缺血性腦卒中患者白細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性變化及其與卒中后抑郁的關(guān)系

任長安 戚游 汪文娟

缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是腦卒中的主要類型,常見于50歲以上中老年人群,具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]。既往研究表明IS患者治療后常遺留不同程度神經(jīng)根功能損害,不僅可導(dǎo)致日常生活自理能力下降,還可引起患者情感障礙,其中以卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)最為常見[2-4]。目前關(guān)于PSD詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,王東等[5]研究表明IS患者PSD患病率高達(dá)36.4%,糖尿病、多發(fā)病灶以及神經(jīng)功能缺損均為PSD的主要危險(xiǎn)因素。近年來研究表明線粒體膜電位和呼吸鏈復(fù)合體活性與腦細(xì)胞缺血性損傷存在密切聯(lián)系,其機(jī)制可能與活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)[6-7];王倩等[8]研究結(jié)果顯示右美托咪定可通過降低線粒體膜電位和減少線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性損傷減輕老年患者全身麻醉手術(shù)后的認(rèn)知功能損害。由此推測線粒體損傷可能在腦細(xì)胞缺血損傷和PSD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)IS患者白細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性變化及其與PSD的關(guān)系進(jìn)行分析,以明確PSD發(fā)病機(jī)制并為臨床治療提供思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象前瞻性收集2018年11月至2020年7月作者醫(yī)院收治的IS患者189例,其中男112例,女77例,年齡37～84歲,平均(57.4±11.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》IS診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)年齡≥18歲;(3)發(fā)病至入院時(shí)間<24 h;(4)患者意識(shí)清醒并且可配合完成相關(guān)檢查;(5)入院前未接受抗凝、溶栓或神經(jīng)營養(yǎng)等治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并惡性腫瘤、嚴(yán)重感染或冠心病等其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病;(2)合并腦卒中、外傷或手術(shù)病史;(3)合并精神障礙、癡呆或神經(jīng)系統(tǒng)病變;(4)合并失語或聽力障礙等因素所致交流溝通困難;(5)既往有酗酒或藥物濫用等病史者。脫落標(biāo)準(zhǔn):(1)隨訪期間失訪或主動(dòng)要求退出研究者;(2)發(fā)生突發(fā)意外事件無法繼續(xù)完成研究者;(3)患者因死亡或昏迷等原因?qū)е屡R床資料不完整者。本研究已通過作者單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(WXFS-201811-006),且患者和家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1白細(xì)胞線粒體膜電位測量:采集患者入院第1天和隨訪結(jié)束時(shí)空腹外周靜脈血3 mL,置于EDTA-K2抗凝管,4℃以600g離心10 min后去除上清液,采用Coulter Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)分離白細(xì)胞,采用PBS溶液沖洗5 min×3次。向白細(xì)胞中加入Trizol試劑(美國Invitrogen公司),使白細(xì)胞水平為1×106～1×107/500 μL,并反復(fù)抽吸至產(chǎn)生大量泡沫,室溫環(huán)境孵育5 min。然后加入三氯甲烷(與Trizol溶液體積比為1∶5),劇烈震蕩15 min后靜置10 min,4℃以11000g離心3 min,將上清液轉(zhuǎn)移至EP管并加入異丙醇(與Trizol溶液體積比1∶2),搖勻后室溫條件孵育10 min,再于4℃環(huán)境下以11000g離心3 min,去除上清液并向底層沉淀物中加入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(與Trizol試劑體積等同),混勻后在4℃環(huán)境以9000g離心5 min,去除上清液并將沉淀物置于濾紙片上進(jìn)行自然干燥,5 min后加入60 μL焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水溶液,溶解后加入JC-1染色液并37℃恒溫水浴30 min,采用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度并分析線粒體膜電位,其中JC-1單體為綠色熒光,JC-1在線粒體內(nèi)形成的聚合物呈紅色熒光,以紅/綠熒光強(qiáng)度比值表示膜電位大小。

1.2.2白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性測量:取患者入院第1天和隨訪結(jié)束時(shí)空腹外周靜脈血3 mL,采用“1.2.1”方法分離并提純白細(xì)胞,然后采用ELISA法(試劑盒購自Beyotime公司)檢測白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ吸光度,檢測波長分別為340 nm、600 nm、550 nm和550 nm。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各復(fù)合體濃度。所用儀器為美國Agilent公司8453紫外-可見分光光度計(jì)。

