一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定丹參配方顆粒中7個(gè)酚酸類成分

鄺敏，嚴(yán)玉晶，林嘉明，汪梅，黃醒鵬，李玲，張正（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，性微寒，味苦，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。臨床上常用于胸痹心痛、膠腹脅痛、癥痕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛[1]。丹參含有二萜類、三萜類、酚酸類、黃酮類及生物堿類等化合物，其中脂溶性二萜類與水溶性酚酸類化合物是丹參的主要活性成分[2]?，F(xiàn)代研究表明，酚酸類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌細(xì)胞和抗胃潰瘍等藥理作用[3-8]。

丹參配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的丹參飲片經(jīng)現(xiàn)代工業(yè)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的中藥產(chǎn)品；其性味、歸經(jīng)、功效與丹參飲片一致，不含糖、防腐劑和其他賦形劑。用其代替丹參飲片供臨床配方使用，既保持了丹參飲片的藥性藥效，又具有免煎煮、易于調(diào)劑、方便服用等優(yōu)點(diǎn)。中藥有效成分復(fù)雜多樣，單一指標(biāo)成分評(píng)價(jià)難以準(zhǔn)確反映中藥內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的局限性。而多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式需要的對(duì)照品種類繁多，且部分對(duì)照品存在難分離、造價(jià)高、穩(wěn)定性差等問(wèn)題。王智民等[9]提出的一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS）法是利用一種相對(duì)易得、廉價(jià)的對(duì)照品作為內(nèi)參物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)同類型化合物含量測(cè)定的多指標(biāo)質(zhì)量控制方法。該方法克服了對(duì)照品緊缺、檢測(cè)成本高等困難，適合中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)檢測(cè)。丹參配方顆粒作為中藥新劑型在現(xiàn)代臨床被廣泛使用，但目前針對(duì)丹參配方顆粒整體質(zhì)量控制的研究較少。因此，本試驗(yàn)采用QASM法同時(shí)測(cè)定丹參配方顆粒中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的含量，以期為提高丹參配方顆粒整體質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Arc型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Agilent 1290型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；XP26型百萬(wàn)分之一天平、ME204E型萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品原兒茶醛（批號(hào)：110810-201909，純度：99.6%）、咖啡酸（批號(hào)：110885-201703，純度：99.7%）、迷迭香酸（批號(hào)：111871-202007，純度：98.1%）、丹酚酸B（批號(hào)：111562-201917，純度：96.6%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；丹參素（批號(hào)：DSTDD001501，純度：98.79%，成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司）；紫草酸（批號(hào)：wkq21031202，純度：99.31%，四川省維克奇生物科技有限公司）；丹酚酸E（批號(hào)：040169-202203，純度：97.75%，上海鴻永生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck股份有限公司）；磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。12批丹參配方顆粒（編號(hào)：DS-1～DS-12）均由廣東一方制藥有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～20%A；15～40 min，20%～25%A；40～50 min，25%～30%A；50～51 min，30%～10%A；51～56 min，10%A）；流速：1.2 mL·min－1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為50.699、10.558、2.161、11.300、19.777、20.100、108.540 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取丹參配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，稱重，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，取出，放冷，再稱重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液（編號(hào)DS-2），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of specific test

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1?？芍?個(gè)成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 7個(gè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity of 7 components

2.4.3 精密度考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液（丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為50.325、10.933、2.089、12.132、20.014、20.256、110.587 μg·mL－1）1.0、5.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高濃度的混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算色譜峰峰面積RSD，測(cè)定日內(nèi)精密度；分別連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算色譜峰峰面積RSD，測(cè)定日間精密度；結(jié)果7個(gè)成分低、中、高質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD在0.38%～2.1%，日間精密度RSD在1.2%～3.7%，表明方法日內(nèi)精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丹參配方顆粒（編號(hào)DS-2），精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.43%、0.52%、1.3%、0.80%、1.2%、1.1%、0.28%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取丹參配方顆粒（編號(hào)DS-2），精密稱定，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的RSD分別為1.5%、0.92%、2.3%、0.59%、2.3%、1.5%、0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含有量的丹參配方顆粒（編號(hào)DS-2）適量，精密稱取9份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于含有量50%、100%、150%的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的平均加樣回收率均在97.50%～105.59%，RSD均小于5.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 QAMS法的建立

2.5.1 相對(duì)校正因子（f）的確定 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定，以原兒茶醛作為內(nèi)參物，計(jì)算丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相對(duì)校正因子。公式為fs/i＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）＝（As×Ci）/（Ai×Cs），式中As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物濃度，Ai為某待測(cè)成分峰面積，Ci為某待測(cè)成分濃度[10]。計(jì)算得相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6個(gè)成分的相對(duì)校正因子(n＝6)Tab 2 Relative correction factors of 6 components (n＝6)

2.5.2 不同測(cè)定儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 以原兒茶醛為內(nèi)參物，考察其他6個(gè)成分在不同高效液相色譜儀Waters Arc型、Agilent 1290型，以及不同色譜柱Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）下的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3，各成分的相對(duì)校正因子RSD均小于3.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

表3 不同色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n＝3)Tab 3 Influence of instrument and column on relative correction factors (n＝3)

