海南長臂猿糞便性激素水平報道

李威，盧學理，齊旭明，袁梨，黎華福，鄧懷慶

（1.貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550001；2.貴州師范大學喀斯特研究院，貴陽 550001；3.海南熱帶雨林國家公園管理局霸王嶺分局，海南 昌江 572722；4.重慶動物園，重慶 400050）

海南長臂猿Nomascus hainanus屬靈長目Primates 長臂猿科Hylobatidae 冠長臂猿屬Nomascus，國家一級重點保護野生動物，中國特有種，被世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）列為極危（CR）等級（Geissmann & Bleisch，2020）。由于棲息地的喪失和破碎化、非法盜獵行為和人類活動的影響（周江，2008），海南省人民政府網(wǎng)（https：//www.hainan.gov.cn）的資料顯示，目前僅剩36 只海南長臂猿，包括5 個家庭群（A、B、C、D、E）的31 只個體和5 只獨猿，分布在海南熱帶雨林國家公園內(nèi)（原霸王嶺國家級自然保護區(qū)）中，棲息地面積約16 km2（Guoet al.，2021）。對海南長臂猿的保護研究尤為迫切。

現(xiàn)有關于海南長臂猿的研究主要集中在行為（周江，2008；周江等，2008；Zhouet al.，2008；Deng &Zhou，2016；Denget al.，2016；李萍等，2021）、生境選擇（唐瑋璐，金崑，2021）、食物組成（唐瑋璐等，2021；Zhanget al.，2022）、遺傳多樣性（李志剛等，2010；Guoet al.，2020，2021）、腸道微生物多樣性（Li Pet al.，2022；Yanget al.，2022）等方面。由于野生長臂猿常生活在棲息地地形復雜的環(huán)境，且營樹棲生活方式，加上對人類的高度警惕，常難以對它們進行長期的實地研究（Bleisch & Chan，1991）。當前仍然缺乏有關海南長臂猿內(nèi)分泌和生理健康監(jiān)測的研究。

繁殖狀況對物種保護、管理和恢復具有重要的意義，而監(jiān)測靈長類動物的生理周期和性激素水平信息可以掌握其繁殖狀況。雌雄正常生理周期的開始就意味著性成熟，其主要特征是在生理周期內(nèi)雌性生殖器的腫脹（Dahl & Nadler，1992；Cheyne & Chivers，2006；Barelliet al.，2007）；觀察雌性個體性器官的腫脹也曾被認為是監(jiān)測生理周期的一個行之有效的方法（Nadleret al.，1993；Barelliet al.，2007）。然而，冠長臂猿屬雌性長臂猿的性器官腫脹不明顯，或只有輕微的粉紅色陰唇腫脹（Heistermann，2010）；銀白長臂猿Hylobates moloch雌性性器官的腫脹與生理周期并不一致（Hodgkiss，2007）。因此，雌性長臂猿性器官的腫脹不能作為生理周期開始的精確指標。

性激素影響著動物的一系列繁殖行為和發(fā)育的變化：孕酮是一種在人類和其他動物種類中參與雌性月經(jīng)周期、妊娠期（促進妊娠）和胚胎發(fā)育的類固醇激素（Wishartet al.，2007）；睪酮能促進精子的產(chǎn)生、第二性征的發(fā)展和雄性的生殖競爭（Wingfieldet al.，1990），促進求偶和性行為（Wiley& Goldizen，2003）。孕酮的水平可以作為雌性生理周期的可靠標記，表明雌性確實在排卵（Wasseret al.，1988），測定孕酮水平能檢測到雌性生殖狀況的變化（即月經(jīng)周期、懷孕）（Fie?et al.，1999；Pineda-Galindoet al.，2017）。非人靈長類動物糞便中的睪酮水平在不同性別間具有顯著差異（M?hleet al.，2002；Pineda-Galindoet al.，2017）。因此，本研究選擇孕酮和睪酮開展研究。生理周期的長度通過從一個周期的最高激素濃度（峰值）到下一個周期的激素濃度峰值計算（Geissmann & Anzenberger，2009）。

