氣相色譜法測定咖啡生豆中硫丹及硫丹硫酸酯殘留

蒲泓君，鄧洪燕，滿紅平

（1.普洱市質(zhì)量技術綜合檢測中心，云南普洱 665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱 665000）

作為世界三大飲料之一的咖啡，因兼具消食去膩、提神醒腦、促進消化和獨特的保健功能等作用而深受人們的青睞[1]。隨著人們生活水平的提高和咖啡受眾范圍的擴大，咖啡的質(zhì)量安全問題也受到了日趨廣泛的關注。影響咖啡質(zhì)量安全的因素主要有空氣土壤、農(nóng)藥化肥、蟲害、流通加工等[2]，其中農(nóng)藥殘留是人們最為關注的因素之一。硫丹（Endosulfan，ES），于1956 年由赫司特公司開發(fā)[3]，化學名稱為1,2,3,4,7,7-六氯雙環(huán)[2,2,1]庚烯-(2)-雙羥甲基-5,6-亞硫酸酯，包括α-硫丹和β-硫丹，其代謝物主要為硫丹硫酸酯，該物質(zhì)不易降解且容易轉(zhuǎn)移至環(huán)境中，屬于持久性有機污染物[4]。硫丹是一種高效廣譜的高毒有機氯殺蟲劑（Organo Chlorine Pesticides，OCPs）[5]，具有殺蟲速度快、持效期長、對天敵和益蟲友好等特點[6]，目前主要在咖啡、煙草和棉花等作物上施用。常規(guī)生產(chǎn)中多采用化學防治——噴施農(nóng)藥的手段進行病蟲害防治，從而致使咖啡中存在農(nóng)藥殘留的可能[7]。研究結果表明，殺蟲劑硫丹是一種穩(wěn)定的有機氯化合物，進入環(huán)境后降解周期長，毒性大，具有較高的持久性[8-12]，同時在水生和陸生生態(tài)系統(tǒng)中具有生物累計性[13-15]。由于高毒、生物蓄積性、環(huán)境污染的持久性和遠距離環(huán)境遷移能力，其對生態(tài)環(huán)境的影響和對人類生命健康的危害日益引起世界各地區(qū)的廣泛關注，《斯德哥爾摩公約》明確規(guī)定：禁止在全球范圍制造和使用硫丹及其代謝物農(nóng)藥[16]。因此為防止硫丹及其代謝物在生物及環(huán)境中的殘留對人類帶來的危害，建立其檢測方法具有重要意義。本文主要采用氣相色譜檢測生咖啡豆中硫丹及其代謝物殘留，通過系列方法驗證手段驗證所建立方法對生咖啡豆基質(zhì)檢測的可行性，以期為生咖啡豆中硫丹及其代謝物測定提供準確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯：天津阿爾塔科技有限公司；正己烷、丙酮（色譜純）：JT. Baker；乙腈（分析純）：西隴科學；硫酸鎂、氯化鈉：天津風船化學試劑有限公司；EMR-Lipd 除脂分散凈化管：安捷倫科技有限公司；弗羅里硅小柱：博納艾杰爾科技有限公司。

生咖啡豆，市售有機咖啡，購于愛伲莊園，品種為卡蒂姆。

1.2 儀器與設備

色譜柱（HP-5ms，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；氣相色譜儀（GC-2010Pius，配電子捕獲檢測器）：日本島津有限公司；分析天平（BT25S）：Sartorius 股份公司；渦旋混合器（IKA-MS3）：德國IKA 有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215）：布奇實驗室設備有限公司；離心機（3015）：德國Sigma 公司；氮吹儀：美國Organomation。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準工作液的配制

分別準確移取濃度為100 μg·mL-1α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯1 mL 至10 mL 比色管中，以正己烷溶解并定容至10 mL 配制濃度為10 μg·mL-1的混合標準儲備液；移取0.25 mL 混合標準儲備液，用正己烷溶解并定容至5 mL 配制濃度為0.5 μg·mL-1的標準中間液。分別吸取標準使用液20 μL、40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL 于已凈化的咖啡生豆基質(zhì)中用正己烷定容至1 mL，渦旋混勻，基質(zhì)標準工作液系列濃度為0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1。

1.3.2 儀器條件

檢測器：電子捕獲檢測器；載氣：高純氮氣，恒壓模式；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：320 ℃；進樣體積：1 μL，不分流；電流保持：1.0 nA。程序升溫：150 ℃保持2 min，以80 ℃·min-1升至210 ℃，以5 ℃·min-1升至250 ℃保持15 min，再以10 ℃·min-1升至300 ℃，保持20 min。

1.3.3 樣品制備

生咖啡豆樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過0.25 mm 篩，篩網(wǎng)上的繼續(xù)粉碎，直至所有的樣品都已過篩，制備均勻的樣品。

