨，MACKLIN。

高效液相色譜儀，島津LC-20AD，配二極管陣列檢測(cè)器SPD-M20A，工作站軟件LabSolutions；純水機(jī)，ELGA GLXXXDIM2；電子天平，METTLER TOLEDO XSE204；pH計(jì)，METTLER TOLEDO S220。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

①標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP各稱取10 mg，GMP和IMP各稱取5 mg，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為CMP、AMP、UMP各100 μg·mL-1；GMP、IMP各50 μg·mL-1。分別吸取此混合溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL，加超純水定容至50 mL，此為核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。②磷酸鹽緩沖液。稱取1.36 g磷酸二氫鉀，0.475 3 g四丁基硫酸氫銨，加入接近1 L的純水溶解，用磷酸氫二鉀溶液精細(xì)調(diào)節(jié)pH值至3.2，用水定容到1 000 mL。

1.2.2 樣品處理

稱取奶粉試樣5 g于錐形瓶中，加入20 mL溫水（50～60 ℃）充分溶解，冷卻至室溫后用醋酸溶液調(diào)試樣溶液至pH=4.1，移入50 mL容量瓶中，定容，濾紙過(guò)濾，所得濾液用0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）改變流動(dòng)相中有機(jī)相比例對(duì)分離效果的影響。取樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測(cè)，色譜條件依照1.2.4設(shè)置，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相pH值按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40——2016）規(guī)定調(diào)節(jié)至pH=3.20左右。僅改變流動(dòng)相中甲醇含量，分別以甲醇1%、3%、7%和10%的不同比例進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)工作站軟件LabSolutions計(jì)算目標(biāo)峰分離度。

（2）流動(dòng)相pH值對(duì)分離效果的影響。樣品乳粉按1.2.2處理后，使用液相色譜檢測(cè)，色譜條件依照1.2.4設(shè)置，僅改變流動(dòng)相中磷酸鹽緩沖液的pH值。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定配制磷酸鹽緩沖液，之后用磷酸和磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH值至2.9、3.0、3.1、3.2和3.3左右。流動(dòng)相中甲醇設(shè)置為4%。更換流動(dòng)相后充分平衡后再進(jìn)樣。

（3）不同色譜柱分離效果研究。樣品乳粉按1.2.2處理后，分別使用不同型號(hào)色譜柱，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值至2.9、3.0、3.1、3.2、3.3左右進(jìn)行檢測(cè)分析。尋找最佳分離條件。

1.2.4 色譜條件

流動(dòng)相水相：磷酸鹽緩沖液；流動(dòng)相有機(jī)相：甲醇；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 改變流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)分離效果的影響分析

一般來(lái)說(shuō)，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5，被認(rèn)為分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)中，使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)至3.241的情況下，UMP與GMP的分離效果不佳，即GMP的分離度明顯小于1.5。且改變流動(dòng)相中甲醇比例后，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰出峰時(shí)間變化基本同步，不能提高分離效果，見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相中不同甲醇含量下目標(biāo)峰分離度

2.2 流動(dòng)相pH值對(duì)分離效果的影響分析

由圖1可知，當(dāng)流動(dòng)相pH=3.126時(shí)，AMP與雜質(zhì)峰融合，不能分離，導(dǎo)致AMP檢出值偏高。圖2為流動(dòng)相pH=3.011時(shí)圖譜，可見(jiàn)AMP出峰時(shí)間提前，與雜質(zhì)峰分離。但GMP與IMP之間有一雜質(zhì)峰，對(duì)比圖1與圖2可發(fā)現(xiàn)，如pH值更低，該雜質(zhì)峰將與IMP融合，導(dǎo)致IMP檢出值偏高。反之，如pH值增加，該雜質(zhì)峰可能與GMP融合，也會(huì)導(dǎo)致檢出值偏高。其原因是當(dāng)pH值較高時(shí)，各核苷酸出峰時(shí)間均會(huì)延后，但延后程度各不相同，其中腺嘌呤核苷酸（AMP）出峰時(shí)間變化其他核苷酸更為明顯。利用這種規(guī)律可找到各核苷酸能夠正好分離的流動(dòng)相pH條件。

圖1 流動(dòng)相pH=3.126時(shí)色譜圖

圖2 流動(dòng)相pH=3.011時(shí)色譜圖

表2為使用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，在不同流動(dòng)相pH值下的質(zhì)控樣品回收率，此結(jié)果顯示最佳pH條件在3.0左右，而且pH值僅僅改變0.1都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，因流動(dòng)相pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，所以檢驗(yàn)前平衡色譜柱需要花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間。且流動(dòng)相在配制時(shí)需要特別注意，要待試劑溶解充分后再調(diào)節(jié)pH值。進(jìn)樣時(shí)要注意儀器的使用環(huán)境，避免晝夜溫差過(guò)大使流動(dòng)相pH值產(chǎn)生變化。

表2 不同pH值流動(dòng)相下質(zhì)控樣品回收率

2.3 色譜柱對(duì)分離效果的分析

使用不同色譜柱，在不同pH值流動(dòng)相條件下對(duì)同一樣品的分析結(jié)果顯示，不同色譜柱的分離效果有明顯不同，不同色譜柱對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相最佳pH值也不同。每種色譜柱表現(xiàn)最好的pH值和對(duì)應(yīng)回收率見(jiàn)表3。從結(jié)果看，一般常用色譜柱，如果找到合適的pH值（多在3.0左右），都可以把回收率控制在110%以內(nèi)，可以認(rèn)為滿足正常檢驗(yàn)需求。但不同色譜柱對(duì)本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相條件（低pH值、高水相、含表面活性劑）的耐受性不同，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些色譜柱表現(xiàn)不穩(wěn)定，運(yùn)行時(shí)間稍長(zhǎng)即出現(xiàn)出峰時(shí)間變化，分離度降低等現(xiàn)象。

表3 不同色譜柱的最佳pH值和回收率

3 結(jié)論與討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，嬰幼兒配方奶粉中核苷酸的分離中最大的影響因素是流動(dòng)相的pH值、其次是色譜柱的選擇以及兩者的匹配。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測(cè)定》（GB 5413.40——2016）標(biāo)準(zhǔn)中推薦的流動(dòng)相pH=3.20略高，檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)具體條件調(diào)低一些。同理，也可以把pH值調(diào)高，pH值調(diào)高后，AMP出峰時(shí)間相比其他4個(gè)核苷酸延后更明顯，也可以達(dá)到分離效果。但此條件下核苷酸出峰時(shí)間延后，色譜時(shí)間太長(zhǎng)。通常為縮短色譜時(shí)間，可采用梯度洗脫，但核苷酸對(duì)色譜條件極為敏感，即使采用梯度洗脫，還是需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的平衡時(shí)間，否則重現(xiàn)性不好。故綜合看來(lái)，低pH值分離最為合適。建議在首次開(kāi)展檢測(cè)時(shí)，對(duì)選定的色譜柱，從pH=2.9～3.0開(kāi)始摸索最適合的色譜條件。

本方法中流動(dòng)相含離子對(duì)試劑，流動(dòng)相pH值比較低，有機(jī)相含量也很低，這種條件對(duì)色譜柱傷害較大，使用幾次后，色譜柱柱效就會(huì)明顯下降，這也是分離效果差的一個(gè)常見(jiàn)原因。