陰道微生態(tài)改變與高危型人乳頭瘤病毒感染的相關(guān)性研究

李莉，馬瑩，付玉榮，于東渤，王銘洋，鄭文瑾，翟青枝

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100853

女性陰道微生態(tài)是由陰道微生物菌群、宿主的內(nèi)分泌系統(tǒng)、陰道解剖結(jié)構(gòu)及陰道局部免疫系統(tǒng)共同組成的生態(tài)系統(tǒng)[1]，具有動(dòng)態(tài)變化特征，并受月經(jīng)、年齡、雌激素水平、性交頻率等多種因素影響。正常陰道微生物群能維持陰道正常酸性環(huán)境，抑制病原體生長，一旦菌群結(jié)構(gòu)失衡，就會(huì)增加生物個(gè)體感染各種生殖系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。已有研究表明陰道微生態(tài)環(huán)境失衡與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion，SIL)甚至宮頸癌變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸發(fā)生癌前病變甚至進(jìn)展為癌變的主要原因[4]。陰道微生態(tài)是HPV 入侵宮頸的第一道防線，HR-HPV 感染可能與機(jī)體陰道微生態(tài)平衡存在一定的相關(guān)性。本研究旨在分析陰道微生態(tài)指標(biāo)與HR-HPV 感染的相關(guān)性，以期為宮頸癌的防治提供參考。

資料與方法

1 資料 收集2021 年10 月-2022 年3 月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科同時(shí)行陰道分泌物微生態(tài)及人乳頭瘤病毒基因分型檢測的病例324例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有性生活史，知情同意并配合者；(2) 24 h 內(nèi)無性生活、盆浴、陰道灌洗及局部上藥等；(3)近兩周內(nèi)未使用過抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)月經(jīng)期或不規(guī)則陰道出血；(2)妊娠期或哺乳期；(3)合并或繼發(fā)其他腫瘤、嚴(yán)重婦科疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；(4)意識(shí)不清及不能配合者。本研究通過解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.S2021-168-01)，所有研究對象均知情同意，所有檢測均在本科實(shí)驗(yàn)室完成。

2 陰道微生態(tài)檢測 標(biāo)本采集：受檢者取膀胱截石位，少量0.9%氯化鈉注射液潤滑窺陰器后放入陰道內(nèi)，充分暴露陰道壁和宮頸，用無菌棉拭子在陰道側(cè)壁的上1/3 處刮取適量分泌物，置入試管。

檢測方法：采用湖南友哲科技有限公司自主研發(fā)的全自動(dòng)GY66 陰道微生態(tài)檢測儀及配套的陰道炎聯(lián)合檢測試劑盒(酶化學(xué)反應(yīng)法)進(jìn)行檢測。經(jīng)過自動(dòng)加樣、自動(dòng)制片染色、試紙功能學(xué)顏色判讀、智能聚焦與深度識(shí)別分類計(jì)數(shù)等流程后，得到形態(tài)學(xué)分析結(jié)果及功能學(xué)分析結(jié)果，經(jīng)GY6.01 軟件進(jìn)行綜合分析最終判讀。

3 人乳頭瘤病毒基因分型檢測 標(biāo)本采集：體位同前。暴露宮頸，以無菌棉拭子擦去子宮頸口過多分泌物，專用子宮頸刷置于宮頸管內(nèi)，以順時(shí)針方向轉(zhuǎn)動(dòng)5 圈的方式在受檢者宮頸鱗柱交界處采集脫落上皮細(xì)胞，置入裝有HPV 保存液的標(biāo)本瓶中。

檢測方法：采用上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的HPV 分型核酸測定試劑盒及SLAN-96S實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)，經(jīng)核酸提取、基因擴(kuò)增等流程，對15 種HPV 高危亞型(16，18，56，45，35，59，39，51，58，52，31，33，68，66和 82)的特異性DNA 核酸片段進(jìn)行分型檢測。

4 全自動(dòng)GY66 陰道微生態(tài)檢測儀結(jié)果判讀 微生態(tài)正常：陰道菌群密集度為++/+++、菌群多樣性為++/+++、優(yōu)勢菌為乳桿菌、pH 為3.8～ 4.5、功能學(xué)指標(biāo)(包括多胺、唾液酸苷酶、白細(xì)胞酯酶等)陰性、Nugent 評分為0～ 3 分、AV 評分為0～ 2 分；

微生態(tài)異常參照陰道微生態(tài)評價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)[1]，報(bào)告分為陰道微生態(tài)正常和陰道微生態(tài)異常，異常包括菌群抑制、細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)、BV 中間型、滴蟲性陰道炎(trichomonas vaginitis，TV)、需氧菌性陰道炎(aerobic vaginitis，AV)、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)、微生態(tài)菌群正常存在炎癥反應(yīng)等。