1.3.4 樣品處理

（1）提取。準確稱取5 g 試樣于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈，渦旋混勻，放置過夜，振搖30 min，4 200 r·min-1離心5 min。準確從離心管中吸取7 mL 上清液于15 mL EMR-Lipd 除脂分散凈化管中，加入3 mL 水，渦旋混勻，4 200 r·min-1離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入1.6 g 硫酸鎂和0.4 g 氯化鈉，渦旋混勻，4 200 r·min-1離心5 min，吸取5 mL 上清液至10 mL試管中，在水浴條件下氮吹凈干，2 mL 正己烷溶解待測定。

（2）凈化。將弗羅里硅小柱放在固定架上，依次用5 mL 丙酮+正己烷（10+90）、5 mL 正己烷預淋洗小柱。當溶劑液面達柱吸附層表面時，立即倒入凈化液，用試管接收洗脫液，用2 mL 正己烷沖洗試管后淋洗弗羅里硅小柱，并重復一次。再加入10 mL丙酮+正己烷（10+90）淋洗弗羅里硅小柱，將淋洗液置于氮吹儀上濃縮至近干，用1.00 mL 正己烷定容，裝入樣品瓶中采用氣相色譜檢測。

1.3.5 樣品測定

取經(jīng)1.3.4 處理的樣品溶液，采用1.3.2 儀器條件測定，通過保留時間定性，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 凈化方法的優(yōu)化

生咖啡豆較其他基質(zhì)樣品含有較高的植物油脂，實驗分別采用艾杰爾C18固相萃取柱、QuEChERS 除脂凈化包凈化提取液，最終濃縮凈干時發(fā)現(xiàn)試管底部仍殘留大量油脂，檢測時干擾較強、回收率偏低，且對設備造成一定程度的污染。前處理中為有效去除油脂，本實驗采取增強型除脂凈化包結合弗羅里硅小柱除去提取液中的植物性油脂，實驗證明其除脂效果較為理想，待測液清亮透明，且目標分析物回收率均大于80%。

2.1.2 基質(zhì)效應及基質(zhì)標線的選擇

標準曲線作為定量分析中的參照，其準確與否直接影響定量結果的準確性，標準曲線的準確包括濃度的準確和方法的匹配性，其中標準溶液與方法的匹配性主要由基質(zhì)及前處理造成，目前主要通過基質(zhì)因子（Matrax Factor，MF）評價，基質(zhì)因子的計算公式為基質(zhì)因子（MF）=基質(zhì)目標物存在時的峰響應/基質(zhì)目標物不存在時的峰響應。通過實驗計算目標分析物在0.5 mg·L-1濃度下的基質(zhì)因子，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的基質(zhì)因子分別為2.4、3.4 和3.6，在該方法中均表現(xiàn)為基質(zhì)增強，為補償基質(zhì)效應確保定量的準確性，實驗采用基質(zhì)標準曲線定量，即將空白基質(zhì)樣品凈化濃縮后作為背景配制標準曲線。

2.2 色譜圖

在1.3.2 儀器條件下，3 種農(nóng)藥的空白基質(zhì)氣相色譜圖和基質(zhì)標準品色譜圖見圖1。由圖可見，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯在色譜圖上的分離較好，分離度均大于1.5，滿足色譜定量分析的要求。

圖1 硫丹及其代謝物氣相色譜分離圖

2.3 線性方程與檢出限

在1.3.2 儀器工作條件下對3 種農(nóng)藥標準曲線進行測定，以峰面積A對濃度C作圖，繪制標準工作曲線。在生咖啡空白基質(zhì)中分別加入0.1 mg·kg-1的硫丹及其代謝物，按1.3.4 方法凈化處理后測定，以3 倍信噪比計算為該方法的檢出限。3 種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限見表1。

表1 線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限

由表1 可知，3 種農(nóng)藥在0.01 ～0.50 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.995，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的檢出限分別為0.004 4 mg·kg-1、0.004 2 mg·kg-1、0.002 2 mg·kg-1，測定下限為0.01 ～0.02 mg·kg-1。

2.4 正確度與精密度

在生咖啡空白基質(zhì)中分別加入0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-13 種農(nóng)藥，靜置30 min 后提取凈化并測定，每個水平加標分別做6 個平行，計算回收率和精密度，結果見表2。

通過表2 可以看出，在咖啡生豆基質(zhì)中，3 種農(nóng)藥加標回收率為80.1%～94.1%，相對標準偏差為2.4%～9.1%，滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中準確度和精密度的要求，該方法可以用于測定生咖啡豆中硫丹及其代謝物。

3 結論

本文選取乙腈作為提取試劑、15 mL EMR-Lipd除脂分散凈化管作為除脂試劑建立了一種氣相色譜檢測咖啡豆中有機氯農(nóng)藥殘留的方法，數(shù)據(jù)表明該方法提取、除脂效果好，分離度高，適用于脂肪含量高的物質(zhì)。該法操作簡單，準確度、靈敏度高，可以作為實驗室同時檢測咖啡豆中硫丹及其代謝物的方法。