昆蟲保幼激素受體的研究與應用進展

陳金霞,耿 兵,何倩毓

(黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院,黑龍江大慶 163319)

保幼激素(Juvenile hormone, JH)是主要由昆蟲咽側(cè)體合成并分泌的脂溶性倍半萜類激素。Wigglesworth于1934年在研究吸血蝽Rhodniusprolixus時首次發(fā)現(xiàn)和報道,隨后R?ller等在1967年確定了JH的倍半萜結(jié)構(gòu)(R?lleretal.,1967)。截止目前,昆蟲中存在至少8種天然JH,分別是JH 0、JH I、JH II、JH III、4-甲基JH I、JHB3、JHSB3和甲基法尼酯(Methyl farnosate, MF)。其中JH III是最常見的JH形式,在多數(shù)直翅目、蜚蠊目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鱗翅目以及雙翅目等昆蟲中均被發(fā)現(xiàn);而JH 0、JH I、JH II以及4-甲基JH I僅存在于鱗翅目昆蟲中;JHB3以及JHSB3則分別是雙翅目短角亞目昆蟲和半翅目昆蟲所特有(Belles, 2020a);MF一直被認為是甲殼類動物中的JH,它比JH III缺少一個環(huán)氧基,但近期研究發(fā)現(xiàn)MF在果蠅也具有類似JH的功能(Wenetal., 2015)。

顧名思義,JH的命名是基于早期發(fā)現(xiàn)JH具有使昆蟲幼蟲蛻皮后維持幼蟲狀態(tài)的作用。然而近年來大量研究表明JH僅在昆蟲幼蟲發(fā)育至臨界齡期或達到臨界體重時才可發(fā)揮“維持現(xiàn)狀”以及阻止昆蟲變態(tài)的作用(Tanetal., 2005; Daimonetal., 2012; Daimonetal., 2015; Inui and Daimon, 2017; Nouzovaetal., 2021)。除此之外,JH在昆蟲生殖、滯育、行為、免疫以及社會等級決定等方面均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用(Jindra, 2019; Truman, 2019; Jindraetal., 2021b)。然而,無論JH在昆蟲中是以哪種化學結(jié)構(gòu)形式存在抑或發(fā)揮哪種生理功能,其調(diào)控作用都是由其受體介導的。目前大量研究成果表明,JH可通過胞內(nèi)受體及膜受體兩個途徑來發(fā)揮其生理功能。本文將圍繞JH胞內(nèi)受體和膜受體的相關(guān)研究進展進行綜述,以期為進一步深入闡明JH分子作用機制、開發(fā)設(shè)計新型害蟲防治及益蟲利用的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑提供幫助。

1 JH胞內(nèi)受體Met研究進展

1.1 Met作為JH胞內(nèi)受體的發(fā)現(xiàn)及鑒定

JH胞內(nèi)受體的發(fā)現(xiàn)得益于果蠅便捷的遺傳操作手段。不同于其他昆蟲,對果蠅幼蟲外源施加JH并不會產(chǎn)生超齡幼蟲以及抑制變態(tài),而是僅在預蛹期處理時可阻止成蟲腹部表皮形成和剛毛形態(tài)發(fā)生,以及導致雄性生殖器翻轉(zhuǎn)不完全和阻止成蟲羽化等表型(Madhavan, 1973; Zhou and Riddiford, 2002)。施加JH類似物(JH analogs, JHA)如methoprene或pyriproxyfen可產(chǎn)生強于JH所產(chǎn)生的形態(tài)缺陷效應,導致果蠅死亡(Wilson and Fabian, 1986)?；谶@一現(xiàn)象,Wilson和Fabian(1986)利用正向遺傳學操作方法篩選能夠耐受methoprene的果蠅突變體以期獲得JH受體基因,最終發(fā)現(xiàn)位于X染色體上的某一基因缺失的果蠅品系可耐受methoprene產(chǎn)生的致死以及形態(tài)發(fā)生缺陷效應,因此將該基因命名為methoprene-tolerant(Met)。然而,奇怪的是DmMet無義突變體Met27除產(chǎn)卵能力下降、胸部肌肉以及視神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)出微弱的表型缺陷外,可正常存活(Wilson and Ashok, 1998; Wilsonetal., 2006; Abdouetal., 2011),這一現(xiàn)象與JH受體缺失的理論表型相矛盾。隨后研究發(fā)現(xiàn),果蠅中存在另一個基因Germcell-expressed(Gce)與Met同源,二者均屬于bHLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,在bHLH、PAS-A和PAS-B結(jié)構(gòu)域的相似性分別為78%、68%和86% (Mooreetal., 2000)。進化分析表明,DmMet是由DmGce復制產(chǎn)生的,相對于DmMet,DmGce與其他昆蟲中的Met同源性更高(Baumannetal., 2010)。功能研究發(fā)現(xiàn),DmGce無義突變體gce2.5K具有類似Met27的表型,且二者同時缺失后(Met27gce2.5K)可導致果蠅在預蛹期死亡(Abdouetal., 2011),表型類似JH缺失果蠅(Liuetal., 2009)。更為重要的是該致死表型可分別被DmMet或DmGce過表達果蠅挽救(Abdouetal., 2011; Jindraetal., 2015)。以上結(jié)果表明DmMet和DmGce在果蠅幼蟲變態(tài)發(fā)育過程中功能冗余,可能同時作為JH受體介導JH信號傳導。

