HPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿丙戊酸濃度的不確定度評(píng)定

戴麗靜，楊燁，劉威楊，孫秀佳，溫領(lǐng)華，溫預(yù)關(guān)

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，廣東 廣州 510370；2.廣州醫(yī)大新藥創(chuàng)制有限公司，廣東 廣州 510700；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心/上海市重性精神病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

丙戊酸（valproate,VPA）是一種八碳分鏈羧酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可增加γ氨基丁酸（γ-aminobu‐tyric acid, GABA）水平，抑制GABA 轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶，并阻斷鈉、鉀和鈣通道等電壓門控離子通道，最初用于治療癲癇和偏頭痛，在精神病學(xué)中VPA 作為情緒穩(wěn)定劑用于治療雙相情感障礙[1]。VPA 在臨床上治療窗窄，個(gè)體差異大，血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)VPA 的臨床應(yīng)用具有重要意義。2017年，歐洲神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物精神病學(xué)協(xié)會(huì)（Arbeitsgemeinschaft für Neuropsychopharmakologie und Pharmakopsychiatrie,AGNP）發(fā)布的治療藥物監(jiān)測(cè)（Therapeutic Drug Monitoring,TDM）指南將丙戊酸TDM 作為一級(jí)推薦[2]。目前，關(guān)于測(cè)定人血中丙戊酸的方法主要有HPLC 法[3]、HPLC-MS/MS 法[4]、二維液相色譜（2D-LC）法[5]等，其中HPLC-MS/MS法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確分析，被廣泛應(yīng)用。中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assess‐ment, CNAS）17025、15189 認(rèn)證體系明確提出檢測(cè)方法的不確定度評(píng)估要求。不確定度指表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，表示由于測(cè)量誤差的存在而對(duì)被測(cè)量值不確定的程度，是反映測(cè)量結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可靠性的指標(biāo)[6]。

目前，報(bào)道測(cè)定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度評(píng)定方法的文獻(xiàn)較少。本研究建立一種簡(jiǎn)便快速的HPLC-MS/MS 法用于丙戊酸的血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究，從而指導(dǎo)臨床用藥，并根據(jù)不確定度相關(guān)指南規(guī)范[7-8]，參考文獻(xiàn)[9-11]分析HPLC-MS/MS 法測(cè)定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度以及對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260II-G6470A 液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent,USA）；Arium comfort 超純水儀（Sartorius,Germany）；QUINTIX65-1CN 電子天平（Sartorius, Germany）；VORTEX 3 漩渦混合器（德國(guó)IKA 公司）；Allegra X-15R 離心機(jī)（Backman coulter, USA）；Microfuge 16 離心機(jī)（Backman coulter, USA）；10、20、50、100、200 μL和1 mL移液器（Thermo Fisher,USA）。

1.2 試藥

丙戊酸鈉（C8H15NaO2，批號(hào)：100963-202205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；丙戊酸-d4（C8H12D4O2，批號(hào)：V-125，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，CDN isotopes）；丙戊酸鈉緩釋片（商品名：Depakine Chrono?，規(guī)格：500 mg/片，批號(hào)：CA756A，Sanofi Aventis France）；色譜級(jí)乙腈、甲醇、異丙醇（Thermo Fisher，USA）；LC-MS 級(jí)乙酸（上海麥克林生化科技公司）。

2 方法

2.1 測(cè)定條件

色譜條件：Agilent 1260II 高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為含0.02%乙酸的水溶液（A）-含0.02%乙酸的甲醇溶液（B）、梯度洗脫（0～1.00 min，10%B；1.01～4.00 min，60%B；4.01～5.10 min，95%B；5.11～7.00 min，10%B），流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為4 μL。

質(zhì)譜條件：Agilent G6470A 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，負(fù)離子掃描，MRM 檢測(cè)模式，ESI電離，干燥氣溫度為250 ℃，干燥氣流量為11 L/min，鞘氣溫度為300 ℃，鞘氣流量為11 L/min，掃描時(shí)間為250 ms，定性定量離子對(duì)為丙戊酸鈉143.0→143.0、丙戊酸-d4147→147。

