一種基于線粒體分離純化技術(shù)的新型線粒體DNA深度測序方法*

朱玉青,朱琳,黃明濤,胡平,沈彬,梁棟,許爭峰(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心,南京 0004;.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,南京 66)

線粒體是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等重要功能的細(xì)胞器,擁有一套獨立于細(xì)胞核基因組的遺傳物質(zhì),即線粒體基因組(mtDNA)[1]。人線粒體基因組是1個長度為16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子,以多拷貝的形式存在于細(xì)胞中。mtDNA由于缺少DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),故而較之細(xì)胞核基因組更易產(chǎn)生突變[2],并且mtDNA突變可通過母系遺傳的方式傳遞至子代中[3]。由于線粒體基因組上的致病性突變可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的線粒體代謝相關(guān)遺傳性疾病[4],因此對全線粒體基因組的高通量測序在線粒體遺傳病的診斷和深入研究十分重要。但是,mtDNA突變往往具有異質(zhì)性[5],且在細(xì)胞核基因組中存在同源序列[6],上述特點給全線粒體基因組的特異性深度測序帶來了額外的困難。本研究旨在建立了一種基于線粒體分離技術(shù)的mtDNA文庫構(gòu)建和測序方法,以期實現(xiàn)特異性針對線粒體基因組的深度測序。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 Thermo ST16離心機(jī)(美國Thermo公司),Microfuge 20R 4 ℃離心機(jī)(德國Beckman公司),ABI Veriti PCR儀(美國ABI公司),CELDOC XR凝膠圖像分析儀(美國Bio-Rad公司),Qubit 3.0熒光計(美國Invitrogen公司),A63880 AMPure XP磁珠(德國Beckman公司)。Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液、SepMate離心管(加拿大Stemcell公司),NP40裂解液、Tween-20(美國Sigma-Aldrich公司),RSB裂解液[配制:500 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),100 μL 10 mmol/L NaCl,150 μL 3 mmol/L MgCl2,混勻后加ddH2O定容至50 mL],2×TD 緩沖液[配制:2 mL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6),1 mL 10 mmol/L MgCl2,20 mL mmol/L 20%二甲基甲酰胺(DMF),混勻后加ddH2O定容至100 mL],ExoV核酸外切酶(英國NEB公司),PCR擴(kuò)增試劑盒、Tn5轉(zhuǎn)座酶試劑盒、雙端測序標(biāo)簽(Index)文庫制備試劑盒(南京諾唯贊公司),DNA純化試劑盒(美國Zymo公司)。

1.2樣本收集、mtDNA獲取及分離純化 收集2022年于本院志愿體檢健康者的外周靜脈血樣本1 mL,室溫保存于EDTA-K2抗凝管中。在8 h內(nèi)采用SepMate離心管,按照Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液說明書分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。設(shè)置4個PBMC的裂解條件進(jìn)行分組:條件1為含5% NP40和1% Tween-20的RSB裂解液;條件2為含5% NP40,不含Tween-20的RSB裂解液;條件3為含1% NP40和1% Tween-20的RSB裂解液;條件4為含1% NP40,不含Tween-20的RSB裂解液。向PBMC中加入15 μL裂解液,冰上裂解3 min,4 ℃、12 000×g離心5 min,立即吸取9.5 μL上清液至新的1.5 mL EP管內(nèi)。根據(jù)ExoV核酸外切酶說明書操作,在上清液中加入1.2 μL緩沖液,1.2 μL ATP和1 μL ExoV,37 ℃反應(yīng)30 min, 70 ℃反應(yīng)30 min使ExoV滅活,即得到分離純化后的mtDNA。

1.3分離純化后mtDNA的純度驗證 針對核基因組18S rRNA、28S rRNA基因和線粒體基因組m.8363及m.13513位點設(shè)計引物,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括分離純化后的mtDNA 2 μL,2×Taq Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL(引物濃度為10 μmol/L),加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,對反應(yīng)產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)是否可見相應(yīng)片段大小的條帶定性判斷模板DNA中有無核基因組DNA或線粒體基因組DNA。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.4建立全線粒體基因組測序文庫 在分離純化后的mtDNA中加入12.4 μL 2×TD 緩沖液,0.5 μL Tn5,70 ℃反應(yīng)30 min,將mtDNA片段化;使用DNA純化試劑盒對片段化mtDNA進(jìn)行純化,使用雙端測序Index文庫制備試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)加接頭引物,PCR體系為20 μL,包括純化后的mtDNA 6 μL,上、下游接頭引物各2 μL,5×TAB 5 μL,TAE 0.5 μL,加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL;PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)18次;4 ℃保存。對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2輪磁珠回收,取1 μL 回收產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,若可見185～2 000 bp大小的彌散條帶則認(rèn)為得到合格測序子文庫。