與果蠅不同的是,赤擬谷盜Triboliumcastaneum僅含有1個Met基因。在赤擬谷盜預蛹前期,RNAi降低TcMet的表達可阻止外源JH誘導次級蛹的產(chǎn)生,并且大部分可正常羽化為成蟲。更為重要的是,在3齡或4齡期RNAi降低TcMet的表達,可導致幼蟲在5齡或6齡提前變態(tài),形成小蛹(Konopova and Jindra, 2007),該表型與RNAi降低JH甲基轉(zhuǎn)移酶(JH acid methyltransferase, JHAMT)導致JH缺失的表型完全類似(Minakuchietal., 2008)。同樣地,在不完全變態(tài)昆蟲始紅蝽Pyrrhocorisapterus以及德國小蠊Blattellagermanica中也觀察到MetRNAi導致昆蟲提前變態(tài)的現(xiàn)象(Konopovaetal., 2011; Lozano and Belles, 2011)。與此同時,體外結(jié)合實驗表明,DmMet和DmGce以及赤擬谷盜、衣魚等昆蟲Met均可與生理水平濃度的JH III結(jié)合,其中DmMet、DmGce以及TcMet與JH III結(jié)合的解離常數(shù)Kd值分別為5.3±4.5 nM、19.3±4.5 nM、2.94±0.68 nM (Miuraetal., 2005; Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2015),且結(jié)合位點被證明位于PAS-B結(jié)構(gòu)域(Charlesetal., 2011; Jindraetal., 2015)。果蠅遺傳學實驗進一步證明,當DmMet或DmGce PAS-B結(jié)構(gòu)域中JH結(jié)合位點突變后,DmMet或DmGce均喪失挽救Met/Gce雙缺失果蠅Met27gce2.5K預蛹期死亡表型的作用(Jindraetal., 2015)。綜合以上結(jié)果,表明Met (果蠅中還包含Gce)是JH胞內(nèi)受體。

1.2 Met轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控

bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子通常以二聚體的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用(Edwards and Gorelick, 2022)。Met作為bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員,最早被發(fā)現(xiàn)可與自身形成同源二聚體或與Gce結(jié)合形成異源二聚體,但這兩類二聚體均可被JH所解離(Godlewskietal., 2006)。Li等(2011)利用酵母雙雜交系統(tǒng)從埃及伊蚊Aedesaegypti的cDNA文庫中篩選JH存在時可與Met結(jié)合的蛋白,發(fā)現(xiàn)JH可促進βFtz-F1結(jié)合的類固醇激素受體共激活物(βFtz-F1 interacting steroid receptor coactivator, FISC)(果蠅中稱為Taiman,Tai)與Met結(jié)合參與JH對下游基因的誘導表達。研究發(fā)現(xiàn),Met和FISC的PAS-A和PAS-B結(jié)構(gòu)域?qū)Χ叩慕Y(jié)合是必需的,且當Met PAS-B結(jié)構(gòu)域中JH結(jié)合位點突變后,可阻礙Met-FISC二聚體形成(Charlesetal., 2011; Lietal., 2011)。染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)和凝膠遷移(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)實驗結(jié)果表明JH促進下游基因earlytrypsin(ET)的表達依賴于Met-FISC二聚體與ET啟動子區(qū)域中JH反應元件(JH response element, JHRE)的直接結(jié)合(Lietal., 2011)。并且Met-FISC二聚體與JHRE的結(jié)合依賴于二者的bHLH結(jié)構(gòu)域,分別將Met或FISC bHLH結(jié)構(gòu)域中的堿性氨基酸突變后可顯著降低受體復合物與JHRE的結(jié)合,暗示Met和FISC同時結(jié)合于JHRE的不同區(qū)域(Lietal., 2014)。隨后在家蠶、赤擬谷盜、果蠅、始紅蝽、德國小蠊、飛蝗Locustmigratoria中均發(fā)現(xiàn)FISC同源類似物(后文統(tǒng)稱為Tai)是Met介導JH信號傳導中必不可缺的共激活因子(Zhangetal., 2011; Kayukawaetal., 2012; Guoetal., 2014; Lozanoetal., 2014; Smykaletal., 2014a; Royetal., 2018; Lietal., 2019; Jindraetal., 2021b)。近期,Jindra等(2021)利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf9細胞中共轉(zhuǎn)染赤擬谷盜TcMet和TcTai,經(jīng)純化及質(zhì)譜鑒定證實JH促進Met和Tai以1∶1的比例結(jié)合形成功能異源二聚體介導JH信號傳導(Jindraetal., 2021a)。除Tai外,Cycle (CYC)是另一個可與Met結(jié)合的bHLH-PAS共激活因子。在埃及伊蚊雌蚊中,Met/CYC異源二聚體介導了JH以光周期依賴形式對Krüppelholomog1(Kr-h1)和Hairy轉(zhuǎn)錄表達的激活(Shinetal., 2012)。

除bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員與Met結(jié)合形成功能受體復合物外,分子伴侶Hsp83通過與細胞質(zhì)中Met的bHLH和PAS-B結(jié)構(gòu)域結(jié)合后可維持Met構(gòu)象穩(wěn)定,有利于Met與JH的結(jié)合(Heetal., 2014)。進一步研究發(fā)現(xiàn),JH與細胞質(zhì)中Met結(jié)合后,可進一步促進Met與Hsp83結(jié)合,JH-Met-Hsp83復合體在Hsp83的協(xié)助下與核孔蛋白Nup358 N端的肽重復序列(tetratricopeptide repeat, TPR)結(jié)合后位于核孔周圍,最后在入核轉(zhuǎn)運載體importin β作用下入核。入核后,Met與Tai結(jié)合形成功能受體復合物后作用于Kr-h1啟動子上游JHRE,促進Kr-h1的表達。Hsp83突變或加入Hsp83抑制劑或超表達TPR抑制Hsp83與Nup358的結(jié)合,均可阻礙Met的細胞核定位,導致Met與JHRE結(jié)合能力下降,使得Kr-h1轉(zhuǎn)錄表達水平降低(Heetal., 2014; 何倩毓和張原熙, 2016; Heetal., 2017)。值得注意的是,近期Jindra等(2021a)研究發(fā)現(xiàn)JH可促進共表達于sf9細胞中的TcMet與TcTai的結(jié)合,而降低Hsp83與TcMet的結(jié)合。JH對Met-Hsp83結(jié)合能力調(diào)控的差異推測可能是由于JH存在時,體外過表達TcTai后可與sf9細胞內(nèi)源性Hsp83競爭結(jié)合Met的PAS-B結(jié)構(gòu)域,從而使得Met與Hsp83結(jié)合能力下降。

