手性萜類香料化合物制備的研究進展

毛悅 汪薇 白衛(wèi)東 王靖宇 李湘鑾 姜浩 趙文紅

摘要：手性萜類香料化合物具有檸檬、柏油、留蘭香等香氣，廣泛應用于食品、日用品行業(yè)中。由于手性萜類香料對映體具有不同的香氣特征，加上消費者對高品質(zhì)天然香料的青睞，手性萜類香料化合物的生物制備法備受關(guān)注。文章介紹了檸檬烯、乙酸香茅酯、α-松油醇、香芹酮等萜類香料化合物的制備方法，分析了手性萜類香料生物法制備中面臨的問題，旨在為更經(jīng)濟高效的生物法轉(zhuǎn)化手性萜類香料提供借鑒。

關(guān)鍵詞：手性；萜類香料化合物；制備方法

中圖分類號：TS202.3? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0208-06

Abstract： Chiral terpene spice compounds have lemon， pitch， spearmint and other spice， and are widely used in the food and daily necessity industries. Due to the different aroma characteristics of chiral terpene spice enantiomers and the preference of consumers for high-quality natural spices， the biological preparation method of chiral terpene spice compounds has attracted much attention. In this paper， the preparation methods of chiral terpene spice compounds such as cinene， citronellyl acetate， α-terpineol， carvone are introduced， and the problems faced in the preparation of chiral terpene spice by biological method are analyzed， aiming to provide references for the more economical and efficient conversion of chiral terpene spice by biological method.

Key words： chiral; terpene spice compounds; preparation methods

收稿日期：2022-12-05

基金項目：廣東省重點研發(fā)項目（2022B020205003）；廣東省嶺南特色食品科學與技術(shù)重點實驗室（2021B1212040013）；廣州市科技計劃項目（202103000062）

作者簡介：毛悅（1999-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學。

*通信作者：汪薇（1981-），女，副教授，博士，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化、天然香料。

萜類化合物是指具有（C5H8）n通式（見圖1）及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看作是異戊二烯或異戊烷以各種方式連結(jié)而成的一類天然化合物[1]。萜類化合物廣泛存在于自然界中，目前已知從天然產(chǎn)物中提取得到的萜類化合物大約有60 000種[2]。萜類按異戊二烯單元數(shù)目可分為單萜、倍半萜、二萜等[3]。萜類化合物具有較強的揮發(fā)性和香氣，故在香料生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、藥物和生物燃料中廣泛應用。研究結(jié)果表明，萜類是薄荷醇、芍藥苷、青蒿素、欖香烯、紫杉醇等藥用植物的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗癌活性、抗HIV病毒等生物活性[4]。自然界中萜類化合物多種多樣，但可利用的僅有一小部分，萜類天然產(chǎn)物的生物合成與合成生物學受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。

手性現(xiàn)象在香料中普遍存在，手性香料不同的對映異構(gòu)體會表現(xiàn)出不同的香氣。手性萜類香料對映體表現(xiàn)出不同的香氣特征，如（R）-檸檬烯具有新鮮的柑橘香，而（S）-檸檬烯則具有檸檬的香氣；（R）-香芹酮具有香芹籽味，（S）-香芹酮具有甜的留蘭香味；（R）-香茅醇具有香茅氣息，而（S）-香茅醇則散發(fā)五葉草氣息；（R）-圓柚酮具有弱的木香，（S）-圓柚酮具有強的葡萄香味等[5]。

香精在食品、日用品、化妝品、煙草行業(yè)應用廣泛，是化工行業(yè)常用的添加劑[6]。迷迭香精油中含有許多萜類化合物，如樟腦、桉葉油醇、L-α-松油醇、芳樟醇等。迷迭香精油可以用作香氛香薰或食品香料[7]。有研究表明，迷迭香精油的脂溶性提取液可明顯抑制食用植物油中過氧化物的生成，表現(xiàn)出抗氧化性能[8]。