1.5高通量測序及數(shù)據(jù)分析 使用Qubit 3.0熒光計測定子文庫的濃度,等量混合得到測序文庫。通過Illumina NovaSeq 6000測序系統(tǒng)進(jìn)行測序,測序策略采用150 bp雙端測序法。測序下機(jī)數(shù)據(jù)使用Trim galore、Bowtie2等生物信息學(xué)軟件完成序列分析和比對,通過GATK標(biāo)準(zhǔn)化線粒體基因組SNP/Indel變異檢測流程進(jìn)行變異位點分析。設(shè)置質(zhì)量控制參數(shù)包括:每個樣本數(shù)據(jù)產(chǎn)出量(Clean bases數(shù))>0.4 G,堿基質(zhì)量值Q30>80,線粒體reads數(shù)占比>20%,平均測序深度>5 000×。

1.6Sanger測序 針對樣本4 m.10559A>G、m.10398A>G、m.10400C>T位點設(shè)計引物,引物序列見表1。 PCR體系為50 μL,包括DNA模板2 μL,2×Taq Master Mix 25 μL,10 μmol/L上、下游引物各2 μL,加入ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送上海華大公司測序驗證,Sanger測序試劑及儀器由美國 Applied Biosystems 公司提供。

2 結(jié)果

2.1mtDNA分離純化的最優(yōu)條件及測序結(jié)果 對本研究設(shè)置的4個分離純化mtDNA的條件進(jìn)行驗證,電泳結(jié)果顯示,陽性對照4條泳道全部擴(kuò)增出,陰性對照4條泳道均未擴(kuò)增出;條件1～3經(jīng)PCR 擴(kuò)增35個循環(huán)后,除擴(kuò)增出線粒體基因組外,仍額外擴(kuò)增出核基因組18S rRNA、28S rRNA;而條件4僅擴(kuò)增出線粒體基因組(圖1)。

注:瓊脂糖凝膠電泳對分離純化后mtDNA純度的驗證,其中條件1為5% NP40+1% Tween-20;條件2為5% NP40,不含Tween-20;條件3為1% NP40+1% Tween-20;條件4為1% NP40,不含Tween-20;陽性對照模板為全基因組DNA,陰性對照未加模板;泳道1,核基因組18S rRNA;泳道2,核基因組28S rRNA;泳道3,線粒體基因組m.8363位點;泳道4,線粒體基因組m.13513位點。圖1 對分離純化后mtDNA純度的電泳驗證結(jié)果

在條件4下,對6例PBMC建庫樣本進(jìn)行mtDNA文庫構(gòu)建及深度測序,結(jié)果顯示6例樣本測序結(jié)果中,數(shù)據(jù)產(chǎn)出量最低可達(dá)0.45 G,堿基質(zhì)量值Q30均在85以上,mtDNA reads數(shù)占比最高可達(dá)92%,平均測序深度最高超過20 000×(表2)。

表2 6例PBMC建庫樣本測序結(jié)果

2.2同質(zhì)性和異質(zhì)性變異位點的驗證結(jié)果 對6例樣本的測序結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析,每例樣本均可檢出若干同質(zhì)性變異(表3、表4),其中樣本4檢出1個異質(zhì)性變異(m.10559A>G,突變率為17%),經(jīng)Sanger測序驗證,該樣本確實存在相應(yīng)的異質(zhì)性變異。同時,針對該樣本選取數(shù)個同質(zhì)性變異位點進(jìn)行Sanger測序驗證,結(jié)果均可檢出相應(yīng)變異(圖2)。

注:A,m.10559A>G為異質(zhì)性變異,異質(zhì)度為17%;B,Sanger測序顯示m.10559A>G為異質(zhì)性變異;C,m.8701A>G為同質(zhì)性變異;D,Sanger測序顯示m.8701A>G為同質(zhì)性變異;E,m.10398A>G為同質(zhì)性變異;F,Sanger測序顯示m.10398A>G為同質(zhì)性變異;G,10400C>T為同質(zhì)性變異;H,Sanger測序顯示m.10400C>T為同質(zhì)性變異。圖2 Sanger測序驗證樣本4中的變異位點

表3 1～3號建庫樣本所有同質(zhì)性和異質(zhì)性變異

表4 4～6號建庫樣本所有同質(zhì)性和異質(zhì)性變異

3 討論

本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了一種基于線粒體分離純化的全線粒體基因組深度測序方法,并通過核質(zhì)分離的方式來實現(xiàn)非PCR富集mtDNA。通過擴(kuò)增核基因組18S rRNA、28S rRNA以及線粒體基因組m.8363和m.13513位點檢測mtDNA分離后的純度,證明本方法可獲得較高純度的mtDNA,有效避免了文庫中出現(xiàn)細(xì)胞核DNA及“核線粒體同源序列”的干擾;通過Sanger測序,筆者進(jìn)一步驗證了本方法所檢出的同質(zhì)性變異和異質(zhì)性變異的準(zhǔn)確性,表明構(gòu)建的深度測序方法結(jié)果準(zhǔn)確可信。然而,本方法仍存在一定局限性:在核質(zhì)分離時需要保證細(xì)胞核的完整,因此,檢測時需要使用采血8 h內(nèi)的新鮮外周血,而不可使用凍存的血細(xì)胞樣本。此外,在受檢樣本類型為非外周血細(xì)胞時(如尿液細(xì)胞、肌肉組織、腫瘤組織等),本方法的有效性尚不明確,需在后續(xù)工作中展開進(jìn)一步研究,以獲得相應(yīng)結(jié)論。

