鬼針草調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路改善急性肺損傷作用的分子機制研究

周加林，于淼，李偉，舒尊鵬，王毅

（1.北京市第六醫(yī)院中藥房，北京 100007；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

急性肺損傷（Acute lung injury,ALI）是嚴重的肺部炎性疾病之一，多種疾病均可引起ALI，嚴重的還可進一步發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征，從而導致機體出現(xiàn)低血壓、凝血功能異常、舒張性休克甚至死亡[1]。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為肺浸潤、低氧血癥和肺水腫等，具有高發(fā)病率、高病死率的特點[2]，對人類健康事業(yè)造成了不可忽視的威脅。因此尋找新的治療方案仍是目前急需解決的問題。近年來中醫(yī)藥展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢，尤其在新冠肺炎疫情中發(fā)揮了不可替代的作用，中醫(yī)藥治療ALI 成為潛在的可行方案。

鬼針草（Bidens bipinnataL.）是菊科植物鬼針草的全草，俗稱鬼釵草、婆婆針、黏身草等，始載于《本草拾遺》《中藥大辭典》中記載鬼針草“味苦，平，無毒”。鬼針草具有清熱解毒、散瘀活血等功效，可用于上呼吸道感染、感冒、炎癥等[3]。有研究表明鬼針草的主要活性物質(zhì)為黃酮類化合物[4]，黃酮是一類重要的含氧雜環(huán)天然有機化合物，具有抗炎、抗腫瘤、心腦血管保護等豐富的藥理活性[5]。鬼針草的抗炎作用主要體現(xiàn)在抑制炎癥早期的水腫和滲出，抑制炎癥晚期的組織增生和肉芽組織的形成[6]。目前，有研究表明鬼針草提取物可通過抑制TGF-β1/Smad3/Angptl4 信號通路，從而改善急性胰腺炎大鼠肺損傷[7]。然而，對于鬼針草治療內(nèi)毒素引起ALI 的研究相對較少，其作用機制尚未闡明。

本研究通過腹腔注射脂多糖（LPS）誘導ALI 小鼠模型，采用經(jīng)典藥效學方法確證鬼針草對ALI 具有改善作用，通過網(wǎng)絡藥理學技術(shù)預測鬼針草發(fā)揮改善ALI 作用的潛在藥效物質(zhì)基礎及作用機制，并通過分子生物學技術(shù)對潛在作用通路的關(guān)鍵靶點進行驗證。本研究采用網(wǎng)絡藥理學技術(shù)結(jié)合分子生物學技術(shù)探討鬼針草對ALI 的作用及機制，為鬼針草的進一步研究及開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

LPS，大腸桿菌055：B5，批號：L2880，購自美國Sigma-Aldrich 公司；IL-6、IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號分別為H007-1-2、H002-1-2、H052-1-2）、髓過氧化物酶（MPO）測試盒（批號：A044-1-1），購自南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol 試劑購自Life technologies 公司（批號：15596-018）；磷酸化的Akt兔抗購自affinity 公司（批號：AF6261）；HRP 標記山羊抗兔二抗（批號：GB23303）和組化試劑盒DAB 顯色劑（批號：G1212-200T）購自武漢塞維爾生物有限公司。

1.2 藥物配制

稱取鬼針草原藥材500 g，先進行剪碎，然后加入3 L 的蒸餾水浸泡2 h，再煎煮1.5 h。煎煮完成后用紗布進行過濾，得到第1次藥液；藥渣再加入1.5 L蒸餾水煎煮1.5 h，并用紗布進行過濾，得到第2次藥液。將兩次所得的藥液進行合并，旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)至含生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL的濃縮液。

