UPLC-MS/MS測(cè)定萘敏維滴眼液包材中6種抗氧劑的含量及其向藥液的遷移研究

吳月霞，楊秋紅，豐麗莼，張倩，范圍，陳杰（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450018）

萘敏維滴眼液多采用聚乙烯塑料制品作為包材，此類(lèi)包材在生產(chǎn)中都會(huì)加入抗氧劑，以提高其延展性和彈性，延緩氧化，方便生產(chǎn)，易于加工及保持性狀穩(wěn)定[1]。部分抗氧劑如苯基取代的亞磷酸酯類(lèi)被認(rèn)為有一定的毒性[2]，且部分抗氧劑的降解產(chǎn)物有潛在的致癌作用[3]。由于藥品包裝材料直接接觸藥液，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中，抗氧劑易與藥液發(fā)生相互作用或直接遷移至藥液中，會(huì)影響藥效甚至直接危害人體健康[4]。國(guó)家藥審中心發(fā)布了《化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[5]，指出包裝系統(tǒng)浸出物的水平應(yīng)符合安全性要求。歐洲藥典收載了部分塑料藥包材抗氧劑的信息，并規(guī)定每種樹(shù)脂添加抗氧劑的種類(lèi)不得超過(guò)3種，單種抗氧劑的量不得超過(guò)0.3%，總量不得超過(guò)0.3%[6]。因此有必要對(duì)其中所含的抗氧劑進(jìn)行考察，進(jìn)一步提高藥品質(zhì)量，保障人們用藥安全。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)藥品包材中抗氧劑的研究主要集中在注射液和輸液上[7-12]。張冬梅等[13]用HPLC法對(duì)妥布霉素滴眼液中抗氧劑含量進(jìn)行測(cè)定，但是方法靈敏度低，且分析時(shí)間較長(zhǎng)；也有文獻(xiàn)采用離子色譜法測(cè)定抗氧劑的含量，但前處理非常麻煩，基質(zhì)干擾大[14-16]；采用LC-MS對(duì)抗氧劑的分析主要集中在膠塞和輸液上，但使用該方法對(duì)滴眼液中抗氧劑的研究卻很少[17-19]；付蒙等[20]采用GC-MS對(duì)鹵化丁基膠塞中的抗氧劑進(jìn)行分析，但該方法不適用于高沸點(diǎn)抗氧劑（如抗氧劑168等）的分析，監(jiān)測(cè)范圍有限。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于UPLC的高分離能力以及MS所具備的高選擇性、高靈敏度，在現(xiàn)代分析領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。相對(duì)而言，采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對(duì)滴眼液包裝的相關(guān)報(bào)道比較少見(jiàn)，本文以聚乙烯類(lèi)藥用塑料包材為代表，考察滴眼液藥用包材中抗氧劑的含量情況，建立基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)萘敏維滴眼液中6種抗氧劑的含量，并對(duì)2022年省專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)督抽檢的25批次樣品、包材和影響因素進(jìn)行了分析和評(píng)估，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀UPLC-30AD（日本Shimadzu公司），超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀、QTRAP 6500質(zhì)譜儀、數(shù)據(jù)采集和處理軟件為Analyst 1.6.3（美國(guó)AB SCIEX公司）；XPE 205 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超聲儀KQ-700DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

抗氧劑LK-1081（AO LK-1081，批號(hào)：N17GS 168157，純度：98%）（上海源葉生物科技有限公司）；抗氧劑702（AO 702，批號(hào)：B2210291，純度＞98.0%）、抗氧劑3114（AO 3114，批號(hào)：H2117038，純度：98%）、抗氧劑1010（AO 1010，批號(hào)：F2129325，純度≥95.0%）、抗氧劑1076（AO 1076，批號(hào)：J2122553，純度：98%）、抗氧劑168（AO 168，批號(hào)：B2222432，純度＞98.0%）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），化學(xué)文摘登記號(hào)、分子式和分子量等信息見(jiàn)表1。鹽酸萘甲唑啉（批號(hào)：100111-202105）、馬來(lái)酸氯苯那敏（批號(hào)：100047-202008）、維生素B12（批號(hào)：100248-202006）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，均供含量測(cè)定用），甘油（批號(hào)：20210415，天津市大茂化學(xué)試劑廠），依地酸二鈉（批號(hào)：20190425，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），苯扎溴銨（批號(hào)：L8A0T35，北京百靈威科技有限公司）。25批次萘敏維滴眼液為2022年省專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)督抽檢樣品，由A、B、C、D、E、F、G、H 8家企業(yè)生產(chǎn)。低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶（批號(hào)：2201031，A企業(yè)）；乙腈、甲酸（均為質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)默克公司）；水為Milli-Q水（18.20 MΩ·cm－1）。

