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    不同產(chǎn)地天麻HPLC指紋圖譜、含量測(cè)定及化學(xué)模式識(shí)別研究

    2023-06-07 06:40:12王夏茵岳寶森張煒華田歡楊帥王巧玲李愛婷職媛趙鋒西安市中醫(yī)醫(yī)院西安710000
    中南藥學(xué) 2023年5期
    關(guān)鍵詞:號(hào)峰巴利天麻

    王夏茵,岳寶森,張煒華,田歡,楊帥,王巧玲,李愛婷,職媛,趙鋒(西安市中醫(yī)醫(yī)院,西安 710000)

    天麻,又名赤箭,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2],為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖[3],是藥食兩用、名貴中藥材[4]。隨著人工栽培技術(shù)的發(fā)展,天麻在我國多個(gè)省份均有分布,但不同產(chǎn)地之間氣候條件、品種基原及加工方式的不同導(dǎo)致其存在質(zhì)量差異。為了保證天麻藥材成分及療效的穩(wěn)定性,對(duì)不同產(chǎn)地天麻的質(zhì)量進(jìn)行控制顯得尤為重要。

    目前,指紋圖譜被廣泛用于天麻的質(zhì)量控制[5-7],化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可對(duì)指紋圖譜信息進(jìn)行數(shù)字化識(shí)別與處理,進(jìn)一步評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量[8-9]。研究者前期通過2020年版《中國藥典》中指紋圖譜方法,對(duì)來自7個(gè)主要產(chǎn)地的21批天麻樣品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該方法下湖南、湖北天麻色譜峰分離度較差。湖南地區(qū)是我國天麻主要產(chǎn)區(qū)之一[10-11],研究者查閱資料發(fā)現(xiàn)湖南天麻少見報(bào)道。本研究通過HPLC建立不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜,測(cè)定天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量,并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)包括湖南、湖北天麻在內(nèi)的7個(gè)主要產(chǎn)地21批天麻樣品進(jìn)行分析,為天麻質(zhì)量控制及綜合評(píng)價(jià)提供參考。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    TDZ5-BP臺(tái)式高速離心機(jī)(陜西德祥實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);ZA305AS電子天平(十萬分之一天平,上海贊維衡器有限公司);LC-20A高效液相色譜儀(配置Lab Solutions色譜工作站,日本島津公司);CQ-150A-DST超聲波清洗機(jī)(上海躍進(jìn)儀器廠)。

    1.2 試藥

    對(duì)照品天麻素(批號(hào):110807-202010,含量:95.5%)、對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào):111970-201702,含量:99.4%)(中國食品藥品檢定研究院);對(duì)照品巴利森苷A(批號(hào):03F-RTY-12-0,含量:98.65%)、巴利森苷B(批號(hào):19J-PGH-22-1,含量:99.49%)、巴利森苷C(批號(hào):19J-GTR-19-2,含量:97%)、巴利森苷E(批號(hào):19J-FTR-20-1,含量:97%)(Panphy Chemicals Corporation);乙腈為色譜純(Grace Chemical Technology Co.,Ltd.);21批天麻藥材經(jīng)西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科岳寶森主任鑒定,為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖,藥材來源具體信息見表1。

    表1 天麻藥材來源信息Tab 1 Source information of Gastrodia elata Bl.

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Inertsustain C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),梯度洗脫(0~15 min,2%~5%A;15~25 min,5%~12%A;25~45 min,12%~18%A;45~60 min,18%~25%A;60~62 min,25%~95%A);流速1 mL·min-1;進(jìn)樣量3 μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

    2.2 不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜的建立

    2.2.1 供試品溶液制備 精密稱定天麻藥材粉末(過3號(hào)篩)約1 g,置于具塞錐形瓶中,加入50%甲醇25 mL,稱定重量,超聲30 min,放涼后,50%甲醇補(bǔ)足減失重量,離心,上清液過0.22 μm微孔濾膜,即得。

    2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量,加50%甲醇配制成含巴利森苷C 0.88 mg·mL-1、天麻素 1.98 mg·mL-1、巴利森苷A 1.80 mg·mL-1、對(duì)羥基苯甲醇 1.70 mg·mL-1、巴利森苷E 1.76 mg·mL-1、巴利森苷B 2.04 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

    2.2.3 精密度試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,以天麻素為參照峰,其余5個(gè)共有特征峰(8、11、13、14、16號(hào)峰)相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.11%~0.26%,相對(duì)峰面積RSD值為0.74%~2.8%,表明儀器精密度良好。