1.3 腹腔注射LPS誘導的ALI小鼠模型的建立

選取體質(zhì)量為（22±2）g 的SPF 級雄性Balb/c 小鼠60只，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2018-0034。實驗期間，以《實驗動物管理條例》為準則進行動物實驗。本實驗經(jīng)廣東藥科大學實驗動物倫理委員會批準（批準號：gdpu‐lacspf2017692）。實驗環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±5）%，12 h 交替照明，動物自由飲水、進食，保持墊料干燥。按體質(zhì)量隨機分為6 組，每組10 只，分為空白對照組（Con）、LPS 模型組（M）、鬼針草低（2 g/kg）、中（4 g/kg）、高（8 g/kg）劑量組、地塞米松陽性藥組（Dex，5 mg/kg）。除空白組外，模型組和給藥組小鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）[8]，空白對照組腹腔注射相同體積的PBS緩沖液。造模12 h后，按相應給藥劑量組分別灌胃給藥治療5 d，每天1 次，其中空白對照組和模型組分別灌胃生理鹽水。第6天麻醉后，進行摘眼球取血。取完血后，頸部脫臼處死，然后摘取肺組織。

1.4 肺組織病理切片觀察

為評價肺組織的組織學變化，將組織用PBS 清洗3次，4%（φ）多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片4 μm，蘇木精伊紅（H&E）染色。光鏡下觀察肺組織病理變化。肺組織病理學評分細則[9]：以肺泡厚度、肺組織損傷及炎癥細胞浸潤為評價指標，0 分代表最小損傷、1 分代表輕度損傷、2 分代表中度損傷、3 分代表重度損傷、4 分代表最大損傷。肺損傷的嚴重程度根據(jù)3個指標之和來評價。

1.5 肺組織中MPO活性測定

按MPO 檢測試劑盒說明書對小鼠肺組織中的MPO 活性進行測定。在460 nm 處測量吸光度（A）值的變化來計算MPO活性，以此來評估其肺部細胞浸潤情況。

1.6 網(wǎng)絡藥理學分析

1.6.1 鬼針草化合物和ALI靶點的搜集 通過TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫以及中國知網(wǎng)，以鬼針草為關(guān)鍵詞對相關(guān)化合物進行查找，將以上數(shù)據(jù)庫中的活性成分通過口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 進行初步篩選，并結(jié)合相關(guān)研究與文獻內(nèi)容對成分進一步剔除或補錄，從而得到鬼針草的成分數(shù)據(jù)。將查找到的化合物導入到PubChem 數(shù)據(jù)庫中篩選相關(guān)靶點，并通過STP 數(shù)據(jù)庫導入化合物的結(jié)構(gòu)預測潛在作用靶點。在TTD（Therapeutic Target Database）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca）、GenGerd（http：//gen‐ecards.org/）等疾病數(shù)據(jù)庫中以ALI為關(guān)鍵詞檢索其疾病靶點。

1.6.2 交集靶點的篩選 將搜集到的ALI 疾病靶點和鬼針草藥物作用靶點輸入到VENNY2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）數(shù)據(jù)庫中進行映射，得到藥物與疾病的交集靶點及其韋恩圖。

1.6.3 PPI 網(wǎng)絡互作圖的制作 將得到的藥物與疾病交集靶點復制黏貼到STRING 數(shù)據(jù)庫中進行分析，得到的分析結(jié)果導入Cytoscape3.9.1 中利用“network analyze”功能進行分析得到介度值和中心度值等數(shù)據(jù)，通過Degree 值排序后，制作鬼針草治療ALI的PPI網(wǎng)絡互作圖。

1.6.4 鬼針草化學成分分析 將搜集到的鬼針草與疾病對應靶點的化合物按度值大小和化合物類型進行整理，并對排名靠前，與鬼針草治療ALI的密切相關(guān)的化合物進行分析，并通過Cytoscape3.9.1制作“成分—靶點—通路”復合網(wǎng)絡。

1.6.5 鬼針草化合物GO 分析與KEGG 分析 將鬼針草的化合物與疾病靶點的交集靶點集合導入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行GO 分析和KEGG 分析，再將分析結(jié)果整理后導入到微生信平臺得到GO 分析生物過程氣泡圖和KEGG分析通路氣泡圖。