5 SLAN 熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)結(jié)果判讀 檢測試劑：分為混合液1(16、56、31型+IC)、混合液2(18、52、58、68型)、混合液3(45、82、33、35型)、混合液4(39、51、59、66型)。

檢測結(jié)果判讀：(1)當(dāng)待檢樣本經(jīng)FAM 通道、VIC 通道、610 通道、Cy5 通道檢測后Ct 值≤38，且擴(kuò)增曲線呈典型的S形，則判斷為對應(yīng)型別的陽性；(2)當(dāng)待檢樣本在混合液1 的CY5 通道Ct 值≤32，且在混合液1 的其余通道以及其余混合液的各通道Ct 欄都顯示NO Ct，檢測樣本判定為陰性；(3)當(dāng)待檢樣本Ct 值為38～40，需重復(fù)測定，如仍在38～ 40 范圍內(nèi)，且擴(kuò)增曲線呈典型的S形，則判斷為陽性，若呈非典型的S形，則判斷為陰性。

6 分析指標(biāo) 選取陰道微生態(tài)異常指標(biāo)中樣本量大于30 的BV 及BV 中間型組、菌群抑制組、菌群正常存在炎癥反應(yīng)組，分別與微生態(tài)正常組的HR-HPV 陽性率進(jìn)行比較。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；危險(xiǎn)因素進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 陰道微生態(tài)異常組與陰道微生態(tài)正常組的HRHPV 陽性率比較 同時(shí)行陰道微生態(tài)及HPV 檢測的324 例患者，年齡21～ 72歲。HR-HPV 陽性71例，陽性率為21.91%(71/324)。陰道微生態(tài)異常的146 例患者(年齡21～ 72 歲)中HR-HPV 陽性28例，陽性率為19.18%(28/146)，陰道微生態(tài)正常的178 例患者(年齡21～ 68 歲)中HR-HPV陽性43例，陽性率為24.16%(43/178)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.162，P=0.281)。見表1。

表1 陰道微生態(tài)異常組與正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.1 Comparison of positive rate of HR-HPV between the abnormal vaginal microecology group and the normal group

2 BV 及BV 中間型組與陰道微生態(tài)正常組的HR-HPV 陽性率比較 BV 及BV 中間型組HR-HPV陽性37例，陽性率40.54%(15/37)，顯著高于陰道微生態(tài)正常組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.174，P=0.041)。見表2。

表2 BV 及BV 中間型組與陰道微生態(tài)正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.2 Comparison of positive rate of HR-HPV between the BV/intermediate BV group and normal group and the normal vaginal microecology group

3 菌群抑制組與陰道微生態(tài)正常組的HR-HPV陽性率比較 菌群抑制組HR-HPV 陽性32例，陽性率18.75%(6/32)，與陰道微生態(tài)正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.443，P=0.506)。見表3。

表3 菌群抑制組與陰道微生態(tài)正常組HR-HPV陽性率比較Tab.3 Comparison of positive rate of HR-HPV between the flora inhibition group and the normal vaginal microecology group

4 陰道菌群正常存在炎癥反應(yīng)組與陰道微生態(tài)正常組的HR-HPV 陽性率比較 陰道菌群正常存在炎癥反應(yīng)組HR-HPV 陽性77例，陽性率9.09%(7/77)，顯著低于陰道微生態(tài)正常組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.740，P=0.005)。見表4。

表4 陰道菌群正常存在炎癥反應(yīng)組與陰道微生態(tài)正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.4 Comparison of positive rate of HR-HPV between the normal vaginal flora+inflammatory reaction group and the normal vaginal microecology group

5 HR-HPV 感染作為因變量進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析 采用logistic 回歸(向前LR，進(jìn)入P＜0.05，排除為P＞0.10)進(jìn)行自變量的選擇和剔除。回歸結(jié)果顯示BV 及BV 中間型是HR-HPV 感染的危險(xiǎn)因素(OR=2.240，P=0.030)，陰道菌群正常存在炎癥反應(yīng)是HR-HPV 感染的保護(hù)因素(OR=0.329，P=0.009)。見表5。

表5 Logistic 回歸分析HR-HPV 感染的影響因素Tab.5 Logistic regression analysis of influencing factors of HR-HPV infection