線粒體是真核生物細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一,其攜帶的線粒體基因組具有多拷貝、易突變等特征,對線粒體發(fā)揮正常生理功能至關(guān)重要。因此,獲得高質(zhì)量的mtDNA序列信息在臨床和科研中具有重要價值。傳統(tǒng)的Sanger測序方法是針對特定位點檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[7],但受測序長度限制,Sanger測序很難應(yīng)用于全線粒體基因組測序,且無法分辨低異質(zhì)度的變異位點。隨著高通量測序技術(shù)[8]的出現(xiàn),對全線粒體基因組進(jìn)行深度測序已成為獲得mtDNA序列信息的最優(yōu)方法。目前,主流的全線粒體基因組高通量測序策略包括全基因組測序策略和mtDNA富集策略。全基因組測序策略通過篩選、拼裝全基因組測序[9]或外顯子測序[10]的數(shù)據(jù)中比對線粒體基因組上的reads,獲得全線粒體基因組的序列信息,但是該策略成本較高,難以大規(guī)模應(yīng)用,且測序結(jié)果難以排除核基因組同源序列的干擾。mtDNA富集策略主要包括長片段PCR富集法和特異性探針捕獲法。長片段PCR富集法[11]通過兩對或多對引物擴(kuò)增全線粒體基因組,再將擴(kuò)增得到的長片段mtDNA打斷進(jìn)行深度測序,這種方法可以對全線粒體基因組進(jìn)行深度測序,但是同樣受到潛在的核基因組同源序列干擾。此外,長片段PCR經(jīng)常存在擴(kuò)增失敗的情況,而PCR本身存在的偏好性也會對異質(zhì)性變異的測序結(jié)果造成影響。特異性探針捕獲法[12]需要設(shè)計大量與mtDNA互補(bǔ)的寡核苷酸探針,通過PCR加接頭引物來富集mtDNA片段進(jìn)行深度測序,此方法相對復(fù)雜,且同樣無法避免核基因組同源序列的干擾。相比于以上方法的優(yōu)缺點,本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了一種基于線粒體分離純化技術(shù)的全線粒體基因組深度測序的方法,通過核質(zhì)分離,可有效獲得mtDNA特異性文庫。本方法整個實驗流程通過非PCR的方式來富集mtDNA,避免了PCR的偏好性對測序結(jié)果的影響,且可以避免核基因組同源序列的干擾。在具體實驗操作上,本方法大大簡化了實驗流程,較其他mtDNA高通量測序方案耗時短,reads利用率高,建庫成本較低,可以應(yīng)用于大規(guī)模人群mtDNA的測序工作。

目前線粒體疾病(mitochondrial diseases,MD)的診斷仍具有很大的挑戰(zhàn)性。雖然一些MD具有明確的臨床癥狀,容易識別,如慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)[13]、線粒體腦肌病合并乳酸酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作(mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes,MELAS)[14]等,但更多的患者不會表現(xiàn)出疾病的典型癥狀和體征。MD的實驗室診斷多數(shù)是通過對疾病受累的組織或器官進(jìn)行生物化學(xué)(如測定線粒體ATP酶的活性)等方法來診斷,最終確診常需要侵入性活檢,耗時長且不易被患者接受。迄今為止,研究者已發(fā)現(xiàn)了300多個基因的致病性突變可導(dǎo)致MD[15],Mitomap數(shù)據(jù)庫也給出96個明確致病的mtDNA突變位點。當(dāng)患者臨床癥狀為多系統(tǒng)受累或綜合征表現(xiàn)時,需要高度懷疑MD,則應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行基因檢測[16]。對于MD的遺傳學(xué)病因診斷,本方法由于建庫實驗流程簡易、成本低、準(zhǔn)確性高,相較于其他測序方法具有較大優(yōu)勢,可用于研究MD患者的致病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)潛在性MD患者,同時也可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生給予患者精確的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等方面的幫助。

綜上所述,本研究開發(fā)了一種基于線粒體分離純化技術(shù)的mtDNA建庫及測序方法,可實現(xiàn)特異性全線粒體基因組深度測序。本研究通過非PCR的方法獲得較純的mtDNA文庫,不易受核基因組同源序列干擾,可準(zhǔn)確且靈敏地檢出線粒體基因組的同質(zhì)性和異質(zhì)性變異。此外,本方法可較好地應(yīng)用于PBMC樣本,適合在臨床上推廣和應(yīng)用。