1.2.3PSD隨訪和分組:均隨訪1年。隨訪結(jié)束時(shí)采用漢密爾頓抑郁量表(Hamiliton depression scale,HAMD)評(píng)估患者有無PSD及嚴(yán)重程度,內(nèi)容包括抑郁情緒、負(fù)罪感及自卑感等共24項(xiàng),總分<8分為無抑郁,≥8～<17分為輕度抑郁,≥17～<24分為中度抑郁,≥24分為重度抑郁,根據(jù)HAMD評(píng)分將患者分為PSD(≥8分)和非PSD(<8分)兩組,比較兩組性別、年齡和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)等臨床資料和白細(xì)胞線粒體膜電位及白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);采用Pearson積差系數(shù)分析IS患者白細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性與HAMD評(píng)分的相關(guān)性;采用受試者工作特征(ROC)曲線分析IS患者白細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性變化對(duì)PSD的預(yù)測價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較189例患者失訪4例,死亡2例,自行退出研究1例,共脫落7例(3.70%),共182例患者進(jìn)入分析。發(fā)生PSD共73例(40.11%),其中輕度29例(39.73%)、中度26例(35.62%),重度18例(24.66%)。PSD組和非PSD組性別構(gòu)成、年齡以及BMI等臨床基本資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 PSD組和非PSD組臨床資料比較

2.2 兩組患者白細(xì)胞線粒體膜電位比較PSD組入院第1天白細(xì)胞線粒體膜電位低于非PSD組(P<0.05),隨訪1年時(shí)兩組白細(xì)胞線粒體膜電位均明顯升高(P<0.05),且兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 兩組白細(xì)胞線粒體膜電位比較

2.3 兩組白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性比較PSD組入院第1天白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性低于非PSD組(P<0.05),隨訪1年時(shí)兩組白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯升高(P<0.05),且兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 兩組患者白細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性比較

2.4 不同嚴(yán)重程度PSD患者白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體活性比較隨著PSD嚴(yán)重程度增加,入院第1天時(shí)患者白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 不同嚴(yán)重程度PSD患者入院第1天時(shí)白細(xì)胞線粒體功能比較

2.5 相關(guān)性分析PSD患者HAMD評(píng)分與入院第1天白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均明顯呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 PSD患者HAMD評(píng)分與入院第1天白細(xì)胞線粒體功能相關(guān)性分析

2.6 ROC曲線分析IS患者入院第1天白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性預(yù)測PSD的AUC分別為0.606、0.734、0.816、0.747和0.690(均P<0.05),具有一定診斷價(jià)值,其中線粒體膜電位和呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性特異度較高,呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅲ活性敏感度較高。結(jié)果見表6和圖1。

表6 白細(xì)胞線粒體功能對(duì)PSD的預(yù)測價(jià)值分析

注:PSD:卒中后抑郁;ROC:受試者工作特征

3 討論

PSD常見于腦卒中后2年內(nèi),且高發(fā)期為腦卒中后3個(gè)月至1年,國外追蹤調(diào)查研究結(jié)果顯示腦卒中后1、3、12和24個(gè)月時(shí)PSD發(fā)生率分別為25%、31%、16%和29%[10-11]。本研究對(duì)182例IS患者治療后隨訪1年,結(jié)果顯示PSD發(fā)生率為40.11%。這與王東等[5]報(bào)道的36.4%相近。既往研究認(rèn)為PSD由多種因素綜合作用所致,其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與IS患者基礎(chǔ)健康、腦卒中病灶位置和神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度等密切相關(guān),同時(shí)還受家庭和社會(huì)環(huán)境影響[12]。而本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)PSD患者與非PSD組患者間性別構(gòu)成、年齡以及BMI等臨床指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示PSD影響因素較為復(fù)雜,且不同地區(qū)報(bào)道可能存在差異。其原因可能與樣本選取有關(guān),如既往研究表明隨著年齡增長,PSD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高,史莉瑾等[13]以平均年齡(63.1±7.1)歲的患者為樣本進(jìn)行研究顯示年齡≥70歲為PSD獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而本研究患者平均年齡相對(duì)較小,70歲以上患者占比較低,故而對(duì)PSD的發(fā)生未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。因此,有關(guān)PSD發(fā)生的確切影響因素尚需進(jìn)一步開展多因素分析研究證實(shí)。