香料化合物又分為天然香料和合成香料[9]。經(jīng)過對植物殘渣的深入分析，對天然香料化合物的獲取有了一定的了解。為了得到品質(zhì)優(yōu)良的香精香料，選擇的提取方法十分重要，傳統(tǒng)方法有水蒸氣蒸餾法和索氏提取法[10]。水蒸氣蒸餾法又分為很多種，新興研究是通過使用離子液體輔助水蒸氣對香精香料進行提取[11]。崔麗佼等[12]使用離子液體輔助水蒸汽法從檸檬中提取檸檬精油，為檸檬精油的綜合開發(fā)利用提供了參考。同時，隨著人工合成香料方法研究的深入，生物催化法成為一種興起的合成香精香料方法。

手性萜類香料化合物的制備方法主要有天然提取法、化學法和生物法。植物提取法獲得的產(chǎn)物原料匱乏、產(chǎn)量低、周期長、成本高，不能滿足生產(chǎn)需求?；瘜W合成法雖提高了產(chǎn)量，但對環(huán)境不友好，反應條件復雜，香氣不夠自然[8]，使用生物合成法則可避免以上問題，具有廣闊的應用前景。本文對具有代表性的手性萜類香料化合物合成方法的研究進展進行了綜述。

1 檸檬烯

檸檬烯，又名苧烯[13]，是一種單環(huán)單萜類化合物，分子式為C10H16。檸檬烯在自然界中有3種存在形式：D-檸檬烯、L-檸檬烯和DL-檸檬烯，見圖2。

自然界中檸檬烯主要以D-檸檬烯的形式存在[14]。L-檸檬烯主要存在于薄荷等植物精油中，其味道與松節(jié)油相似。D-檸檬烯廣泛存在于柑橘類果實中，如橘子、橙子、柚子的果皮中。DL-檸檬烯存在于云南松油等精油中，是一種重要的功能性單萜，主要具有抗菌活性[15]、抗癌活性[16]、抗炎癥[17]、抗氧化[18]等功能。檸檬烯在食品、醫(yī)藥、日用品等行業(yè)中廣泛應用，還可作為生物燃料使用[19]。

檸檬烯大部分是從柑橘類的果皮中分離提取出來的。目前使用的主要提取方法有超臨界CO2萃取法、有機溶劑萃取法、蒸餾法、超聲波輔助萃取法等[20]。有機溶劑浸提法主要是選擇正己烷、乙醚、石油醚等有機溶劑進行浸提。但由于使用有機溶劑會污染環(huán)境，并且此法獲得的檸檬烯用途有限，因此更多實際生產(chǎn)會使用蒸餾法。減壓蒸餾與水蒸汽蒸餾相比，減壓蒸餾壓強小，使檸檬烯的沸點降低，避免了檸檬烯發(fā)生氧化等副反應，且效率較水蒸汽蒸餾高[21]。分子蒸餾是在高真空環(huán)境下，利用檸檬烯分子與其他分子的分子自由程度不同，從而將檸檬烯分離出來[22]。此法效率高、蒸餾時間短、無污染，但經(jīng)濟成本較高。超臨界CO2萃取法提取的檸檬烯不會引入新的雜質(zhì)，也避免了檸檬烯發(fā)生副反應[23]，但是經(jīng)濟成本高，并未在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中使用。從植物中提取檸檬烯，原料產(chǎn)量會受到氣候的影響，從而影響檸檬烯產(chǎn)量，無法持續(xù)供應。馬云建[24]建立了香料前體化合物（檸檬烯）的綠色天然低共熔溶劑（NADES）高效穩(wěn)態(tài)化提取技術(shù)，效率達到了傳統(tǒng)的萃取溶劑（如乙酸乙酯和正己烷）的80%以上。

一些研究者利用工程菌合成檸檬烯。Cao等[25]向Po1f菌株中插入NDPS1基因（橙花基焦磷酸合酶編碼基因），將NDPS1基因和dLS基因過表達，最終得到能夠生產(chǎn)D-檸檬烯的解脂耶氏酵母工程菌，這是首次使用解脂耶氏酵母異源生產(chǎn)檸檬烯的研究，該研究為后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。吳計劃[26]向大腸桿菌BW25113的基因組中插入了T7 RNA聚合酶的基因，以得到工程大腸桿菌BW25113（DE3）菌株，并對合成途徑進行了優(yōu)化，以葡萄糖為原料，發(fā)酵合成了檸檬烯。但該方法是位于質(zhì)粒上的檸檬烯合成模塊，在工業(yè)發(fā)酵的過程中會提高經(jīng)濟成本，故仍需進一步優(yōu)化以降低成本。