2.5.3 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響 以原兒茶醛為內(nèi)參物，考察其他6個(gè)成分在不同流速（0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min－1）下的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表4，各成分的相對(duì)校正因子RSD均小于3.0%，表明不同流速對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

表4 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n＝3)Tab 4 Influence of flow rate on relative correction factors (n＝3)

2.5.4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 以原兒茶醛為內(nèi)參物，考察其他6個(gè)成分在不同柱溫（25、30、35、40℃）下的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5，各成分的相對(duì)校正因子RSD均小于3.0%，表明不同柱溫對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n＝3)Tab 5 Influence of column temperature on relative correction factors (n＝3)

2.5.5 不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響 以原兒茶醛為內(nèi)參物，考察其他6個(gè)成分在不同進(jìn)樣體積（5、8、10、12、15 μL）下的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表6，各成分的相對(duì)校正因子RSD均小于5.0%，表明不同流速對(duì)各成分相對(duì)校正因子無(wú)顯著影響。

表6 不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響(n＝3)Tab 6 Influence of injection volume velocity on relative correction factors (n＝3)

2.6 待測(cè)成分色譜峰的定位

采用不同色譜儀及色譜柱測(cè)定時(shí)，待測(cè)成分的保留時(shí)間會(huì)有所波動(dòng)，目前在QAMS研究中常用的色譜峰定位方法有相對(duì)保留值法、保留時(shí)間差法、時(shí)間校正法、對(duì)照提取物法等。本試驗(yàn)采用相對(duì)保留值法，計(jì)算公式為ti/s＝ti/ts[11-14]。以原兒茶醛為內(nèi)參物，考察其他6個(gè)成分在不同高效液相色譜儀（Waters Arc型、Agilent 1290型）及不同色譜柱[Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）]下的相對(duì)保留值，結(jié)果見(jiàn)表7，各成分相對(duì)保留值的RSD＜3.0%，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)各成分相對(duì)保留值無(wú)顯著影響。

表7 不同色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)保留值的影響(n＝3)Tab 7 Influence of instrument and column on relative retention time (n＝3)

2.7 外標(biāo)法（ESM）和QAMS測(cè)定結(jié)果對(duì)比

取12批丹參配方顆粒適量（DS-1～DS-12），精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用QAMS和ESM法測(cè)定各成分含量，利用SPSS 26.0軟件對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，結(jié)果見(jiàn)表8。兩種方法之間的r均為1.000，兩種方法計(jì)算的含量具有高相關(guān)性（P＞0.05）。使用QAMS和ESM法測(cè)定丹參配方顆粒中丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量，計(jì)算兩種測(cè)定方法下的相對(duì)誤差（RAD），RAD（%）＝[（QAMS計(jì)算值－ESM實(shí)測(cè)值）/外標(biāo)法實(shí)測(cè)值]×100%[15]，結(jié)果顯示丹參素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相對(duì)誤差范圍分別為0.43%～0.53%、0.00%～3.70%、0.00%～0.34%、1.71%～2.01%、2.53%～2.93%、1.69%～1.73%，說(shuō)明建立的丹參配方顆粒QAMS準(zhǔn)確可行。

表8 6個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3，%)Tab 8 Content determination of 6 components (n＝3，%)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

本研究對(duì)供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法）、提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取時(shí)間（20、30、40 min）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，本研究供試品制備方法操作簡(jiǎn)便，且供試品溶液色譜峰峰面積、分離度均較好。

3.2 色譜條件的選擇

本研究比較了甲醇、乙腈兩種有機(jī)溶劑和不同濃度的磷酸、甲酸、醋酸組合的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為有機(jī)相較甲醇洗脫能力強(qiáng)，峰分離度好，使用磷酸作為水相時(shí)色譜圖基線更平穩(wěn)，噪音小。乙腈-0.05%磷酸洗脫時(shí)目標(biāo)峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，峰形良好，故采用該流動(dòng)相系統(tǒng)。采用PDA檢測(cè)器在210～400 nm內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，得到3D色譜圖，發(fā)現(xiàn)在286 nm時(shí)各組分的響應(yīng)值較強(qiáng)，各待測(cè)成分色譜峰純度角均小于純度閾值，各色譜峰無(wú)雜質(zhì)干擾，因此選擇286 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 內(nèi)參物的選擇

原兒茶醛相較于其他丹參酚酸類成分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)照品價(jià)廉易得，且使用HPLC法測(cè)定時(shí)響應(yīng)值高[16]，因此本次研究選擇原兒茶醛為內(nèi)參物，保證所建立方法穩(wěn)定可靠，同時(shí)達(dá)到降本增效的目的。

4 結(jié)論

本研究建立QAMS法同時(shí)測(cè)定丹參中7個(gè)酚酸類成分，所選用的內(nèi)參物原兒茶醛化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源充足，供試品溶液制備方法簡(jiǎn)便，可用于快速定量制劑中的各指標(biāo)成分，全面反映丹參配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。各色譜峰分離度好，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證、相對(duì)校正因子確認(rèn)、耐用性考察、色譜峰的定位等過(guò)程驗(yàn)證，證明建立的方法科學(xué)可靠，穩(wěn)定性良好，可為丹參配方顆粒的整體質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。