PSD主要病理生理機(jī)制為腦組織缺血損傷導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)通路破壞,因此不僅可造成病灶部位神經(jīng)功能缺損,還可通過去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)等神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常引起控制情感的腦組織損傷[14]。線粒體功能異常與IS患者腦組織損傷存在密切聯(lián)系。Andrabi等[15]研究結(jié)果顯示線粒體功能損傷可影響活性氧生成和電子傳遞鏈功能,從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。岳萌等[16]通過建立小鼠高血糖腦缺血再灌注模型進(jìn)行分析顯示活性氧可能通過影響線粒體膜電位而加重腦缺血性損傷。有研究結(jié)果顯示,氧化應(yīng)激是造成線粒體膜電位異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié),腦卒中后產(chǎn)生的大量氧自由基可造成膜電位降低,線粒體膜通透性增加和細(xì)胞色素C大量釋放[17]。線粒體膜電位降低可導(dǎo)致能量代謝障礙和氧化應(yīng)激異常,甚至誘導(dǎo)線粒體和白細(xì)胞凋亡,加重神經(jīng)功能缺損,導(dǎo)致PSD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)程度增加。本研究結(jié)果顯示,PSD組入院第1天時(shí)白細(xì)胞線粒體膜電位和呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性低于非PSD組,提示IS患者線粒體膜電位降低且呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性減退導(dǎo)致了線粒體能量代謝障礙和腦組織損傷,當(dāng)累及額葉或海馬等部位時(shí)可造成神經(jīng)元活動(dòng)抑制進(jìn)而發(fā)生抑郁癥。

呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ為電子和氫傳遞載體,其活性下降直接造成線粒體能量代謝障礙和ATP合成減少。既往研究結(jié)果顯示抑郁癥模型大鼠和臨床患者腦細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均存在不同程度抑制,且以復(fù)合體Ⅰ最為顯著[18]。本研究根據(jù)HAMD量表評(píng)估PSD嚴(yán)重程度,結(jié)果顯示其中輕度29例(39.73%)、中度26例(35.62%),重度18例(24.66%),表明中、重度PSD患者占比較高;同時(shí)本研究結(jié)果顯示隨著PSD嚴(yán)重程度不斷加重,入院第1天患者白細(xì)胞線粒體膜電位以及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均呈明顯降低,且PSD患者HAMD評(píng)分與入院第1天白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均呈明顯負(fù)相關(guān)性,提示IS患者線粒體功能損害與PSD發(fā)生存在密切聯(lián)系。既往研究表明線粒體在氧化應(yīng)激等因素作用下導(dǎo)致膜電位降低,線粒體膜通透性隨之增加,線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(CytC)大量釋放至包漿內(nèi),啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。有研究認(rèn)為β淀粉樣蛋白(Aβ)生成和代謝障礙導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)沉積,形成Aβ斑塊并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,該病理過程又可促進(jìn)Aβ沉積,從而形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),導(dǎo)致患者認(rèn)知功能逐漸下降[20]。線粒體功能障礙可導(dǎo)致Aβ生成和累積增多,Aβ又可消耗血紅素基團(tuán)并抑制復(fù)合物Ⅳ合成,同時(shí)神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理結(jié)構(gòu)中高度磷酸化的微管相關(guān)蛋白Tau也可損害復(fù)合物Ⅰ活性,可見呼吸鏈復(fù)合體活性與認(rèn)知功能損害存在相互影響的關(guān)系[21-23]。此外文獻(xiàn)報(bào)道顯示輔酶Q10活性下降[24]、線粒體DNA缺陷[25]以及蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)異常[26]等也在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中占有重要地位,但這些機(jī)制與腦卒中的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究?？傊€粒體結(jié)構(gòu)和功能異常是PSD發(fā)生的重要機(jī)制,且涉及線粒體結(jié)構(gòu)、分子和復(fù)合體等多個(gè)環(huán)節(jié),為完全明確線粒體與PSD關(guān)系的具體細(xì)節(jié),后續(xù)還需要不斷研究和探討。

目前對(duì)PSD還缺少有效預(yù)測方法。慕麗等[27]報(bào)道顯示入院時(shí)紅細(xì)胞分布寬度對(duì)PSD具有一定預(yù)測價(jià)值,但敏感度和特異度均存在不足。本研究采用IS患者入院第1 天白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性進(jìn)行ROC分析,結(jié)果顯示其AUC分別為0.606、0.734、0.816、0.747和0.690,其中以呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ臨床價(jià)值最高,其敏感度和特異度分別為84.93%和64.22%,可為PSD早期預(yù)測和干預(yù)提供參考信息,但單獨(dú)應(yīng)用仍然存在不足,因此后續(xù)還需要開展研究探討其他與PSD存在密切關(guān)系的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測。此外,本研究顯示線粒體膜電位的預(yù)測價(jià)值較低,其原因可能與膜電位穩(wěn)定性較差,導(dǎo)致測量結(jié)果容易發(fā)生偏倚有關(guān)。

綜上所述,PSD患者入院第1 天白細(xì)胞線粒體膜電位及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性均明顯降低,且與抑郁嚴(yán)重程度存在明顯負(fù)相關(guān),可能在PSD發(fā)病和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用,對(duì)PSD的發(fā)生具有一定預(yù)測價(jià)值。