監(jiān)測在自然棲息地生活的瀕危野生動物的繁殖和生理狀況，通常采用非損傷性的方法，即檢測其糞便等樣品中的類固醇代謝物（Hodges & Heistermann，2003）。在開展野外研究時，通過糞便進行激素分析更靈活（Santymire & Armstrong，2010），與采集血液測量激素的傳統(tǒng)方法相比，此法具有實用性，也具備倫理上的優(yōu)勢。尿液和糞便樣本可以在不需要捕獲或打擾動物的情況下反復收集，有利于對動物生殖活動的時間變化進行縱向評估（Brownet al.，1994）。

海南長臂猿通常在日出前后不久頻繁而有規(guī)律地鳴叫，一般持續(xù)10～30 min，鳴叫和二重唱是其交流的一個重要方面（Denget al.，2014），野外跟蹤時可通過鳴叫聲靠近長臂猿。成年雌性金黃色的毛色使其更容易被發(fā)現(xiàn)，通過尋找成年雌性長臂猿更容易追蹤到猿群。海南長臂猿的這些特征為野外條件下的實地跟蹤和非損傷性采樣提供了方便。在環(huán)境溫度下儲存的未經(jīng)處理的糞便樣本中，類固醇激素的濃度可能會隨著時間的推移而變化，并由于糞便細菌的活動導致濃度的波動（Messmannet al.，1999；Khanet al.，2002；Shuttet al.，2012），因此，新鮮糞便樣品采集后需要盡快進行實驗處理或先低溫儲存。

量化各種樣品中激素濃度的方法有放射免疫（RIA）和酶聯(lián)免疫（EIA）測定法。這些方法依賴于使用與對應的激素（或其代謝物）結(jié)合的抗體，從而量化樣本中的濃度（Grangeet al.，2014）。盡管具有特異性，EIA 的測量結(jié)果可能受到抗體與其他的結(jié)構(gòu)相似的代謝物發(fā)生交叉反應的影響（Rinconet al.，2019）。免疫分析比高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）更便宜、有更高的通量（Cross& Hornshaw，2016）。但與免疫分析相比，LC-MS不使用抗體進行激素檢測，而是通過基于分子量和電荷對樣本中的激素進行高度特異性的測量（Hauseret al.，2008；Cross & Hornshaw，2016），可準確量化樣品中的激素水平，從而避免EIA法中抗體交叉反應帶來的影響。鑒于對海南長臂猿保護的迫切需求，本研究通過采集海南長臂猿的新鮮糞便樣品，采用LC-MS 分析其糞便中孕酮和睪酮的水平，為長臂猿繁殖生物學研究提供基礎信息，為改善和加強海南長臂猿的保護管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

海南熱帶雨林國家公園霸王嶺保護分局位于海南島的西南部山區(qū)（109°03′～109°17′E，18°57′～19°11′N），海拔151～1 559 m，年均氣溫21.3 ℃，年均降水量1 657 mm（Deng & Zhou，2018）。屬熱帶季風氣候，干濕季明顯，5—10月為雨季，11月至次年4月為旱季（龍文興等，2011）。

1.2 目標動物

海南長臂猿糞便樣品來自C家庭群，家域面積約為436 hm2，海拔780～1 270 m（Heet al.，2022）。野外采樣期間，C 群共8只個體，包括3只成年雄性個體（CM01、CM02 和CM03）、2 只成年雌性個體（CF01 和CF02）、2 只青年個體（CJ01 和CJ02）和1只幼年個體。其中，CM01是家庭群首領，CF01和CF02 均是有繁殖經(jīng)歷的成年雌性（韓玲，2019）。由于幼年個體的排便量過少，很難尋找到新鮮糞便，無法長期持續(xù)地跟蹤采集糞便樣品，故不作為本次研究對象。