磷酸化修飾是影響Met-Tai受體復合物轉(zhuǎn)錄活性的另一因素。埃及伊蚊中的研究發(fā)現(xiàn),JH通過激活磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)信號通路,引起細胞內(nèi)二脂酰甘油(Diacylglycerol, DAG)、三磷酸肌醇(Inositol trisphosphate, IP3)以及Ca2+濃度的增加,進而激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)及蛋白激酶C (Protein kinase, PKC)。CaMKⅡ和PKC進一步通過磷酸化Met和Tai來增強Met-Tai復合體與JHRE的結(jié)合。加入λ蛋白磷酸酶處理可顯著降低Met-Tai復合體與JHRE的結(jié)合(Liuetal., 2015)。近期,Met磷酸化位點在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、埃及伊蚊以及赤擬谷盜中陸續(xù)被報道(Jindraetal., 2021a; Kimetal., 2021; Lietal., 2021)。Li等(2021)以棉鈴蟲為研究對象,借助多個磷酸化位點預測工具以及點突變手段發(fā)現(xiàn)JH有且僅可促進HaMet1 PAS-B結(jié)構(gòu)域中第393位蘇氨酸(Thr393)磷酸化。將該磷酸化位點突變后導致JH促進的HaMet1與Tai的結(jié)合,以及HaMet1與JHRE的結(jié)合能力下降,最終使得JH誘導的Kr-h1轉(zhuǎn)錄表達水平降低。此外,Thr393磷酸化位點突變后可阻礙JH誘導的HaMet1-HaMet1二聚體的解離,以上結(jié)果表明JH誘導HaMet1 Thr393磷酸化是HaMet1-HaMet1同源二聚體解離、HaMet1-HaTai二聚體形成以及HaMet與JHRE結(jié)合所必需的(Lietal., 2021)。與之不同的是,對埃及伊蚊以及赤擬谷盜Met磷酸化的研究發(fā)現(xiàn)Met存在多個磷酸化位點。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)方法分別在埃及伊蚊以及赤擬谷盜Met中鑒定到7個和10個磷酸化位點,并且發(fā)現(xiàn)JH既可以促進Met某些位點的磷酸化,也可以導致某些位點的去磷酸化發(fā)生(Jindraetal., 2021a; Kimetal., 2021)。此外,值得注意的是,赤擬谷盜中TcMet磷酸化位點突變后既不影響TcMet的配體結(jié)合能力,也不影響TcMet的細胞核定位及其與JHRE的結(jié)合(Jindraetal., 2021a; Gao,etal., 2022)。不同昆蟲中Met磷酸化位點以及磷酸化修飾對Met功能的影響所表現(xiàn)出的差異,究竟是由于物種特異性還是由于實驗操作方法不同導致的仍有待進一步研究。

1.3 Met功能研究進展

作為JH胞內(nèi)受體,Met的功能主要是參與JH對昆蟲的生理調(diào)控。早期研究主要集中于Met介導JH對昆蟲變態(tài)發(fā)育的調(diào)控。如前所述,RNAi降低Met的表達或Met突變后可導致完全變態(tài)昆蟲或不完全變態(tài)昆蟲提前變態(tài),表型類似于JH缺失(Konopova and Jindra, 2007; Abdouetal., 2011; Konopovaetal., 2011; Lozano and Belles, 2014; Smykaletal., 2014b; Daimonetal., 2015; Villalobos-Sambucaroetal., 2015b; Maetal., 2018; Cuietal., 2021)。JH抑制昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子作用機制目前已被證實,主要是通過促進Met-Tai復合體與Kr-h1啟動子區(qū)JHRE的直接結(jié)合來誘導Kr-h1的表達。Kr-h1作為JH的初級反應基因進一步通過直接抑制20E信號通路中的蛹期特異因子Broad(Br)和成蟲特異因子Ecdysoneinducedprotein93F(E93)的表達,或直接抑制前胸腺中20E合成通路中關(guān)鍵酶(如Spookier)基因的表達來阻止昆蟲變態(tài)(Lozano and Belles, 2011; Kayukawaetal., 2012; Belles and Santos, 2014; Kayukawaetal., 2016; Kayukawaetal., 2017; Liuetal., 2018b; Zhangetal., 2018; Belles, 2020b; Martinetal., 2021; He and Zhang, 2022)。值得注意的是,在JHAMT-/-;mod(可導致家蠶幼蟲提前變態(tài)形成小蛹)雙突變家蠶以及Met1-/-家蠶中發(fā)現(xiàn),阻斷JH合成或JH信號傳遞并沒有引起家蠶在1、2齡期提前變態(tài),而是最早在3齡幼蟲期產(chǎn)生提前變態(tài)的表型(Daimonetal., 2015; Cuietal., 2021)。同樣的,在埃及伊蚊中的研究也發(fā)現(xiàn),基于CRISPR(Clutered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats) /Cas9基因編輯技術(shù)敲除Met或JHAMT對埃及伊蚊的胚胎及1、2齡幼蟲的發(fā)育并不產(chǎn)生影響,而是在3齡或4齡幼蟲期,蟲體才開始出現(xiàn)黑色的蛹表皮并在化蛹前死亡(Zhuetal., 2019; Nouzovaetal., 2021)?；虮磉_分析發(fā)現(xiàn),Met突變后導致參與黑化作用、蛹和成蟲表皮合成以及成蟲吸血后的消化等過程中的相關(guān)酶基因在4齡幼蟲中提前表達,表明直到埃及伊蚊發(fā)育至3齡或4齡幼蟲階段,JH才通過Met抑制蛹/成蟲提前變態(tài)(Zhuetal., 2019)。同樣在不完全變態(tài)昆蟲始紅蝽中RNAi降低Met的表達最早可使3齡若蟲出現(xiàn)微弱的提前變態(tài)現(xiàn)象(Smykaletal., 2014b)。以上研究表明,JH-Met在完全變態(tài)昆蟲和不完全變態(tài)昆蟲的早期胚后發(fā)育過程中并不是必需的,只有當昆蟲發(fā)育到“臨界齡期”時,JH才通過Met發(fā)揮阻止昆蟲變態(tài)的作用。