2.2 溶液制備

2.2.1 丙戊酸儲(chǔ)備液與工作液的制備 精密稱定2 份丙戊酸鈉50.0 mg 于量瓶中，加入甲醇溶液溶解，配得質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的儲(chǔ)備液A、B，超聲混勻。吸取儲(chǔ)備液A 適量，用甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度分別為8、16、40、100、400、800、1 600、2 000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。吸取儲(chǔ)備液B 適量，用甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度分別為8、24、240、1 500、8 000 μg/mL 的定量下限（lower limit of quantitation,LLOQ）、低質(zhì)控濃度（low quality control concentration,LQC）、中質(zhì)控濃度（medium quality control concentration,MQC）、高質(zhì)控濃度（high quality control concentration,HQC）、稀釋質(zhì)控濃度（diluted quality controlconcentration,DQC）工作液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液與工作液的制備 取適量丙戊酸-d4，用甲醇配得最終質(zhì)量濃度約為1 000 μg/mL 的儲(chǔ)備液，超聲混勻。取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇定量稀釋成500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與質(zhì)控樣品的配制 精密吸取人空白混合血漿190 μL 于2.0 mL EP 管中，加入系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液10.0 μL，渦旋混勻30 s，配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、2、5、20、40、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品在每個(gè)分析批中新鮮配制。

精密吸取人空白混合血漿475 μL 于2.0 mL EP管中，加入系列質(zhì)控工作液25 μL，渦旋混勻30 s，配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、1.2、12、75、400 μg/mL 的質(zhì)控樣品。

2.2.4 血漿樣品預(yù)處理 采用甲醇蛋白沉淀法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，將樣品渦旋震蕩10 s，轉(zhuǎn)移100 μL 至1.5 mL EP 管內(nèi)，加入內(nèi)標(biāo)工作液400 μL，1 500 r/min條件振搖5 min充分混勻后，在3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液150 μL進(jìn)樣。

2.2.5 色譜圖采集與濃度計(jì)算 采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算，以丙戊酸與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)（W=1/x2）最小二乘法，以血漿中丙戊酸濃度（x）與峰面積比（y）進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=ax+b，其中a為斜率，b為截距。

2.2.6 不確定度來(lái)源 A 類評(píng)定為重復(fù)性測(cè)量，B 類評(píng)定為對(duì)照品稱量、對(duì)照品純度、溶液配制、含藥血漿配制、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和儀器測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 測(cè)量重復(fù)性（A類評(píng)定）

配制低、中、高質(zhì)量濃度的LQC、MQC、HQC 質(zhì)控樣品溶液3 批，每批平行配制6 份（m=3，n=6），測(cè)量結(jié)果見表1。

表1 樣品重復(fù)測(cè)量結(jié)果Table 1 The results of determination of Repeatability（n=6）

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算得出合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差：

式中：j為批次，k為每批樣品測(cè)定次數(shù)。

低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差均值公式為：

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

則丙戊酸低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為：ur( 1，L)=0.003 1，ur(1，M)=0.002 2，ur( 1，H)=0.000 2。

3.2 天平稱量（B類評(píng)定）

天平稱量引入的不確定度主要源于對(duì)照品稱量，采用精度為十萬(wàn)分之一的電子天平稱取丙戊酸鈉對(duì)照品，以天平自動(dòng)調(diào)零為一次扣皮。天平稱量引入的不確定度公式為：

式中：u（m）為重復(fù)性誤差，已在重復(fù)性試驗(yàn)中考察，故此處不考慮u（m）；u（Δ，zeroing）為自動(dòng)調(diào)零誤差；u（Δ，nonlinear）為天平非線性誤差；u（Δ，nonlinear）=a/k，a=a0，隨機(jī)變量半寬a=0.5e，天平分度e=0.01 mg，根據(jù)矩形分布，，則稱量對(duì)照品98.97 mg（按丙戊酸計(jì)）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為ur( 2 )=0.000 041。

3.3 對(duì)照品純度（B類評(píng)定）

3.4 溶液配制（B類評(píng)定）

溶液配制引入的不確定度主要源于量瓶及移液槍，配制過(guò)程中使用了5 mL 及10 mL 容量瓶（V）、2～20 μL（P1）、5～50 μL（P2）、10 ～100 μL（P3）、20～200 μL（P4）、100～1 000 μL（P5）移液槍，V、P2～P5的最大允差a分別為±2%、±0.6%、±2%、±1.5%、±1%，P1在10 μL 的相對(duì)最大允差為±1.2%，按三角形分布，。則容量瓶及移液槍的測(cè)量不確定度分別為：u（rV5mL）=0.001 633，ur（V10mL）=0.000 816，ur（P10μL）=0.000 245，u（rP2）=0.000 049，u（rP3）=0.000 082，u（rP4）=0.000 031，ur（P5）=0.000 004。