    2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液,分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣,以天麻素為參照峰,其余5個(gè)共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.13%~0.33%,相對(duì)峰面積RSD值為0.29%~3.2%,表明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

    2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備S9號(hào)供試品溶液6份,進(jìn)樣分析,以天麻素為參照峰,其余5個(gè)共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.19%~0.30%,相對(duì)峰面積RSD值為0.76%~3.5%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.2.6 指紋圖譜建立及分析 取21批天麻樣品,按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)進(jìn)行分析,以S9為參照,設(shè)時(shí)間窗寬度0.5 min,采用中位數(shù)法計(jì)算,生成對(duì)照指紋圖譜,選定16個(gè)共有峰進(jìn)行多點(diǎn)校正,自動(dòng)匹配后得到21批天麻樣品指紋圖譜疊加圖,見圖1[12-14]。相似度評(píng)價(jià)作為中藥指紋圖譜的重要評(píng)價(jià)手段,可反映多個(gè)樣本間化學(xué)成分差異及離散程度[15-16],通過相似度分析,得出21批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.758~0.995,見表2,說明不同批次天麻存在一定差異[14]。

    圖1 不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜疊加圖Fig 1 Fingerprint chromatograms of Gastrodia elata Bl. from different regions

    表2 不同產(chǎn)地天麻相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity of Gastrodia elata Bl. from different regions

    通過對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)其中6個(gè)特征峰,分別為7號(hào)峰(天麻素)、8號(hào)峰(對(duì)羥基苯甲醇)、11號(hào)峰(巴利森苷E)、13號(hào)峰(巴利森苷B)、14號(hào)峰(巴利森苷C)、16號(hào)峰(巴利森苷A),見圖2。

    圖2 混合對(duì)照品(A)與天麻樣品(B)的色譜圖Fig 2 Chromatogram of mixed reference substances(A)and Gastrodia elata Bl.(B)

    2.3 不同產(chǎn)地天麻中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定

    2.3.1 供試品溶液制備 同“2.2.1”項(xiàng)下方法操作。

    2.3.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱定天麻素12 mg、對(duì)羥基苯甲醇6 mg置于10 mL量瓶中,加入50%甲醇充分溶解定容,得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加50%甲醇配制成含天麻素24、72、120、240、360、720 μg·mL-1,對(duì)羥基苯甲醇6、24、48、60、120、240 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

    2.3.3 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)建立回歸方程,結(jié)果天麻素的回歸方程為Y=5.639×103X-2.151×104(r=0.9990),對(duì)羥基苯甲醇的回歸方程為Y=1.300×104X-3.492×104(r=0.9989)。

    2.3.4 精密度試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為0.63%和3.1%,表明儀器精密度良好。

    2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液,分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣,天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為1.0%和3.5%,表明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

    2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備S9號(hào)供試品溶液6份,進(jìn)樣分析,天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為2.0%和4.3%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定S9號(hào)樣品約1 g,分別按已知含量的80%、100%、120%加入天麻素4.5、5.5、7.0 mg,對(duì)羥基苯甲醇儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 mL,按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果天麻素和對(duì)羥基苯甲醇加樣回收率分別在103.81%~104.59%和100.84%~104.42%,RSD值分別在0.96%~3.9%和1.0%~4.0%,表明此方法準(zhǔn)確可行。

    2.3.8 含量測(cè)定 取S1~S21號(hào)樣品,按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各2份,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見表3。

    表3 不同產(chǎn)地天麻的含量測(cè)定(n=2,%)Tab 3 Content of Gastrodia elata Bl. from different regions (n=2,%)

    2.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

    2.4.1 聚類分析(CA) 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0分析軟件進(jìn)行CA分析[17]。當(dāng)分類距離為15時(shí),可將21批天麻樣品歸為兩類,其中湖南、湖北天麻(S16~S21)歸為一類,其他產(chǎn)地天麻(S1~S15)歸為一類,結(jié)果見圖3。

    圖3 不同產(chǎn)地天麻CA結(jié)果Fig 3 Cluster analysis of Gastrodia elata Bl. from different regions

    2.4.2 主成分分析(PCA) 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入軟件SIMCA14.1中,建立PCA模型,累計(jì)貢獻(xiàn)率R2X=0.593,表明模型可較好解釋原始變量,得分見圖4[17]。結(jié)果顯示21批天麻樣品基本分為兩類,與CA結(jié)果一致。