除調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育外,對昆蟲的生殖調(diào)控是JH又一重要的生理調(diào)控作用。在絕大多數(shù)雌性昆蟲中,脂肪體中卵黃蛋白原(vitellogenin,Vg)的合成、以及卵母細胞的成熟都受JH調(diào)控(Royetal., 2018; Santosetal., 2019; Song and Zhou, 2020; Wuetal., 2020; Khalidetal., 2021),并且該作用也被證明是由Met所介導。如在不完全變態(tài)昆蟲始紅蝽、吸血蝽、臭蟲Cimexlectularius、沙漠蝗Schistocercagregaria和飛蝗、甲蟲蟑螂Diplopterapunctata、白背飛虱Sogatallafurcifera等昆蟲中的研究發(fā)現(xiàn),RNAi降低Met的表達可部分甚至完全阻斷Vg的合成、卵母細胞的成熟以及卵子發(fā)生(Guoetal., 2014; Marchaletal., 2014; Smykaletal., 2014a; Villalobos-Sambucaroetal., 2015a; Gujar and Palli, 2016; Gijbelsetal., 2019; Huetal., 2019),該表型與部分已獲得的JH缺失昆蟲的表型類似(Guoetal., 2014; Smykaletal., 2014b)。飛蝗中的一系列研究表明,JH通過Met上調(diào)DNA復制基因Mcm4和Mcm7以及細胞周期基因Cdc6,Cdk6和E2f1,從而促進脂肪體細胞多倍體化,有利于脂肪體中Vg的快速大量合成,為大量卵子的同步成熟提供保障(Guoetal., 2014; Wuetal., 2016, 2018)。此外,JH還可通過LCMT1-PP2A-FOXO途徑誘導細胞周期相關(guān)基因Cdc2和Orc5的表達促進脂肪體細胞多倍體化,從而調(diào)控Vg合成以及卵巢成熟(Wuetal., 2020)。在完全變態(tài)昆蟲赤擬谷盜雌蟲中,RNAi降低Met或JHAMT的表達也發(fā)現(xiàn)可導致脂肪體中Vg的表達量下降。并且JH-Met調(diào)控Vg的表達被證明是通過促進胰島素樣肽(insulin-like peptides, ILPs)信號通路中ILP2和ILP3的表達后,磷酸化FOXO,使得FOXO出核,從而誘導Vg表達。RNAi降低Met或JHAMT導致ILP表達量下降,從而使得FOXO定位在細胞核內(nèi),FOXO通過與Vg啟動子上的FOXO反應元件結(jié)合抑制Vg表達(Shengetal., 2011)。埃及伊蚊中的研究發(fā)現(xiàn)JH-Met還可通過上調(diào)E75來調(diào)控miR-2940-3p的表達,進而影響卵巢濾泡細胞形成及卵子成熟(Aksoy and Raikhel, 2021)。果蠅中,如前所述Met27或gce2.5K的產(chǎn)卵能力顯著下降(Abdouetal., 2011),這一表型近期被證明是由于大量成熟卵子積累在卵巢中不能排出所致(Luoetal., 2021)。利用來源于果蠅Kr-h1啟動子區(qū)域中一段JH反應區(qū)域(JH response region,JHRR)構(gòu)建的JHRR-LacZ果蠅來指示JH胞內(nèi)信號(Heetal., 2014),發(fā)現(xiàn)JH胞內(nèi)信號在果蠅卵巢肌肉細胞以及成蟲脂肪體中活躍。RNAi分別降低卵巢肌肉細胞或成蟲脂肪體中Met、gce或Kr-h1的表達可顯著降低果蠅產(chǎn)卵率,伴隨大量成熟卵子在卵巢積累從而使得卵巢增大,該表型類似Met27或gce2.5K果蠅。進一步分析發(fā)現(xiàn),Met、gce或Kr-h1RNAi后導致參與組裝卵巢肌肉細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的Laminin和Collagen IV的相關(guān)基因mRNA表達量分別在卵巢肌肉細胞和成蟲脂肪體中降低,使得ECM組裝受損,從而導致卵巢肌肉收縮缺陷,引起排卵障礙(Luoetal., 2021)。此外,該團隊還發(fā)現(xiàn)JH信號在維持卵巢生殖干細胞的數(shù)量方面具有重要的作用。Met27、gce2.5K或JHAMT突變體果蠅,以及在卵巢帽細胞中特異性降低Met或Gce的表達均可導致卵巢生殖干細胞的數(shù)量隨著果蠅成蟲發(fā)育逐漸降低(Luoetal., 2020)。

JH對昆蟲生殖滯育的調(diào)控同樣是通過Met來實現(xiàn)的。具有生殖滯育特性的雌成蟲在受到光周期或溫度等外部環(huán)境刺激后,咽側(cè)體停止合成JH,低水平的JH通過抑制Vg的表達以抑制卵巢發(fā)育,從而促進滯育的發(fā)生。RNAi降低Met的表達可獲得類似的表型(Smykaletal., 2014a; Liuetal., 2016; Maetal., 2021)。此外,JH還可通過Met抑制昆蟲免疫(Schwenke and Lazzaro, 2017; Changetal., 2021)、維持腸道細胞平衡(Rahmanetal., 2017)、促進脂質(zhì)積累(Wangetal., 2017b)、交配(Bilenetal., 2013)以及等級分化(Masuokaetal., 2015; Masuokaetal., 2018)等來間接調(diào)控昆蟲生殖。