1.3 樣品采集

在2021年的雨季（5—11月），每天在日出前到達C 群監(jiān)聽點，通過鳴叫判斷海南長臂猿的位置，并盡可能靠近跟蹤。根據(jù)體型大小、皮毛顏色等特征，結(jié)合鳴叫等行為進行個體識別。一旦觀察到海南長臂猿排便，部分人員盡量靠近排便地點尋找新鮮糞便樣品，其他人員繼續(xù)追蹤觀察其他個體的排便情況。采樣人員戴上一次性滅菌手套，用無菌移液槍槍頭夾取新鮮糞便放入無菌培養(yǎng)皿中，再將培養(yǎng)皿置于相對平緩的地方，用一次性無菌手術刀切除污染部分樣品，然后將剩余樣品放入25 mL無菌管中密封儲存，并記錄采樣日期和個體信息。將裝有糞樣的無菌管放入攜帶的小型液氮罐內(nèi)低溫儲存，帶回實驗室-80 ℃保存。

1.4 實驗設備和化學試劑

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UP LC-MS/MS）（ACQUITY UPLC-Xevo TQS，Waters Corp.，Milford，MA，USA）進行激素類物質(zhì)檢測。檢測使用的化學試劑包括分析純甲酸和目標激素標準品（St.Louis，MO，USA），以及質(zhì)譜純甲醇、乙腈、乙酸乙酯（FairLawn，NJ，USA）。實驗用超純水由裝備有液質(zhì)聯(lián)用的0.22 μm 過濾頭的Millipore Reference超純水系統(tǒng)（Billerica，MA，USA）制備。精確稱取激素標準品溶于乙醇溶液中，配成濃度為5.0 mg·mL-1的母液，隨后用20%甲醇溶液稀釋制成一系列濃度的標樣獲取標準曲線，濃度分別為0.01 nmol·L-1、0.05 nmol·L-1、0.10 nmol·L-1、0.50 nmol·L-1、1.00 nmol·L-1、5.00 nmol·L-1、15.00 nmol·L-1、40.00 nmol·L-1、80.00 nmol·L-1和200.00 nmol·L-1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

海南長臂猿孕酮和睪酮水平用干糞便中目標激素含量（pmol·g-1）來表示。根據(jù)性別和年齡分為成 年 雄 性（CM01、CM02 和CM03）、成 年 雌 性（CF01和CF02）和青年3組（CJ01和CJ02）。

使用MassLynx（V4.1，Waters，USA）對UPLCMS/MS生成的原始數(shù)據(jù)文件進行處理，對每一個代謝物進行峰的積分、校準和定量，數(shù)據(jù)通過SPSS對成年雄性、成年雌性、青年個體之間的性激素水平進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和t檢驗，顯著性水平設置為α=0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 孕酮水平的分析

根據(jù)孕酮水平推測，CF01在6月4日—7月7日之間完成了1個月經(jīng)周期，長度為33 d；在7月7日—8月4日完成了1 個月經(jīng)周期，長度為27 d，平均為30 d±3 d。CF02 在6 月28 日—8 月4 日之間完成了1個月經(jīng)周期，長度為37 d，在8月4日—9月5日之間完成了1 個月經(jīng)周期，長度為32 d，平均為34.5 d±2.5 d（圖1）。

圖1 海南長臂猿C群成年雌性個體孕酮的時間動態(tài)變化Fig.1 Temporal dynamics of progesterone in adult female Hainan gibbon （Nomascus hainanus）group C

海南長臂猿C 群在不同性別和不同年齡間的孕酮水平均無顯著差異（P＞0.05）；成年雄性、成年雌性和青年間也無顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 海南長臂猿C群的孕酮水平Fig.2 Progesterone levels of Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

2.2 睪酮水平的分析

海南長臂猿C群的成年雌性、成年雄性和青年睪酮的時間動態(tài)變化沒有觀察到明顯的周期性特點（圖3）：成年雌性在睪酮水平上高于成年雄性且有顯著差異（P＜0.05）；但是青年與成年雌性和成年雄性之間的睪酮水平均無顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。

圖3 海南長臂猿C群個體間睪酮的時間動態(tài)變化Fig.3 Temporal dynamics of testosterone among individuals in Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

圖4 海南長臂猿C群的睪酮水平Fig.4 Testosterone levels in Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