2 乙酸香茅酯

乙酸香茅酯是一種短鏈萜烯脂肪酸酯類化合物，分子式為C12H22O2，見圖3。

乙酸香茅酯存在于玫瑰精油和香茅精油中[27]，具有檸檬香氣，廣泛應用于日用品、醫(yī)藥等行業(yè)[28]。

少部分乙酸香茅酯從天然植物油中提取。通過普通蒸餾的方法將乙酸香茅酯從香茅油、玫瑰油等植物精油中分離出來。但由于原料稀缺，蒸餾成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，因此天然提取法存在一定的局限性。

江云兵等[29]以NaHSO4·SiO2為催化劑催化香茅醇與乙酸酐生成乙酸香茅酯。這項研究突破了傳統(tǒng)化學合成法的局限，充分發(fā)揮了微波輻射技術(shù)的優(yōu)點。

天然提取法和化學合成法都有自身的局限性，而隨著乙酸香茅酯需求的增長，研究者轉(zhuǎn)向使用生物技術(shù)方法進行生產(chǎn)。為了突破酶只能在單一的水溶液介質(zhì)中反應的局限，研究者對不同的反應介質(zhì)進行了研究[30]。Macedo等[31]研究了非水相體系中根霉菌Rhizopus sp.脂肪酶的催化反應，底物香茅醇分別與乙酸乙酯、乙酸丁酯反應，合成乙酸香茅酯該反應的轉(zhuǎn)化率分別為58%和48%。Xiong等[32]以乙酸乙烯酯為溶劑，使用熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens脂肪酶催化香茅醇合成乙酸香茅酯，研究發(fā)現(xiàn)乙酸香茅酯的轉(zhuǎn)化率可達到96%。王楠等[33]研究了在醇酸混合反應體系中華根霉菌絲Rhizopus chinensis結(jié)合脂肪酶酯化香茅醇合成乙酸香茅酯，轉(zhuǎn)化率可達94%，獲得的產(chǎn)物香氣純正。

張蒙等[34]使用固定化熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens脂肪酶，催化香茅醇和乙酸乙烯酯合成乙酸香茅酯，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率可達96%。此研究發(fā)現(xiàn)固定化酶具有高效催化作用，見表1。

3 α-松油醇

α-松油醇，又名α-萜品醇，它是一種單萜類化合物，分子式為C10H18O，見圖4。

（S）-α-松油醇具有針葉樹香、柏油味；（R）-α-松油醇具有濃郁的花香、丁香花香氣[35]。在香水、化妝品及日用品行業(yè)中常用作香料。α-松油醇可作為食品防腐劑，也可作為食用香精調(diào)配檸檬、橙、桃子等水果香氣 [36]；因其具有抗菌和抗氧化特性，在醫(yī)藥行業(yè)中可用作抗真菌劑和消毒劑[37]。

α-松油醇可從油樟油中提取出來，油樟植株的根、莖、葉、果實均可提煉精油，但物質(zhì)含量較低，且需要克服油樟生長周期的問題[38]。在實際生產(chǎn)中主要通過化學合成松油醇后精制得到。

工業(yè)合成松油醇主要使用一步法和二步法，通過H2SO4、H3PO4等無機酸催化松節(jié)油水合生成松油醇。一步法[39]，即松節(jié)油在酸催化下水合為松油醇；二步法[40]，即松節(jié)油在酸催化下先水合生成萜二醇，再由稀酸催化生產(chǎn)松油醇。其中，一步法雖操作簡單，但所得松油醇香氣質(zhì)量差，與天然提取的松油醇有差異。二步法所得松油醇純度高，但工藝流程繁瑣，成本高昂。裴文使用手性催化劑催化 1-苯磺?；?3-丁烯-2-酮與異戊二烯合成 （R）-α-松油醇（見圖5），其光學純度可達92%。