值得注意的是,有些昆蟲中含有2個Met基因,它們在介導JH對昆蟲生理調(diào)控過程中的作用并不是完全一致的。如家蠶中的BmMet1和BmMet2,其中BmMet1不含內(nèi)含子,BmMet2含有9個內(nèi)含子并且各內(nèi)含子所處位置與DmGce和TcMet類似(Guoetal., 2012; Kayukawaetal., 2012)。不同于DmMet與DmGce在幼蟲變態(tài)發(fā)育過程中功能冗余,BmMet1和BmMet2在家蠶幼蟲發(fā)育階段過程中功能完全不同。Diamon等(2015)利用TALEN介導的基因編輯技術(shù)分別獲得BmMet1和BmMet2突變體,發(fā)現(xiàn)BmMet1突變體發(fā)育延遲,大部分在2～3齡幼蟲蛻皮階段死亡,并且在3齡幼蟲T2和T3胸節(jié)隆起處的表皮可觀察到點狀的蛹殼特征。同樣,近期利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得的BmMet1突變體也觀察到在3齡幼蟲的表皮中出現(xiàn)幼蟲-蛹嵌合體的表型(Cuietal., 2021);然而BmMet2突變體卻可正常羽化并可育,未表現(xiàn)出任何異常表型,表明在家蠶幼蟲階段主要是BmMet1作為JH受體介導JH對家蠶幼蟲變態(tài)發(fā)育調(diào)控(Daimonetal., 2015)。然而與體內(nèi)試驗不同的是,在人腎上皮細胞HEK293T中的單雜交報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)JH可激活BmMet2-Gal4DBD誘導UAS報告基因的表達,而對BmMet1-Gal4DBD不產(chǎn)生效果;并且JH可促進BmMet2與共激活因子Taiman/SRC結(jié)合后作用于JHRE,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用(Kayukawaetal., 2012; Kayukawa and Shinoda, 2015)。由此可見BmMet1和BmMet2均可作為JH受體參與JH信號傳遞。轉(zhuǎn)錄表達分析發(fā)現(xiàn),在家蠶胚胎及幼蟲階段,BmMet2的mRNA表達水平顯著低于BmMet1,但在蛹后期階段,BmMet2的mRNA表達水平逐漸升高并在成蟲階段達到高峰(Kayukawa and Shinoda, 2015),因此推測BmMet1與BmMet2分別介導JH對家蠶不同發(fā)育階段的調(diào)控,BmMet1是JH拮抗幼蟲變態(tài)所必需,而BmMet2參與JH調(diào)控成蟲生殖。近期,進化分析表明BmMet1是家蠶馴化過程中的1個候選馴化基因(Xiangetal., 2018),在家蠶幼蟲腦發(fā)育及馴化中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),BmMet1突變體的大腦發(fā)育滯后,且顯著小于野生型家蠶大腦。分子進化分析表明,在人工選擇過程中家蠶BmMet1第210位天冬氨酸取代了野桑蠶BombyxmandarinaMet的組氨酸,導致BmMet1結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而降低了BmMet1的轉(zhuǎn)錄活性,最終使得家蠶腦中與BmMet1共表達的基因網(wǎng)絡(luò)弱于野桑蠶(Cuietal., 2021)。

果蠅DmMet與DmGce雖然均可作為JH受體發(fā)揮功能冗余的作用。然而JH調(diào)控果蠅成蟲視神經(jīng)分化以及交配行為等過程主要是通過DmMet來實現(xiàn),DmGce突變對上述生理過程并不產(chǎn)生顯著影響(Riddifordetal., 2010; Riddiford, 2012; Bilenetal., 2013)。如Met27果蠅可以像JH缺失果蠅一樣引起預蛹期視葉和成蟲盤中EcR-B1的提前表達,使得成蟲視葉光感受器神經(jīng)元提早分開,導致果蠅成蟲視葉形態(tài)異常。而gce2.5K果蠅既不能引起EcR-B1提前表達,也不造成視葉發(fā)育異常(Riddifordetal., 2010; Riddiford, 2012)。此外,Met27果蠅和JH缺失果蠅的雌蟲交配起始時間延遲,而Gce突變后對交配時間不產(chǎn)生影響(Bilenetal., 2013)。這一功能上的差異可能與二者組織差異性表達有關(guān)。Baumann等(2017)利用細菌人工染色體重組技術(shù)以及knock-in轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別獲得DmMet-GAL4以及DmGce-GAL4果蠅品系用于分別檢測DmMet及DmGce的時空表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DmMet在幼蟲和成蟲視葉中廣泛表達,但DmGce的表達卻完全檢測不到;此外,雖然二者在卵母細胞發(fā)育的第8-10階段的濾泡細胞中均有表達,但DmGce的表達弱于DmMet;在與行為密切相關(guān)的中央神經(jīng)系統(tǒng)中,二者的表達也存在一定的差異(Baumannetal., 2017)。

2 胞內(nèi)受體Met在JH激動劑及拮抗劑篩選中的應用

目前市面上大約合成有4 000多種JH激動劑,其中一些激動劑被廣泛用作殺蟲劑。傳統(tǒng)篩選JH激動劑作為殺蟲劑的方法,主要是基于蟲體或組織上的生測反應等形態(tài)學觀察。但這種方法一方面無法進行大規(guī)模篩選,另一方面可重復性不強。JH受體的鑒定使得體外高效篩選JH激動劑成為可能?；贛et作為JH的受體以及JH-Met/Tai-Kr-h1信號傳遞模式,研究者已陸續(xù)在昆蟲細胞、哺乳動物細胞以及酵母中開發(fā)構(gòu)建了多種報告基因分析系統(tǒng)(Reporter gene assay,RGA),用于高通量篩選天然JH以及人工合成的JH激動劑或拮抗劑,同時可用于分析相關(guān)化合物的功能結(jié)構(gòu)(Chungetal., 2011; Leeetal., 2015; Miyakawa and Iguchi, 2017; Leeetal., 2018; Bittovaetal., 2019; Jindra and Bittova, 2020; Kayukawaetal., 2020; Yokoietal., 2020; Ito-Harashimaetal., 2021; Kayukawaetal., 2021)。RGA系統(tǒng)的核心部分是由Met、Tai以及報告基因組成,利用JH可促進Met與Tai結(jié)合形成功能受體復合物后驅(qū)動報告基因的表達的原理,來實現(xiàn)對JH激動劑或拮抗劑的研究或篩選。目前已報道的RGA系統(tǒng)主要有四大類:(1)在昆蟲細胞中同時過表達Met、Tai以及JHRE報告基因載體,或利用昆蟲細胞系內(nèi)源性Met和Tai僅過表達JHRE報告基因載體;(2)在哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CHO和人腎上皮細胞HEK293T)中利用雙雜交熒光素酶分析系統(tǒng)(Two-hybrid luciferase assay),即將Met和Tai分別與VP16激活結(jié)構(gòu)域(VP16 activation domain,VP16AD)和GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GAL4 DNA binding domain,GAL4DBD)偶聯(lián),同時引入可被GAL4DBD結(jié)合的報告基因載體;(3)在HEK293T中同時過表達Met、Tai以及JHRE報告基因載體;(4)在酵母細胞中同時過表達Met、Tai以及JHRE報告基因載體。