    圖4 不同產(chǎn)地天麻PCA得分圖Fig 4 PCA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions

    2.4.3 偏最小二乘法分析(OPLS-DA) 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入軟件SIMCA14.1中,建立OPLS-DA模型[18],模型解釋率參數(shù)R2X=0.534,R2Y=0.924,模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2=0.826,表明模型解釋與預(yù)測(cè)能力良好,OPLS-DA模型結(jié)果與CA、PCA結(jié)果一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了分析結(jié)果的可靠性,見圖5。提取16個(gè)共有峰變量重要性投影(VIP)值并進(jìn)行排序,見圖6,結(jié)果顯示峰6、16(PA)、13(PB)、14(PC)、11(PE)、1、7(天麻素)、12的VIP值均>1,表示這8個(gè)成分可作為評(píng)價(jià)湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的差異性標(biāo)記成分[19]。

    圖5 不同產(chǎn)地天麻OPLS-DA得分圖Fig 5 OPLS-DA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions

    圖6 不同產(chǎn)地天麻差異標(biāo)志物VIP圖Fig 6 VIP diagram of Gastrodia elata Bl. from different regions

    3 討論

    3.1 方法學(xué)的優(yōu)化

    對(duì)提取溶劑(50%甲醇、50%乙醇、60%甲醇、60%乙醇)、提取時(shí)間(15、30、45 min)、檢測(cè)波長(zhǎng)(220、254、270 nm)及流動(dòng)相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸)進(jìn)行考察,以分離度、共有峰面積、峰形及提取效率為考察指標(biāo),最終確定本文提取條件(以50%甲醇為溶劑,超聲提取30 min)及色譜條件(波長(zhǎng)220 nm下,以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相)。

    3.2 指紋圖譜的建立與分析

    前期試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),湖南、湖北地區(qū)天麻6號(hào)峰面積較大,使用藥典方法無法有效分離6號(hào)峰和7號(hào)峰(天麻素)。本研究建立了天麻HPLC指紋圖譜,對(duì)包括湖南、湖北在內(nèi)的7個(gè)主要產(chǎn)地21批天麻樣品分離度良好,標(biāo)定16個(gè)共有指紋峰,并指認(rèn)了其中6個(gè)成分。通過相似度分析,21批天麻樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.758~0.995,其中云南、貴州、陜西、安徽、四川產(chǎn)天麻與對(duì)照指紋圖譜相似度較高(0.947~0.995),湖南、湖北產(chǎn)天麻與對(duì)照指紋圖譜相似度較低(0.758~0.917)。

    3.3 含量測(cè)定的分析

    2020年版《中國藥典》以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總量對(duì)天麻進(jìn)行含量測(cè)定,本研究中21批樣品中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇總量為0.21%~0.80%,其中云南、貴州地區(qū)天麻不同批次間穩(wěn)定性好、總含量高,分別為0.58%、0.62%,湖南、湖北地區(qū)總含量較其他產(chǎn)地偏低,分別為0.24%、0.33%。

    3.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

    通過CA、PCA可將21批天麻分為湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻兩類。通過OPLS-DA篩選出8個(gè)差異標(biāo)記物,包含天麻素(6號(hào)峰)、巴利森苷類成分(16號(hào)峰巴利森苷A、13號(hào)峰巴利森苷B、14號(hào)峰巴利森苷C、11號(hào)峰巴利森苷E)及3個(gè)未知成分(6、1、12號(hào)峰)。天麻素和巴利森苷類成分是天麻的主要活性成分,受地域環(huán)境、種植技術(shù)等多因素影響,2020年版《中國藥典》新增天麻素和巴利森苷類成分建立指紋圖譜對(duì)天麻進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究發(fā)現(xiàn),天麻素和巴利森苷類成分可用于區(qū)分湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的差異,是天麻重要質(zhì)控成分。查閱文獻(xiàn),關(guān)于湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的綜合評(píng)價(jià)少見報(bào)道,包永睿等[20]通過CA將10個(gè)不同產(chǎn)地天麻分為三類,區(qū)別于貴州、安徽等地,湖北、四川天麻歸為一類;林昕等[5]將12個(gè)不同產(chǎn)地天麻分為三類,區(qū)別于陜西、貴州等地,湖北、西藏和遼寧歸為一類,與本研究結(jié)果一致??紤]到本研究納入單個(gè)產(chǎn)地樣本量較少,僅3個(gè)批次,故通過本研究可認(rèn)為湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻可能存在一定差異,但后期仍需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

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