配制儲(chǔ)備液時(shí)使用了5 mL 容量瓶2 次、10 mL容量瓶2 次，配制工作液時(shí)使用了100 μL 移液槍1 次、200 μL 移液槍4 次、1 000 μL 移液槍23 次，計(jì)算溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.5 含藥血漿樣品配制（B類評(píng)定）

配制含藥血漿樣品過(guò)程中使用20 μL 移液槍吸取10 μL 1次、50 μL移液槍1次、200 μL移液槍1次、1 mL 移液槍吸取500 μL 1 次，P5在500 μL 的相對(duì)最大允差為±1%，計(jì)算含藥血漿樣品配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.6 提取回收率（B類評(píng)定）

取空白血漿95 μL，低、中、高濃度質(zhì)控工作液5 μL，渦旋混勻15 s，加入乙腈800 μL 提取，渦旋震蕩5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清測(cè)樣，得峰面積A1。另取空白血漿100 μL，加入乙腈800 μL，渦旋震蕩5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液700 μL，加入低、中、高濃度質(zhì)控工作液4 μL 和內(nèi)標(biāo)工作液16 μL，渦旋混勻1 min，3 500 r/min 離心5 min，取上清測(cè)樣，得峰面積A2，每個(gè)濃度平行配制6 份（n=6），計(jì)算提取回收率=A1/A2×100%。結(jié)果見表2。

表2 人血漿中丙戊酸及內(nèi)標(biāo)提取回收率Table 2 The extract recovery rate of analytes and internal standards for valproate in plasma

計(jì)算丙戊酸提取回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

計(jì)算內(nèi)標(biāo)提取回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ur(7，L) =0.020 8，ur(7，M) =0.007 5，ur(7，H) =0.008 8。

3.7 基質(zhì)效應(yīng)（B類評(píng)定）

取空白血漿100 μL，加入乙腈800 μL 提取，渦旋5 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液700 μL，加入低、中、高質(zhì)控工作液4 μL 和內(nèi)標(biāo)工作液16 μL，渦旋混勻1 min，3 500 r/min 離心5 min，取上清；用純水代替血漿重復(fù)以上操作，每個(gè)濃度平行配制6份，測(cè)定，獲得分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積和基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)。

計(jì)算丙戊酸基質(zhì)效應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合（B類評(píng)定）

配制8 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（n=8），每個(gè)濃度平行測(cè)定3次（m=3），共測(cè)定24次（N=24）。擬合3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定濃度值記為x（gg=1，2，3，...，n），峰面積比記為yk(k= 1，2，3，...，N)，斜率記為am，截距記為bm。結(jié)果見表3。

表3 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Fitting standard curve parameters

自相關(guān)方差公式為：

式中：為平均測(cè)定濃度，丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度的均值為=31025 ng/mL，

殘余標(biāo)準(zhǔn)差公式為：S=，

則Sxx=29 748 409 787.23，S=22.281 3。

測(cè)定低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定18 次（P=18），各QC 濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

式中：為斜率均值，為分析物與內(nèi)標(biāo)濃度比值的均值，低、中、高質(zhì)控樣品的濃度均值分別為=1 312.96 ng/mL，=13 083.42 ng/mL，=75 679.78 ng/mL，則低、中、高濃度質(zhì)控的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(9，L) ==0.124 8，ur(9，M) =0.012 5，ur(9，H) =0.002 2。

3.9 儀器測(cè)定（B類評(píng)定）

使用Agilent 1260II-G6470A 液質(zhì)聯(lián)用儀，高效液相色譜儀與三重四級(jí)桿的定量最大允差均為±1%，按均勻性分布，，則儀器測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.10 合成及擴(kuò)展不確定度

各分量相互獨(dú)立，根據(jù)不確定度傳播率法，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為：