Miyakawa等(2017)利用(2)中的方法對比Met/SRC復合體對黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、埃及伊蚊、赤擬谷盜3種昆蟲以及甲殼動物淡水水蚤Daphniapulex的4種幼蟲同對JH激動劑的敏感度。研究發(fā)現(xiàn),3種昆蟲對JH III的敏感度顯著高于淡水水蚤,并證明這一差異與節(jié)肢動物進化過程中Met序列中的一個關(guān)鍵氨基酸殘基有關(guān),而與共激活因子Tai無關(guān)。在甲殼動物中這一氨基酸為蘇氨酸,而昆蟲中為纈氨酸。將甲殼動物Met這一位點的蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸可顯著提高對JH的響應(Miyakawaetal., 2013)。Bittova等(2019)分別利用(1)、(2)中的方法構(gòu)建了基于果蠅S2細胞以及HEK293T的RGA系統(tǒng),并對昆蟲內(nèi)源性JH(JH I、JH III、JHB3)以及這些內(nèi)源性JH非活性的異構(gòu)體進行分析,發(fā)現(xiàn)JH化學結(jié)構(gòu)骨架中的C-C二酯鍵的立體構(gòu)象(尤其是2,3位)對JH與Met的結(jié)合以及Met轉(zhuǎn)錄活性的激活至關(guān)重要,其次是位于N端的環(huán)氧化基團的手性構(gòu)象。隨后,Yokoi等(2020)利用(3)中方法也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果,并且進一步發(fā)現(xiàn)延伸JH化學結(jié)構(gòu)中C3位上的取代基或增加酯烷基可顯著降低或破壞JH的活性。很顯然,以上研究為今后人工合成新型高效的JH激動劑提供了有利的理論基礎(chǔ)。近期Ito-Harashima等(2021)利用酵母的易操作、快速繁殖以及經(jīng)濟廉價等特點構(gòu)建了(4)中的酵母RGA系統(tǒng)用于檢測各類JH激動劑的活性?；诎霐?shù)有效濃度(50% effective concentration, EC50)的對比,發(fā)現(xiàn)雖然該系統(tǒng)的敏感度不如Bittova等構(gòu)建的HEK293T細胞上的RGA系統(tǒng),但顯著高于S2細胞以及CHO細胞上建立的RGA。因此,該系統(tǒng)可作為大規(guī)模篩選JH激動劑的有利工具。但由于酵母細胞壁的低滲透性使得該系統(tǒng)對親水性的化合物不兼容,因此,利用該系統(tǒng)對親水性的JH激動劑進行篩選將存在一定的限制。

同理,Lee等(2015)基于JH可促進Met與CYC結(jié)合,借助酵母雙雜交系統(tǒng)及β-半乳糖苷酶定量分析,篩選可阻斷由JH類似物pyriproxyfen誘導的Met-CYC結(jié)合的JH拮抗劑,最終從1 651種植物次級代謝物中獲得5種具有JH拮抗劑活性的二萜烯類化合物(Leeetal., 2015)。此外,該研究團隊從171種植物精油化合物中篩選獲得4種含醛類功能團的JH拮抗劑及4種含酯類功能團的JH激動劑(Leeetal., 2018)。近期Kayukawa等(2020,2021)在家蠶BmN細胞系上構(gòu)建可同時穩(wěn)定表達由JHRE驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶以及由BmA3啟動子驅(qū)動的海腎熒光素酶的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系BmN-JF&AR。利用該細胞系對東京大學化學藥品庫的核心庫中的9 600種化合物進行高通量篩選,通過4步篩選獲得69個候選JH拮抗劑及10個候選JH激動劑。進一步通過對家蠶蟲體處理的表型觀察以及表皮離體培養(yǎng)后Kr-h1的轉(zhuǎn)錄表達水平的檢測,最終發(fā)現(xiàn)編號為JHSI48的化合物為一種新型的JH拮抗劑(Kayukawaetal., 2020),而其中7種候選JH激動劑可延遲家蠶末齡幼蟲變態(tài)(Kayukawaetal., 2021)。

除了利用各種RGA系統(tǒng)對JH拮抗劑或激動劑進行高通量的實驗篩選,Yokoi等(2021)開發(fā)了一套基于果蠅Met蛋白結(jié)構(gòu)模型的計算機模擬系統(tǒng),從500萬種化合物中篩選到11個候選JH激動劑。利用上述(3)中的RGA系統(tǒng)進行實驗確認,最終發(fā)現(xiàn)1種結(jié)構(gòu)與已往鑒定的JH激動劑不同的含哌嗪環(huán)的新型JH激動劑(Yokoietal., 2021)。由此可見,JH受體的鑒定以及JH信號傳遞途徑的解析極大地促進了JH拮抗劑及激動劑的挖掘。

3 JH膜受體信號通路研究進展

JH除通過結(jié)合胞內(nèi)受體Met來發(fā)揮作用,還可通過膜受體途徑調(diào)控昆蟲的生理過程。早期果蠅中的研究發(fā)現(xiàn),對離體培養(yǎng)的雄性果蠅副性腺施加JH可促進蛋白質(zhì)的快速合成,并且JH對蛋白質(zhì)合成的促進作用依賴于培養(yǎng)基中Ca2+和佛波酯對PKC的激活。在PKC活性缺失的果蠅突變體中,JH促進蛋白質(zhì)合成的作用消失。該結(jié)果表明,某個膜受體介導了JH對蛋白質(zhì)的合成,并且該信號傳遞過程中涉及Ca2+和PKC (Yamamotoetal., 1988)。