討論

女性陰道微生物菌群種類多、數(shù)量大，菌群與菌群之間相互制約、相互作用、相互依賴，維持陰道微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡[5]。正常情況下，乳桿菌是陰道微生物中的優(yōu)勢菌，可分解陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖原，生成乳酸使陰道的pH 值下降，從而維持弱酸性環(huán)境起到保護(hù)的作用，還能夠產(chǎn)生過氧化氫，使陰道免受病原體和其他非正常定植微生物的感染[6]。HPV 在低pH 環(huán)境下難以高效存活，故正常的陰道酸性環(huán)境本身就有利于清除HPV 或延緩其復(fù)制。

越來越多的研究表明，陰道微生態(tài)失衡會(huì)繼發(fā)下生殖道感染，破壞防御屏障會(huì)增加HPV 感染概率，而HPV 的持續(xù)感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變及子宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組推薦采用陰道微生態(tài)評價(jià)系統(tǒng)對下生殖道感染進(jìn)行檢測[7]。本實(shí)驗(yàn)室采用全自動(dòng)GY66 陰道微生態(tài)檢測儀統(tǒng)一判讀陰道微生態(tài)結(jié)果，前期研究顯示其與傳統(tǒng)的人工鏡檢方法一致性好，還能避免常規(guī)鏡檢因人為主觀因素造成的漏檢和誤判，提高了陰道分泌物分析的效率和質(zhì)量[8]。

BV 是臨床常見的陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)導(dǎo)致的混合感染，是由乳桿菌減少或消失，厭氧菌、陰道加德納菌等增多引起的陰道微生態(tài)失調(diào)綜合征[9]。BV 患者陰道分泌物中存在大量黏蛋白降解酶，導(dǎo)致陰道pH 升高，局部黏膜屏障被破壞后，病毒黏附增加，大量繁殖甚至整合進(jìn)宿主基因組，從而增加HPV 感染的易感性[10]。此外，HPV 可通過皮膚黏膜微損傷入侵鱗狀上皮基底層細(xì)胞，陰道內(nèi)的普氏菌屬和類桿菌可產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶，其作用是協(xié)助成熟的病毒顆粒脫離宿主細(xì)胞，進(jìn)而感染新的上皮細(xì)胞，造成病毒在患者體內(nèi)的擴(kuò)散[11]。研究表明，BV 患者陰道分泌物中的厭氧菌代謝會(huì)釋放有致癌作用的亞硝基胺，存在高濃度的磷脂酶A2 可增加HPV 的易感性，也就增加了病毒潛伏期和清除難度[12]。本研究中BV 組HR-HPV 陽性率顯著高于陰道微生態(tài)正常組。BV 所引起的菌群失調(diào)增加了HPV 的感染率。前期研究證實(shí)，從HR-HPV 感染到各級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變的患者，其陰道分泌物中加德納菌豐度顯著增高，且與疾病進(jìn)展相關(guān)[13]。很多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，HPV 陽性的患者陰道微生態(tài)呈現(xiàn)更高的多樣性，乳桿菌數(shù)量顯著降低，多種厭氧菌屬過度增殖，進(jìn)一步加重了陰道內(nèi)菌群紊亂，兩者互為因果，形成惡性循環(huán)[14]。

本研究中陰道菌群正常存在炎癥反應(yīng)組的HR-HPV 陽性率顯著低于陰道微生態(tài)正常組，與黃艷艷等[15]的研究結(jié)果一致。陰道細(xì)胞在某些致炎因素作用下，本身就可分泌細(xì)胞因子，在陰道局部免疫過程中發(fā)揮重要作用。IL-8 是一種由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，對中性粒細(xì)胞有細(xì)胞趨化作用，可實(shí)現(xiàn)對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)；Th1 細(xì)胞可激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬殺菌作用，發(fā)揮免疫保護(hù)功能；IL-17 作為Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，能動(dòng)員、募集及活化感染部位的中性粒細(xì)胞，從而有效介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)抗菌肽β-防御素的釋放，維持黏膜細(xì)胞的完整性，防止感染[16]。因此可以推測白細(xì)胞的增多加強(qiáng)了陰道局部的免疫保護(hù)功能，從而抑制了HR-HPV 感染，其詳細(xì)機(jī)制有待深入觀察和研究。

陰道微生態(tài)異常還包括菌群抑制，是指待檢標(biāo)本內(nèi)細(xì)菌顯著減少，表現(xiàn)為無優(yōu)勢菌，菌群密集度≤Ⅰ級(jí)，菌群多樣性≤Ⅰ級(jí)。本研究中菌群抑制組與陰道微生態(tài)正常組的HR-HPV 陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吳文湘等[17]報(bào)道在無陰道不適癥狀的健康女性中仍有25%～ 40%存在異常菌群情況，說明菌群抑制未必增加HPV 的易感性，分析可能與復(fù)雜的陰道菌群中有相互拮抗的因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