表1 6種抗氧劑的相關(guān)信息Tab 1 Information of 6 antioxidants

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL·min－1；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫（0～2 min，55%B；2～4 min，55%～80%B；4～5.5 min，80%B；5.5～7.5 min，80%～100%B；7.5～11.5 min，100%B，11.5～12.5 min，100%～55%B；12.5～13 min，55%B）；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為3 μL。通過(guò)六通切換閥，將4.5 min之前的液相流出液切換至旁路，不進(jìn)入質(zhì)譜分析。

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，正、負(fù)離子同時(shí)采集模式，離子源參數(shù)見(jiàn)表2。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 6種抗氧劑測(cè)定的ESI離子源參數(shù)Tab 2 ESI source parameters for the determination of 6 antioxdants

表3 6種抗氧劑的母離子、子離子、離子模式、去簇電壓、碰撞能和保留時(shí)間Tab 3 Parent ion，daughter ion，polarity，declustering potential，collision energy and retention time of 6 antioxidants

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取6種抗氧劑對(duì)照品適量，分別加乙腈溶解并定量稀釋制成每1 mL中含6種抗氧劑各約10 μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用乙腈定量稀釋制成每1 mL中約含6種抗氧劑0.5、5、10、25、50、75、100 ng的系列濃度混合對(duì)照品溶液。分別準(zhǔn)確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋制成含抗氧劑LK-1081、抗氧劑702和抗氧劑168的質(zhì)量濃度約為200 ng·mL－1，抗氧劑1010和抗氧劑1076的質(zhì)量濃度約為2000 ng·mL－1，抗氧劑3114的質(zhì)量濃度約為50 ng·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取萘敏維滴眼液10 g，精密稱(chēng)定，置離心管中，精密加入正己烷2 mL，漩渦振蕩2 min，超聲2 min，混勻，以15 000 r·min－1離心10 min，取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為萘敏維滴眼液供試品溶液。

2.3.3 空白溶液的制備 采用乙腈作為空白溶液。

2.3.4 空白輔料溶液的制備 根據(jù)各個(gè)生產(chǎn)廠家提供的制劑處方配比，取空白輔料適量，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。按照“2.3.2”項(xiàng)下前處理方法同法制備空白輔料溶液（與供試品溶液中輔料濃度相同）。

2.3.5 包材溶液的制備 取包材10套，剪至大小約0.2 cm×0.2 cm的單個(gè)碎片，混勻。精密稱(chēng)取包材碎片約2 g，加20 mL正己烷煮沸回流5 h，殘?jiān)儆?0 mL正己烷重復(fù)提取1次，合并濾液置50 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取空白溶液、空白輔料溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和包材溶液，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行分析，記錄MRM質(zhì)譜圖，得到6種抗氧劑的混合對(duì)照品溶液總離子流色譜圖（TIC），典型圖譜見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示6種抗氧劑均能有效分離，空白溶液（乙腈）和萘敏維滴眼液中的主成分鹽酸萘甲唑啉、馬來(lái)酸氯苯那敏、維生素B12及輔料均在3 min前出峰，不干擾6種抗氧劑的檢測(cè)。各個(gè)廠家空白輔料在6種抗氧劑相同保留時(shí)間位置均無(wú)明顯干擾峰。

圖1 萘敏維滴眼液中6種抗氧劑專(zhuān)屬性試驗(yàn)MRM質(zhì)譜圖Fig 1 MRM mass spectrogram of the specifity test of 6 antioxidants in naphazoline hydrochloride，chlorphenamine maleate and vitamin B12 eye drops

2.4.2 線性范圍、檢測(cè)限及定量限 取“2.3.1”項(xiàng)下6種抗氧劑的系列濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以各抗氧劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立線性方程，結(jié)果見(jiàn)表4。6種抗氧劑在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表4 6種抗氧劑的線性、范圍、檢測(cè)限及定量限Tab 4 Linear，range，LOQ and LOD of 6 antioxidants