隨后有關(guān)JH膜受體的大量研究工作轉(zhuǎn)為以昆蟲卵母細胞為研究對象。在成蟲卵黃發(fā)生過程中,JH通過胞內(nèi)受體復合物Met/Tai促進Vg在脂肪體中合成,脂肪體中合成的Vg經(jīng)血淋巴循環(huán)到卵巢,再經(jīng)由卵母細胞外圍濾泡細胞之間的間隙(稱為patency)到達卵母細胞表面,最后在卵母細胞表面Vg受體(Vg receptor,VgR)介導的內(nèi)吞作用下被卵母細胞吸收(Raikhel and Dhadialla, 1992; Valle, 1993; Wangetal., 2017a; Wuetal., 2020)。早期實驗發(fā)現(xiàn),對吸血蝽的卵巢體外施加JH,可迅速降低濾泡細胞的體積而使濾泡細胞之間的間隙增大,從而有利于Vg的進入。這一過程被認為是由JH與位于濾泡細胞膜上的蛋白結(jié)合所介導的。進一步藥物抑制實驗發(fā)現(xiàn),JH可通過與細胞膜上的蛋白結(jié)合激活PKC,PKC又通過磷酸化Na+/K+ATPase的α亞基來傳遞JH信號,最終調(diào)控濾泡細胞的間隙(Ilenchuk and Davey, 1983;Sevala and Davey, 1993;Webbetal., 1997;Pszczolkowskietal., 2005)。然而與JH結(jié)合的膜蛋白究竟是哪類蛋白卻不清楚。

隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展,JH膜受體的信號通路研究逐漸取得新的進展。Jing等(2018)在飛蝗中利用RNAi技術(shù)降低Na+/K+ATPase α亞基的表達可阻礙JH誘導的卵母細胞對Vg的吸收,導致卵巢發(fā)育缺陷,該實驗從分子水平上證明Na+/K+ATPase在JH調(diào)控Vg進入卵母細胞過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Jingetal., 2018)。進一步研究發(fā)現(xiàn)JH可通過GPCR/RTK-PLC-IP3R-PKC信號通路磷酸化Na+/K+-ATPase的α亞基的第8位絲氨酸,從而激活Na+/K+-ATPase的活性,進而誘導patency的發(fā)生,最終促進Vg轉(zhuǎn)運至成熟卵母細胞(Jingetal., 2018)。近期該團隊進一步解析了JH調(diào)控patency的分子機制。JH通過GPCR、小G蛋白細胞分裂周期蛋白42(small GTPase Cell division cycle 42, Cdc42)和非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C, aPKC)信號通路激發(fā)細胞極性蛋白Par3磷酸化,使得濾泡細胞之間的黏著小帶解聚,進而增大濾泡細胞的間隙,最終促進Vg轉(zhuǎn)運至卵母細胞(Zhengetal., 2022)。利用轉(zhuǎn)錄組學在雌性飛蝗卵巢中已鑒定到22個GPCRs,RNAi篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低LGR4、Oct/TyrR、OR-A1、OR-A2、mAChR-C和CirlL這6個GPCRs的表達可導致卵母細胞中Vg的累積減少,阻礙卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟。其中LGR4和Oct/TyrR被證明可能與脂肪體中Vg合成相關(guān),而OR-A1、OR-A2、mAChR-C以及CirlL在Vg轉(zhuǎn)運及吸收過程中發(fā)揮重要的作用(Zhengetal., 2021)。此外,JH還可通過GPCR-PLC-PKC-ι途徑磷酸化VgR,使VgR由卵母細胞的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞膜上,從而與穿過濾泡細胞間隙到達卵母細胞表面的Vg結(jié)合,介導Vg的內(nèi)吞(Jingetal., 2021)。除飛蝗中取得的大量研究進展,赤擬谷盜中GPCRs的RNAi篩選實驗發(fā)現(xiàn)多巴胺D2樣受體(Dopamine D2-like receptor,Dop2R)參與JH對濾泡細胞間隙的調(diào)控。類似于飛蝗中的研究結(jié)果,RNAi降低Dop2R的表達導致赤擬谷盜卵泡中Vg的積累降低、卵巢發(fā)育延遲、雌蟲繁殖力以及幼蟲孵化率顯著下降。并且體外實驗發(fā)現(xiàn)JH可以通過濃度依賴性方式抑制超表達Dop2R的HEK293細胞內(nèi)cAMP的濃度(Bai and Palli, 2016)。值得注意的是,赤擬谷盜及飛蝗中GPCRs的RNAi篩選也發(fā)現(xiàn)一些GPCRs參與JH對Vg合成的調(diào)控(Bai and Palli, 2016; Zhengetal., 2021),這暗示著膜受體和胞內(nèi)受體可能協(xié)同介導JH的信號傳導。