研究發(fā)現(xiàn)，真菌和細菌能在有氧條件下將檸檬烯進行生物轉(zhuǎn)化為α-松油醇。Tai等[41]利用青霉菌Penicillium sp.將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇； Rottava等[42]利用黑曲霉Aspergillus niger使檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇；Bicas等[43]利用雙相體系（有機相為葵花油）提高鞘脂菌Sphingobium sp.轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇的產(chǎn)量，產(chǎn)量為130 g/L。廉長盛等[44]使用棲稻假單胞菌 Pseudomonas oryzihabitans將檸檬烯轉(zhuǎn)化為α-松油醇，轉(zhuǎn)化率提高了10.6倍。黃金鳳等[45]分離出油樟葉片的內(nèi)生細菌T3-M-39，從中篩選出α-松油醇高產(chǎn)菌株，并對其進行紫外誘導選育，發(fā)現(xiàn)誘導后的菌株產(chǎn)α-松油醇能力提高了34.85%，見表2。

4 香芹酮

香芹酮，又名葛縷酮，是一種單環(huán)單萜類化合物，分子式為C10H16O，見圖6。

L-香芹酮具有留蘭香氣味，D-香芹酮為葛縷子香，存在于香芹籽油中，廣泛應用于日用品、食品行業(yè)[46]；另外香芹酮可作為合成砌塊來合成復雜的天然產(chǎn)品[47]，這些化合物也可用于制備透皮吸收促進劑和其他產(chǎn)品。

從留蘭香油中提取出香芹酮常用天然提取法。黃庭剛[48]通過普通間歇精餾法對留蘭香油進行精制，香芹酮的含量提高了84.73%。陳連官[49]使用減壓蒸餾法將香芹酮的沸點由230 ℃下降到99.6 ℃，降低了經(jīng)濟成本，且所得的香芹酮符合國家質(zhì)量標準。羅運華等[50]使用超臨界CO2萃取法提取香芹酮，所得產(chǎn)物含量為97%。

由于日用品工業(yè)的發(fā)展，對香芹酮的需求量日益增加，從留蘭香油中提取的香芹酮已不能滿足市場需求。早期，Linder等[51]首先報道了將檸檬烯經(jīng)環(huán)氧化和水解后得到二醇，再氧化為酮醇，最后脫水成香芹酮。其獲得率較低，僅有9.1%。謝海英等[52]先將環(huán)氧檸檬酸異構(gòu)得到香芹醇，再氧化生成香芹酮。此法經(jīng)濟環(huán)保，無污水生成，原料易得，反應時間短、選擇性好。馬晨等[53]將檸檬烯與亞硝基氯反應生成檸檬烯的亞硝基氯化物，再經(jīng)脫氫得到L-酮肟，再水解為香芹酮。姜志潔等[54]在室溫條件下，利用有機電化學合成法催化檸檬烯以制備香芹酮，此法使用的電子代替催化劑符合綠色化學的要求。Li等[55]使用蘆葦葉制作介孔二氧化硅，催化檸檬烯發(fā)生烯丙基轉(zhuǎn)化生成香芹酮。因此，使用生物法合成香芹酮成為新的研究方向。

一些研究者利用真菌合成香芹酮。Molina等[56]發(fā)現(xiàn)從果實中篩選分離出的Aspergillus sp.能夠?qū)幟氏┭趸上闱弁?。Bier等[57]從火炬松中分離得到的Phomopsis sp.可將檸檬烯轉(zhuǎn)化香芹酮。Trytek等[58]還使用葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶氧化檸檬烯，從而得到香芹酮。

5 圓柚酮

圓柚酮（（+）-nootkatone），又稱（+）-諾卡酮，其分子式為C15H22O，見圖7，是一種雙環(huán)倍半萜酮，最早在阿拉斯加黃雪松的木質(zhì)成分中分離得到，并存在于柑橘類果實果皮、香根草油中[59]。圓柚酮在低濃度時具有柚子、柑橘、橙子的香氣，并帶有甜橙、木香香調(diào)，味苦，其氣味閾值較低，僅為1 μg/L[60]。作為香精香料可以廣泛應用于食品、化妝品、日用品及煙草行業(yè)，具有極高的市場價值。同時研究者發(fā)現(xiàn)，圓柚酮具有抗炎[61]、抑制脂多糖活化[62]等活性，且有抗蟻蟲活性[63]。天然產(chǎn)物中圓柚酮含量較低，且存在較多立體異構(gòu)體，難以分離，故由天然產(chǎn)物中獲得的圓柚酮價格非常昂貴。