2.4.3 檢測(cè)限與定量限 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用乙腈逐級(jí)定量稀釋。按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，分別以S/N＝3和S/N＝10確定各抗氧劑的方法檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.4 精密度 精密量取 “2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為0.24%（n＝6），說(shuō)明儀器精密度良好。同時(shí)在不同日期由不同人員在同一臺(tái)機(jī)器上分別進(jìn)樣測(cè)試，6種抗氧劑峰面積RSD值結(jié)果均在0.21%～0.62%（n＝6），說(shuō)明中間精密度良好。

2.4.5 準(zhǔn)確度 精密量取6種抗氧劑含量已知的萘敏維滴眼液10 mL，置離心管中，按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備回收率本底供試品溶液；同法加入80%、100%、120%濃度的抗氧劑對(duì)照溶液，制備回收率加標(biāo)供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果6種抗氧劑的回收率為98.9%～101.3%，RSD為0.23%～1.6%。

2.4.6 穩(wěn)定性 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10、18、20 h進(jìn)樣測(cè)定，混合對(duì)照品溶液中6種抗氧劑峰面積的RSD值在0.81%～1.9%，表明對(duì)照品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。供試品溶液中均未檢出6種抗氧劑，表明供試品溶液在室溫20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 樣品測(cè)定

3.1 制劑測(cè)定

取25批次樣品，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果制劑中均未檢出6種抗氧劑。

3.2 包材測(cè)定

按照“2.3.5”項(xiàng)下方法制備包材溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示25批次包材中檢出抗氧劑1076，檢出量為4.26～7.84 ng·g－1；其余抗氧劑均未檢出。22批次抗氧劑168檢出量為3.81～6.25 ng·g－1。

3.3 影響因素試驗(yàn)

取萘敏維滴眼液（A企業(yè)，211101），置強(qiáng)光（照度4500 lx）、高溫（60℃）、高濕（相對(duì)濕度92.5%），環(huán)境下在0、5、10 d分別取樣。按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示6種抗氧劑含量均無(wú)變化，不受高溫、高濕和強(qiáng)光照射的影響。

4 討論

4.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式，分別在ESI的正離子模式及負(fù)離子模式下對(duì)6種抗氧劑的單標(biāo)溶液進(jìn)行全掃描，確定母離子；其次根據(jù)母離子分別對(duì)其子離子進(jìn)行掃描，選取響應(yīng)強(qiáng)度最大的2個(gè)子離子，兩者中以響應(yīng)強(qiáng)度大者為定量離子，另一個(gè)為定性離子；最后進(jìn)行去簇電壓和碰撞能的優(yōu)化，得到6種抗氧劑的最佳質(zhì)譜參數(shù)。探索試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗氧劑LK-1081在ESI正離子模式下響應(yīng)相對(duì)較差，因此對(duì)其采用負(fù)離子模式。另外，ESI離子源參數(shù)中，CE能顯著影響質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。因此，通過(guò)調(diào)整質(zhì)譜參數(shù)來(lái)優(yōu)化抗氧劑的響應(yīng)，有效提高了檢測(cè)方法的靈敏度。

4.2 閥切換技術(shù)的應(yīng)用

萘敏維滴眼液為復(fù)方制劑，在進(jìn)行液相色譜分離時(shí)，流出液中含有3種高濃度的主成分及大量輔料，為防止污染質(zhì)譜，降低6種抗氧劑的離子化效率，本試驗(yàn)采用了閥切換技術(shù)，將保留時(shí)間4.5 min之前的輔料成分及高濃度的主成分切換到旁路，不進(jìn)入質(zhì)譜，使采集的質(zhì)譜基線更平穩(wěn)，保證了方法的重現(xiàn)性、專(zhuān)屬性和靈敏度。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法考察萘敏維滴眼液包材中6種抗氧劑的含量及其向藥液的遷移，方法操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、專(zhuān)屬性好，適用于萘敏維滴眼液中抗氧劑的限度檢查和定量測(cè)定。25批萘敏維滴眼液中6種抗氧劑的殘留量均低于檢測(cè)限，均符合規(guī)定，表明生產(chǎn)廠家的工藝可有效避免抗氧劑的引入。因此，對(duì)于萘敏維滴眼液中抗氧劑的含量的監(jiān)控應(yīng)更加關(guān)注包裝材料的選擇，可不在萘敏維滴眼液中進(jìn)行控制。本研究結(jié)果為監(jiān)管機(jī)構(gòu)評(píng)估萘敏維滴眼液產(chǎn)品質(zhì)量提供了數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)可為其他滴眼液中抗氧劑的檢測(cè)提供參考。