如前所述,埃及伊蚊以及棉鈴蟲中的研究發(fā)現(xiàn)JH可通過磷酸化Met和/或Tai,以增強Met-Tai二聚體的形成及Met-Tai與JHRE的結(jié)合,從而促進JH對Kr-h1的誘導表達(Liuetal., 2015; Ojanietal., 2016; Lietal., 2021)。RNAi及藥物抑制實驗發(fā)現(xiàn),當PLC、CaMKⅡ或PKC失活時,Met-Tai與JHRE的結(jié)合能力顯著降低,從而阻礙了JH的信號傳導(Liuetal., 2015; Ojanietal., 2016)。由此可見,JH膜受體和胞內(nèi)受體介導的JH信號最終在調(diào)控細胞核內(nèi)Met-Tai復合體的轉(zhuǎn)錄活性中產(chǎn)生交集,二者共同促進下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。然而,值得一提的是,藥物抑制實驗結(jié)果表明,雙翅目昆蟲的JH-膜受體傳導途徑中的膜受體更傾向于是RTK而不是GPCR (Liuetal., 2015)。此外,該團隊發(fā)現(xiàn)在埃及伊蚊成蟲羽化時,JH可通過RTK-PI3K-Akt途徑促進絲氨酸/精氨酸富集剪切因子(Serine/Arginine-rich splicing factors,SRSFs)的磷酸化,進而誘導Taipre-mRNA可變剪切形成A和B兩種亞型。這兩種亞型可作為EcR/USP的共激活因子促進20E信號,從而為后期雌蟲吸血后20E誘導Vg的合成做準備(Liuetal., 2018a)。Kr-h1作為JH-Met/Tai信號通路中的效應分子,近期研究發(fā)現(xiàn),JH還可通過促進Kr-h1磷酸化來誘導核糖體蛋白L36的表達從而促進脂肪體中Vg合成(Wuetal., 2021)。早期棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)JH可通過GPCR/PLC/PKC通路引起B(yǎng)r的磷酸化來拮抗20E誘導的變態(tài)(Caietal., 2014)。以上結(jié)果表明JH膜信號可與胞內(nèi)信號通路在多途徑中發(fā)生協(xié)同作用。

除與胞內(nèi)受體協(xié)同介導JH信號傳遞,JH膜受體被證實還可獨立于胞內(nèi)受體發(fā)揮作用。借助果蠅遺傳優(yōu)勢,Gao等(2022)在Met/gce雙缺失果蠅(Met27gce2.5K)背景下發(fā)現(xiàn)JH仍可通過RTK-PLC-PKC途徑使USP第35位絲氨酸被磷酸化,進而誘導ecdysone合成通路中Halloween基因的表達,從而最終增強20E的作用保證果蠅的正常生長發(fā)育(Gaoetal., 2022)。綜上所述,JH信號傳導既涉及胞內(nèi)受體,又需要膜受體的參與,以及膜受體與胞內(nèi)受體的協(xié)同作用。因此,膜受體的解析將為進一步深入了解JH的生理作用打開一個新的局面。

4 小結(jié)與展望

JH在昆蟲發(fā)育、變態(tài)、生殖以及行為等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用,很顯然這些作用必須通過其受體介導傳遞。近年來結(jié)合果蠅、赤擬谷盜、家蠶以及其他不完全變態(tài)昆蟲中的研究,已證實Met(果蠅中包含Gce)可與生理濃度JH結(jié)合,作為JH的胞內(nèi)受體通過與bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子Tai或CYC結(jié)合形成功能受體復合物后直接結(jié)合JH靶基因(如Kr-h1,ET,Hairy)啟動子區(qū)域的JHRE來促進靶基因的轉(zhuǎn)錄表達,進而介導JH抑制昆蟲變態(tài)以及促進生殖等。功能研究發(fā)現(xiàn),MetRNAi或Met突變體的表型類似JH缺失表型。此外,Met/Tai磷酸化修飾以及Hsp83對Met亞細胞定位的調(diào)控等影響Met轉(zhuǎn)錄活性因素的研究也取得了一定的突破。基于Met作為JH受體,一系列報告系統(tǒng)被開發(fā)用于篩選分析JH激動劑或拮抗劑。與此同時,有關(guān)JH膜受體信號通路的研究也逐漸明朗化。JH可能既通過GPCRs又通過RTK途徑發(fā)揮作用。同時,JH可通過膜受體途徑與核受體信號交互作用協(xié)同發(fā)揮功能。

盡管如此,有關(guān)JH及其受體的研究仍存在眾多亟待解決的問題。例如,目前大量研究表明阻斷JH的合成或其信號傳遞并不能引起昆蟲在早期發(fā)育階段提前變態(tài),其原因被認為可能是昆蟲早期幼蟲體內(nèi)缺乏變態(tài)所需的“感受態(tài)因子(Competence factor)”。Inui等(2017)通過將剛孵化出的1齡家蠶或2齡家蠶表皮移植至末齡幼蟲上,可在末齡幼蟲變態(tài)為蛹時觀察到移植的表皮中出現(xiàn)蛹表皮,表明在末齡幼蟲體內(nèi)存在“感受態(tài)因子”,并且該“感受態(tài)因子”可被JH所阻斷。然而究竟該“感受態(tài)因子”是什么?受哪些因素調(diào)控?其時空表達如何?以及“感受態(tài)因子”如何使昆蟲具備變態(tài)的能力?目前仍不得而知。此外,在Met轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控方面,除Tai和CYC以外,是否存在其他bHLH-PAS蛋白與Met結(jié)合參與JH信號傳遞,以及它們相互作用的分子機制?Met磷酸化修飾是否影響Met入核?除磷酸化修飾,Met是否還具有其他翻譯后修飾,以及這些修飾對Met功能有何影響?關(guān)于JH膜受體,目前篩選到的各種GPCRs究竟是否是真實的JH膜受體?為什么在飛蝗、赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)GPCRs類膜蛋白可能為JH膜受體,而在雙翅目埃及伊蚊以及果蠅中卻發(fā)現(xiàn)是RTK類蛋白介導JH的膜信號傳遞?這一差異是否是由于雙翅目在物種進化中引起的,還是由于GPCRs和RTK分別介導了JH的不同生理調(diào)控功能?JH膜受體的身份究竟是什么?對這些問題的解析將有助于我們進一步了解JH的分子作用機制,為更好地利用益蟲以及尋找害蟲防治的新靶點、新方法奠定理論基礎(chǔ)。此外,雖然在細胞水平上利用各種報告系統(tǒng)篩選獲得大量的JH拮抗劑和激動劑,但這些拮抗劑和激動劑是否能與Met結(jié)合,以及在蟲體水平上是否具有功能仍有待深入研究。JH受體晶體結(jié)構(gòu)的解析,必將極大地促進新型JH拮抗劑和激動劑的開發(fā)設(shè)計,為真正實現(xiàn)綠色害蟲防治提供新途徑。