1.7 細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的活性測定

取-80 ℃凍存的血清，按照ELISA 試劑盒說明書分別測定TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.8 肺組織中Akt mRNA表達量測定

采用實時熒光定量PCR 法（RT-qPCR）對小鼠肺組織中相關(guān)基因進行測定，用TRIzol 試劑說明書來分離和純化總RNA，用Takara 公司試劑盒除去基因組DNA 反應、按照PrimeScriptTMRT 試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行熒光定量PCR檢測。引物序列如表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.9 免疫組織化學分析

用免疫組織化學染色法檢測p-Akt 的表達水平。石蠟切片在封閉液（10%正常兔血清+5%脫脂奶粉+3%BSA+0.1%Triton X-100）中孵育10 min，然后加入一抗在4 ℃孵育過夜。用pH 7.4的PBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 抗體（1∶200）在室溫下孵育50 min。切片與二氨基聯(lián)苯胺在顯色底物上孵育，蘇木精反染。采用圖像分析技術(shù)，計數(shù)光學顯微鏡200×倍視野下陽性細胞數(shù)。隨機選擇5 個視野，取每視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)作為計數(shù)標準。

1.10 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均以表示。使用GraphPad Prism 8.0 軟件（GraphPad，CA，USA）進行圖形處理。采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鬼針草在體內(nèi)對LPS誘導的ALI的保護作用

為了探究鬼針草對ALI 的干預作用，本研究對肺組織病理切片進行觀察。結(jié)果如圖1A 所示，與空白對照組相比，模型組肺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞，出現(xiàn)肺泡間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚、肺泡內(nèi)大量炎癥性細胞浸潤等情況。鬼針草及陽性藥干預后能明顯減輕癥狀，其中鬼針草高劑量組效果最為明顯。肺組織病理學評分見圖1B，與空白對照組相比，模型組的病理學評分顯著升高（P＜0.05），鬼針草及陽性藥干預后，均出現(xiàn)顯著性回調(diào)（P＜0.05），鬼針草的改善作用呈劑量依賴性。與空白對照組相比，模型組肺組織中MPO 活性顯著增強（P＜0.05），鬼針草能夠抑制MPO 活性。上述結(jié)果說明鬼針草能夠改善ALI 小鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)，并抑制炎性浸潤。

圖1 鬼針草在體內(nèi)對LPS誘導的ALI的保護作用Figure 1 Protection of Bidens bipinnata L.on LPS-induced ALI in vivo(n=6)

2.2 鬼針草化合物及其靶點與疾病靶點映射分析及PPI網(wǎng)絡分析

通過中國知網(wǎng)和TCMSP、PubChem、STP 等數(shù)據(jù)庫查找到91 種化合物及其相關(guān)靶點582 個。并在Drugbank、OMIM 等疾病數(shù)據(jù)庫中搜查到659 個ALI 的相關(guān)靶點。將鬼針草對應的靶基因582 個與ALI 相關(guān)靶點659 個，進行韋恩圖繪制得到交集靶點115 個，即為鬼針草改善ALI 的關(guān)鍵靶點（結(jié)果如圖2A 所示）。通過運用STRING 數(shù)據(jù)庫，對獲得的115 個關(guān)鍵靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。通過自由度（Degree值）進行排名，自由度值越高，代表兩者之間關(guān)系越密切。結(jié)果如圖2B 所示，其中Degree 值前10 的靶點為TNF、IL-6、ALB、GAPDH、AKT1、VEGFA、STAT3、MAPK3、EGFR、CASP3。這些靶點可能在鬼針草改善ALI中起著重要作用。

圖2 鬼針草-ALI交集靶點映射及PPI分析結(jié)果Figure 2 Intersection target mapping and PPI analysis results of Bidens bipinnata L.and ALI