3 討論

本研究測定的海南長臂猿C 群2 只成年雌性CF01 和CF02 的 月 經(jīng) 周 期 分 別 為30 d±3 d 和34.5 d±2.5 d。2013年，在7個北美動物機構(gòu)的包括白頰長臂猿N.leucogenys、黃頰長臂猿N.gabriellae、合趾猿Symphalangus syndactylus和白掌長臂猿Hylobates lar在內(nèi)的7 只長臂猿研究中發(fā)現(xiàn)，這些長臂猿在為期3 個月的研究中的平均月經(jīng)周期為23.1 d±1.5 d，在不同個體和物種之間的范圍是15.3～27.3 d（Rafaczet al.，2013）；黃頰長臂猿的平均月經(jīng)周期為21.1 d±1.2 d（n=7）（Geissmann & Anzenberger，2009）。大多數(shù)報道的長臂猿月經(jīng)周期為20～40 d，但是大于22 d 的平均值多數(shù)是基于對月經(jīng)出血或觀察交配行為得到的，Hodgkiss（2007）基于4只雌性銀白長臂猿H.moloch的性激素水平研究指出其平均月經(jīng)周期為25.4 d±8.4 d，其中包括一個長達38 d 的較長周期，認為雌性長臂猿最長的月經(jīng)周期可達49 d。本研究基于海南長臂猿C 群2 只個體獲得的月經(jīng)周期比大多數(shù)基于性激素水平研究所得到的平均月經(jīng)周期要長，還需通過后續(xù)增加群體觀察以驗證海南長臂猿的月經(jīng)周期長度。

海南長臂猿成年雌性個體間的月經(jīng)周期無顯著差異，顯示了一定程度的同步性。生活在一起的群居靈長類動物雌性的月經(jīng)周期具有同步性現(xiàn)象較為常見（Mcclintock，1971，1984；Wallis，1985），這種現(xiàn)象被認為是由雌性的嗅覺信號調(diào)節(jié)的（Mcclintock，1978，1984；Russellet al.，1980）。生活在近距離的雌性長臂猿可能會影響彼此的月經(jīng)周期（Geissmann & Anzenberger，2009），本研究結(jié)果支持這一結(jié)論。

在野生種群中，一夫一妻制和一夫多妻制都存在，若雌性有多個雄性性伴侶，繁殖行為是一種混淆父權(quán)的方式（Barelliet al.，2007）。過去海南長臂猿是一夫二妻制（Zhouet al.，2008），但雌性長臂猿對交配行為似乎有更高的控制權(quán)（Zhouet al.，2008；Geissmann & Anzenberger，2009）。當前海南長臂猿已形成多雄多雌的家庭結(jié)構(gòu)（LiYMet al.，2022），該研究發(fā)現(xiàn)C 群成年雌性（CF02）在同一天向2只居住的成年雄性（CM01和CM02）求偶，并在不同日期與這2 只雄性分別交配。靈長類動物較長的月經(jīng)周期可能是雌性一種混淆父權(quán)的適應性特征，從而降低雄性的殺嬰風險，在與多個雄性生活在一起的雌性動物中，它們受到高度的性脅迫（van Schaiket al.，2000）。本研究中，2 只成年雌性長臂猿的月經(jīng)周期比其他報道的更長，且被觀察到與多個雄性交配的CF02 的月經(jīng)周期略長于CF01。海南長臂猿是否通過延長月經(jīng)周期混淆父權(quán)關系，需要今后結(jié)合行為學記錄和性激素監(jiān)測研究驗證。此外，黑吼猴Alouatta pigra的糞便中睪酮水平在雄性和雌性之間存在顯著差異（Ariadnaet al.，2014），本研究結(jié)果表明，海南長臂猿睪酮水平在兩性之間也存在顯著性差異。海南長臂猿的繁殖生物學信息對于了解其生存和保護現(xiàn)狀至關重要。該物種分布地形復雜，營高大樹棲生活，且生性隱蔽，尤其對人類高度警惕，不便于野外跟蹤和新鮮糞樣采集。因此，當前只采集了相對易于觀察的C群海南長臂猿糞便樣品，研究結(jié)果表明通過糞樣的性激素水平分析，可以有效評估海南長臂猿的繁殖狀況，這對種群數(shù)量極少的靈長類動物繁殖生物學研究具有一定的參考價值。