則丙戊酸低、中、高質(zhì)控樣品的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為：Uc，r(L) =0.131 4，Uc，r(M)=0.022 5，Uc，r(H)=0.0184。合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為：Uc(L) =172.55，Uc(M) =294.86，Uc(H) =1 394.87。采用簡(jiǎn)易評(píng)定法，P=95%置信概率（k=2），則低、中、高質(zhì)控樣品的擴(kuò)展不確定度分別為：UL=k×Uc(L) =345.09，UM=589.73，UH=2 789.74。

3.11 測(cè)定結(jié)果表示

人血漿中丙戊酸低、中、高質(zhì)控樣品的測(cè)定結(jié)果可分別表示為（1 312.96±345.09）ng/mL，（13 083.42±589.73）ng/mL，（75 679.78±2 789.74）ng/mL。儀器測(cè)定、曲線擬合、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率是不確定度分量的主要來(lái)源，在低濃度時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度值最大，在中、高濃度時(shí)基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率引入的不確定度值最大，不確定度分量統(tǒng)計(jì)直方圖見圖1。

圖1 丙戊酸不確定度分量統(tǒng)計(jì)直方圖Figure 1 Statistical histogram of valproate uncertainty component

3.12 藥動(dòng)學(xué)

將本檢測(cè)方法應(yīng)用于24例中國(guó)健康受試者的藥動(dòng)學(xué)研究（研究經(jīng)過(guò)廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2022-044-01），受試者分為空腹組和餐后組，每組12例，分別空腹或餐后單次口服丙戊酸鈉緩釋片500 mg。于給藥前0 h，給藥后0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72 h 采集靜脈血，并用本法測(cè)定其濃度。采用Phoenix WinNonlin（8.1版本）軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，餐后給藥的Cmax為（25 634.42±4 861.452）ng/mL，AUC0-t為（834 372.7±188 164.1）ng/mL，AUC0－∞為（899 645.4±244 079.5）ng/mL，與文獻(xiàn)[12]相似，食物對(duì)丙戊酸的吸收具有滯后作用。24例受試者的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 24例中國(guó)健康受試者空腹或餐后口服丙戊酸鈉緩釋片500 mg后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖Figure 2 The average plasma concentration-curve of valproate after oral administration of 500 mg of sustained release tablets on an empty stomach or after meals in 24 cases(±s,n=24)

4 討論

本文采用HPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中丙戊酸濃度，采用甲醇蛋白沉淀法，氘代內(nèi)標(biāo)校正，方法簡(jiǎn)便且干擾少，提取回收率在98.01%～105.65%之間，RSD為5.82%，相比文獻(xiàn)[13-15]具有更高的提取回收率；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)在100.84%～104.26%之間，說(shuō)明方法受基質(zhì)效應(yīng)影響?。慌鷥?nèi)、批間平均準(zhǔn)確度偏差在-0.29%～6.39%之間，比文獻(xiàn)[14-15]的低。

由于樣品及溶液均為混合均勻的液體，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度嚴(yán)格控制于一定范圍內(nèi)，故本研究未考慮溶液均勻性與溫度的不確定度考量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，儀器測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率是不確定度分量的主要來(lái)源，低質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合與提取回收中引入的不確定度值較中、高質(zhì)量濃度高，與文獻(xiàn)[16-18]結(jié)論一致。臨床治療中，丙戊酸鈉存在治療窗窄、個(gè)體差異大等問(wèn)題，故一般設(shè)置較寬的線性范圍，提高LLQC 響應(yīng)、增加總測(cè)定次數(shù)、設(shè)置合適的濃度點(diǎn)數(shù)和權(quán)重系數(shù)以及合理的線性范圍可改善標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對(duì)低質(zhì)控樣品不確定度的影響?；|(zhì)效應(yīng)對(duì)低、中、高質(zhì)控樣品不確定度影響均等，改進(jìn)前處理方法、優(yōu)化色譜分離條件等是降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率的有效措施。含藥血清配制、對(duì)照品稱量與重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度值較低，這可能是因?yàn)橐埔浩魇褂么螖?shù)少，天平精度較高。

本研究評(píng)定了HPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中丙戊酸濃度的不確定度，方法精密度高、準(zhǔn)確度好，適用于人血漿中丙戊酸的藥動(dòng)學(xué)應(yīng)用及血藥濃度監(jiān)測(cè)。設(shè)定合理的線性范圍和權(quán)重因子、優(yōu)化提取方式和色譜條件等是提高測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的有效方法。

（利益沖突聲明：所有作者聲明無(wú)利益沖突）