2.3 鬼針草改善ALI的潛在作用機制分析

將PPI 分析中115 個關(guān)鍵靶點進行了GO 分析，結(jié)果如圖3A 所示。在生物過程中，inflammatory response、negative regulation of apoptotic process、positive regulation of interleukin-8 production、response to hypoxia、positive regulation of smooth muscle cell proliferation 是顯著富集；在細胞成分組成中，plasma membrane、cytoplasm、membrane raft、macromolecular complex、cell surface 是顯著富集；而在分子功能方面，identical protein binding、enzyme binding、protein binding、protease binding、protein phosphatase binding 是顯著富集。上述結(jié)果提示鬼針草可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應、細胞凋亡等生物過程來發(fā)揮改善ALI的作用。

圖3 鬼針草改善ALI的GO分析及KEGG分析圖Figure 3 GO and KEGG analyses of Bidens bipinnata L.improving ALI

此外，將PPI 分析中115 個關(guān)鍵靶點，在DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路富集分析，選取其中密切程度前15 的通路進行分析。結(jié)果如圖3B 所示，HIF-1 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、VEGF signaling pathway、Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway等途徑是顯著富集。其中，經(jīng)過查閱相關(guān)的文獻，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號通路與ALI 密切相關(guān)，這提示鬼針草可能通過調(diào)節(jié)機體PI3K-Akt信號通路來改善ALI。

2.4 鬼針草主要活性成分分析

運用Cytoscape 軟件構(gòu)建鬼針草改善ALI 作用機制的“成分—靶點—通路”網(wǎng)絡，闡明鬼針草中的活性成分通過作用于關(guān)鍵靶蛋白從而調(diào)控信號通路，進而發(fā)揮改善ALI作用的體內(nèi)分子機制，該機制網(wǎng)絡如圖4 所示。鬼針草用于治療ALI 的化合物中，主要是黃酮類，其次為萜類和脂肪酸類。其中，黃酮類中與ALI 最密切的為木犀草素和槲皮素；萜類中多梗白菜菊素、芳樟醇（D）；脂肪酸類中以亞油酸最為密切。

圖4 鬼針草改善ALI作用機制的“成分—靶點—通路”網(wǎng)絡圖Figure 4 “Component-target-pathway”network diagram of Bidens bipinnata L.improving ALI

2.5 鬼針草可抑制ALI的炎癥反應

為了探究鬼針草對ALI 炎癥反應的改善作用，檢測了ALI 血清炎癥因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的活性，結(jié)果如圖5 所示。腹腔注射LPS 誘導ALI 血清中TNF-α，IL-1β和IL-6 的活性顯著上升，在鬼針草及陽性藥的干預下，均出現(xiàn)不同程度的回調(diào)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，其中鬼針草高劑量組的效果最佳。以上結(jié)果表明鬼針草可有效減輕ALI小鼠的肺部過度性炎癥反應，從而發(fā)揮改善ALI的作用。

圖5 鬼針草可抑制ALI的炎癥反應Figure 5 Inhibition of Bidens bipinnata L.in the inflammatory response of ALI(n=6)

2.6 PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵靶點驗證結(jié)果

在網(wǎng)絡藥理學的預測結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)PI3KAkt 信號通路是顯著富集。因此，采用RT-qPCR 及免疫組織化學的方法，對PI3K-Akt信號通路中關(guān)鍵靶點Akt 進行驗證，結(jié)果如圖6 所示。與空白對照組相比，模型組肺組織中Akt 的轉(zhuǎn)錄及表達顯著降低（P＜0.05）。在給予鬼針草干預后，肺組織中Akt的轉(zhuǎn)錄及表達顯著升高（P＜0.05）。提示鬼針草可能通過激活PI3K-Akt信號通路來改善ALI。

圖6 鬼針草對ALI小鼠肺組織Akt轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的影響Figure 6 Effect of Bidens bipinnata L.on Akt transcription and protein expression in lung tissue of ALI mice(n=6)