陰道微生物受年齡、雌激素水平、飲食生活習(xí)慣、性生活方式等內(nèi)外因素的影響，菌群的構(gòu)成有所不同，而且各類菌群的生物學(xué)特性各異，使得它們在HPV 感染及宮頸病變的發(fā)生中會(huì)呈現(xiàn)不同的相關(guān)性。Ravel等[18]將不同種族育齡期女性未孕時(shí)的陰道菌群狀態(tài)分成5 種菌群類型(community state type，CST)，其中4 種以乳酸桿菌為主，包括CST Ⅰ(卷曲乳桿菌)、CST Ⅱ(加氏乳桿菌)、CST Ⅲ(惰性乳桿菌)和CST Ⅴ(詹氏乳桿菌)；另外CST Ⅳ以多種絕對或兼性厭氧菌占優(yōu)勢，乳桿菌相對缺乏，主要包括加德納菌、普氏菌和巨型球菌等。研究發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌ST1 珠對陰道上皮細(xì)胞有很強(qiáng)的蛋白依賴的黏附作用，它能競爭性抑制陰道加德納菌等的依附；還能夠產(chǎn)生大量過氧化氫，有利于維持低的陰道pH值，抑制致病微生物的生長[19]；能夠分解陰道細(xì)胞內(nèi)的糖原，產(chǎn)生乳酸分子激活環(huán)磷酸腺苷，促進(jìn)細(xì)胞的自噬作用，清除局部凋亡細(xì)胞、氧化應(yīng)激碎片等，對陰道上皮細(xì)胞起到了保護(hù)作用[20]。惰性乳桿菌分泌的溶細(xì)胞素會(huì)使細(xì)胞黏膜形成孔洞而利于病毒的侵入，還會(huì)消耗大量的還原型谷胱甘肽，造成陰道氧化應(yīng)激環(huán)境，促進(jìn)HPV 的持續(xù)感染及子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[19]。CST-Ⅳ型菌群中的厭氧菌可代謝獲取的色氨酸生成吲哚類化合物，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫抑制，使病原體有效地避開宿主的防御機(jī)制導(dǎo)致長期感染[21]。CST-ⅣB型中阿托波菌數(shù)量多，可與加德納菌黏附于上皮細(xì)胞構(gòu)成的胞外聚合物基質(zhì)形成堅(jiān)實(shí)的三維結(jié)構(gòu)，并最終形成成熟的微生物生物膜，與加德納菌形成共生關(guān)系，促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)揮作用[22]。乳桿菌分泌的乳酸分為左旋和右旋兩種異構(gòu)體，其中右旋乳酸對維持陰道穩(wěn)態(tài)更有效。CST Ⅲ、CST Ⅳ中左旋乳酸比例較高，可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶8 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分解，破壞宮頸細(xì)胞的完整性，利于HPV 侵入基底角化細(xì)胞。CST Ⅰ、CST Ⅱ、CST Ⅴ中右旋乳酸含量較高，能分泌過氧化氫，刺激上皮細(xì)胞分泌抗微生物物質(zhì)，宮頸陰道黏液的黏性較高，可限制病毒顆粒侵入，抑制組氨酸去乙?；?，激活陰道局部固有免疫分子的基因轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到激活免疫清除病原體的目的[23]。本研究中陰道微生態(tài)正常組與總的微生態(tài)異常組HR-HPV陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測是因?yàn)樯鲜霰Ｗo(hù)及致病因素相互制衡所致，所以在分析陰道微生態(tài)與HR-HPV 感染的相關(guān)性時(shí)要具體分析哪種指標(biāo)的改變。

綜上所述，陰道微生態(tài)失衡與HR-HPV 感染之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，不能籠統(tǒng)地認(rèn)為陰道微生態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致HPV 感染風(fēng)險(xiǎn)的增加，而要再細(xì)化到某些指標(biāo)上來具體分析。健康穩(wěn)定的微生態(tài)是維持宮頸及陰道健康的至關(guān)重要的因素，臨床上預(yù)防或清除HPV 感染的同時(shí)也需要關(guān)注陰道微生態(tài)的改變。

作者貢獻(xiàn)李莉：論文設(shè)計(jì)、構(gòu)思、撰寫初稿；王銘洋、鄭文瑾：提供臨床咨詢和標(biāo)本采集；馬瑩、付玉榮：實(shí)驗(yàn)檢測和數(shù)據(jù)采集；于東渤：數(shù)據(jù)分析和研究；翟青枝：監(jiān)督指導(dǎo)和稿件的審核修訂。

利益沖突本文作者聲明不存在潛在的利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者李莉處索取，Email：287112717@qq.com。