樊猛等[64]使用同時蒸餾萃取制備圓柚酮，連續(xù)蒸餾時的精油提取率較分段蒸餾的精油提取率之和低，并發(fā)現(xiàn)延長蒸餾時間有利于柚皮中圓柚酮含量的提高。但使用蒸餾法獲得的天然圓柚酮得率較低，無法滿足工業(yè)需求，因此除了物理法之外，還可使用化學合成法進行制備。

最初，Palmerín-Carreo等[65]使用叔丁基鉻酸鹽將（+）-瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為（+）-圓柚酮。其他方法則是使用重鉻酸鉀和醋酸作為催化劑催化反應發(fā)生。另外，Salvador等[66]使用二氧化硅負載金屬催化劑催化叔丁基過氧化氫，以氧化（+）-瓦倫西亞橘烯的烯丙基。

許多研究者對酶法和微生物法生產(chǎn)圓柚酮都進行了一定的研究，例如細菌、真菌、植物、細胞提取物、酶等。Drawert等[67]對柑橘組織培養(yǎng)物中芳香化合物進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其中有微量的圓柚酮。Río等[68]則對不同品種的柑橘愈傷組織培養(yǎng)物進行測定，其中均有瓦倫西亞橘烯和圓柚酮。

研究者利用細菌合成圓柚酮。Sowden等[69]以D-（+）-樟腦為底物，用惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的細胞色素P450酶（P450cam）合成（+）-圓柚酮。野生型的P450cam不能氧化瓦倫西亞橘烯，可能是因為該酶的活性位點無法容納更大的瓦倫西亞橘烯，因此他們研究了Y96、F87、V247、L244處的突變組合對瓦倫西亞橘烯與P450cam結(jié)合和氧化的影響，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)87V/Y967F/L244A的三重突變體可以得到圓柚酮的最大產(chǎn)量。同時，Sowden等發(fā)現(xiàn)使用重組巨大芽孢桿菌P450BM-3也可以獲得圓柚酮，并且P450BM-3突變體的活性較P450cam更高。

另一些研究者利用真菌合成圓柚酮。最初，Willershausen 等發(fā)現(xiàn)，黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium的過氧化氫酶能催化瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為圓柚酮， Kaspera等[70]用子囊菌球毛殼菌可將（+）-瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為（+）-圓柚酮，產(chǎn)率為8 mg/L。Mai等[71]描述了使用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa、楊樹潰瘍病菌 Botryosphaeria dothidea、可可球二孢菌Botryodiplodia theobromae，將（+）-瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為（+）-圓柚酮的生物轉(zhuǎn)化方式。Raatz等[72]使用紫孢側(cè)耳Pleurotus sapidus的擔子菌脂氧合酶可將（+）-瓦倫西亞橘烯氧化為（+）-圓柚酮。

6 總結(jié)與展望

目前制備手性萜類香料化合物的方法主要有天然提取法、化學法和生物法。生物法制備的手性萜類香料化合物屬于天然香料，深受消費者青睞，市場前景廣闊。但是由于在生物催化或合成體系中，手性萜類香料化合物對微生物細胞會產(chǎn)生毒性作用，從而產(chǎn)生底物抑制和產(chǎn)物抑制作用，導致產(chǎn)率不理想，反應效率不高，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的進程。針對這個問題，不少研究者對菌種進行了改造，對反應體系進行了改進，但是還有很大的進步空間。未來可深入研究其代謝途徑及其調(diào)控途徑，運用離子液體、低共熔溶劑等綠色溶劑，開發(fā)新型生物反應器，加深對生物法制備手性萜類香料化合物的認識和研究，這對天然香料的高效生物制備具有重要意義。

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