3 討論

ALI是一種以肺部炎癥和肺組織結(jié)構(gòu)破壞為病理特征的呼吸系統(tǒng)危重病[10]。現(xiàn)有研究表明，ALI以急性肺部“炎癥風暴”為主要病理特征，極易隨著病程發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，導致肺組織功能衰竭，致使病情加重危及生命[11]。目前用于治療ALI 的藥物其臨床表現(xiàn)均不夠理想，因而尋找安全有效的治療藥物仍為當今ALI研究領(lǐng)域的熱點。鬼針草作為傳統(tǒng)中草藥，已被證實具有顯著的抗炎作用[12]。然而，鬼針草改善ALI 的有效成分及其作用機制尚未闡明。

本研究結(jié)果表明鬼針草可改善ALI小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷，顯著抑制肺組織MPO 及血清TNF-α，IL-1β和IL-6的表達，從而緩解機體的炎癥反應。在石振國等[7]的研究中，鬼針草提取物可通過抑制肺組織MPO 活性及TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的表達，從而改善急性胰腺炎大鼠肺損傷，與本研究結(jié)果一致。

此外，網(wǎng)絡藥理學預測分析得到鬼針草改善ALI的主要活性成分可能為黃酮類化合物?，F(xiàn)有研究表明，鬼針草總黃酮可減少機體TNF-α，IL-6等炎癥因子產(chǎn)生，提高IL-10 的含量，從而抑制炎癥反應，減輕ALI[13]。在本研究中，網(wǎng)絡藥理學分析得出槲皮素和木犀草素與鬼針草改善ALI密切相關(guān)。其中槲皮素可抑制TNF-α、IL-8等炎癥因子過度釋放，減輕肺水腫病理改變，從而減輕ALI[14-15]。而木犀草素可降低肺組織中的IL-6 和TNF-α等炎性因子的水平，減輕肺組織病理損傷，從而緩解ALI[16]。根據(jù)PPI分析，TNF、IL-6、ALB、GAPDH、AKT1、VEGFA、STAT3、MAPK3、EGFR、CASP3 等為網(wǎng)絡中核心靶點，可能是鬼針草治療急性肺損傷的關(guān)鍵靶點。Akt為蛋白激酶，是PI3K 的下游受體，在細胞增殖、分化、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)錄等多種細胞過程中發(fā)揮重要作用[17]。此外，STAT3的激活在炎癥、細胞增殖、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫應答中具有關(guān)鍵作用[18]。

KEGG 分析結(jié)果得出PI3K-Akt 信號通路顯著富集?，F(xiàn)有研究表明PI3K-Akt 信號通路在肺炎癥細胞存活和氧化應激中發(fā)揮重要作用，其通過調(diào)控多個下游靶點干預線粒體功能障礙、調(diào)節(jié)細胞自噬、抑制細胞凋亡及緩解肺組織細胞氧化損傷及炎癥反應，從而治療ALI[19]。Akt 作為PI3K-Akt 信號通路一個關(guān)鍵靶點，其活性下調(diào)與細胞炎性反應密切相關(guān)，而Akt的激活可降低機體細胞氧化應激，并抑制炎癥因子的釋放[20]。本研究中，通過RT-qPCR及免疫組織化學方法對PI3K-Akt 信號通路關(guān)鍵靶點Akt 進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鬼針草可促進Akt 的轉(zhuǎn)錄及表達。因此，鬼針草可能通過促進Akt的表達，從而激活機體PI3K-Akt 信號通路，進而發(fā)揮改善ALI作用。

綜上所述，本研究通過藥效學方法確證了鬼針草對腹腔注射LPS 誘導ALI 具有改善作用，其可改善ALI小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷，顯著抑制肺組織MPO及血清TNF-α，IL-1β和IL-6 的表達，從而緩解機體的炎癥反應。網(wǎng)絡藥理學預測分析得出其發(fā)揮作用的潛在藥效物質(zhì)基礎可能為黃酮類化合物中的槲皮素和木犀草素。此外，鬼針草可促進肺組織Akt 的表達，從而激活機體PI3K-Akt 信號通路來發(fā)揮肺保護作用。這為鬼針草治療ALI提供了實驗依據(jù)，以便后續(xù)開展相關(guān)驗證研究。