植物AP2亞家族研究進(jìn)展*

趙連彩，古麗米熱·阿勒木江，鐘俐

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

AP2/ERF（APETALA2/Ethylene-Responsive Factor）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]，也是植物發(fā)育中最重要的基因譜系之一，通常由60～70個(gè)氨基酸殘基組成3個(gè)反向平行的β-折疊和1個(gè)α-螺旋構(gòu)成AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域.它們不僅參與植物的發(fā)育過程，在應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)中也執(zhí)行一定的功能[2].

根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將AP2/ERF家族分為AP2和ERF兩個(gè)亞家族（圖1）.AP2亞家族包含2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，即AP2-R1和AP2-R2[3]，在營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育中起著調(diào)節(jié)作用；ERF亞家族僅具有1個(gè)AP2-R1結(jié)構(gòu)域，在應(yīng)激反應(yīng)和組織發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用[4].根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的相似性，AP2/ERF基因家族被分為4個(gè)亞家族：AP2、ERF、RAV和Soloist[5].AP2亞家族包含2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，分為euAP2譜系和ANT譜系，對(duì)植物的生殖器官（如花、胚珠、萼片）和果實(shí)的發(fā)育有很大影響[6].ERF亞家族包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，分為DREB譜系和ERF譜系，在植物發(fā)育和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，也參與環(huán)境應(yīng)激或病原體刺激的相關(guān)信號(hào)通路[7].RAV亞家族由AP2和B3 DNA結(jié)構(gòu)域組成，在抗病和應(yīng)激耐受方面具有顯著的作用[8].Soloist亞家族是只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域的最小群體，雖然這種蛋白質(zhì)也含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，但其序列和基因結(jié)構(gòu)與ERF有很大差異[2]，主要參與水楊酸途徑中的病原體防御和鹽脅迫反應(yīng)[9].從模式植物到普通作物，AP2、ERF、RAV和Soloist成員均具有保守性和多樣性.

圖1 AP2/ERF基因家族分類

AP2亞家族包括euAP2和ANT兩個(gè)譜系，與euAP2譜系相比，ANT譜系不具有miR172識(shí)別位點(diǎn)，而是通過特定的氨基酸特征進(jìn)行區(qū)分[10].為深入了解AP2亞家族成員的功能，本文對(duì)AP2亞家族兩個(gè)譜系的分類及各成員的特點(diǎn)、功能進(jìn)行了綜述.

1 AP2亞家族中的euAP2譜系各成員研究進(jìn)展

1.1 AP2成員

AP2屬于AP2/ERF家族中最古老的譜系之一[11].一個(gè)典型的AP2基因中有8個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)乙烯響應(yīng)元件、2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域、2個(gè)兩親性抑制基序、1個(gè)核定位信號(hào)序列、1個(gè)連接域和1個(gè)miR172靶位點(diǎn).AP2基因在花的各個(gè)結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，在控制花、果實(shí)和種子發(fā)育中起到重要作用[12].在擬南芥發(fā)育的每一個(gè)階段以及六大器官中都檢測(cè)到了AP2轉(zhuǎn)錄物.

1.1.1 調(diào)控花發(fā)育

AP2可以影響花分生組織、決定花器官的同一性，同時(shí)在確定花器官身份和調(diào)節(jié)花同源基因的表達(dá)方面起作用[13].AP2基因功能的缺失突變使花分生組織對(duì)促進(jìn)或抑制花發(fā)育的信號(hào)高度敏感[14]，也表現(xiàn)出花器官缺陷，導(dǎo)致其在花發(fā)育的ABC模型中被賦予A類功能[15].在擬南芥中，通過酵母雙雜發(fā)現(xiàn)AP2通過招募TPL和AtHDA19以調(diào)節(jié)B類基因的表達(dá)，從而限制花瓣的外邊界，通過抑制E類基因SEP3控制花輪的外邊界.AP2作為花同源異型基因控制著它的生長，防止花瓣向外擴(kuò)散，AP2現(xiàn)在已經(jīng)被證明可以直接限制花中B、C和E類基因的表達(dá)域[16].AP2基因在擬南芥中突變導(dǎo)致將花器官轉(zhuǎn)化為生殖器官，表現(xiàn)出萼片和花瓣分別向胚珠和雄蕊同源轉(zhuǎn)化.在矮牽牛中，分離出PhAP2A、PhAP2B和PhAP2C 3個(gè)AP2類基因，原位雜交顯示這3個(gè)基因與擬南芥AP2為直系同源物.但PhAP2B、PhAP2C與PhAP2A相比，在花發(fā)育過程中表現(xiàn)出幾乎互補(bǔ)的表達(dá)模式.反向遺傳學(xué)策略表明，PhAP2A對(duì)矮牽牛花被發(fā)育可能不是必需的，但PhAP2A能夠恢復(fù)突變體中的同源異形轉(zhuǎn)化[17].

1.1.2 調(diào)控干細(xì)胞

AP2在維系莖頂端分生組織[18]和控制花干細(xì)胞[19]方面起作用.在擬南芥中，AP2的等位基因L28突變后，莖頂端分生組織的干細(xì)胞停止分化.遺傳分析表明，AP2通過調(diào)控WUS-CLV3在干細(xì)胞中發(fā)揮作用.而在花干細(xì)胞中，AP2通過拮抗花中心的AG活性發(fā)揮作用.在花發(fā)育的第六階段，AG可以直接作用于WUS位點(diǎn)來終止WUS的表達(dá)，也可以間接作用在其靶基因KNU 上來終止WUS的表達(dá)，以促進(jìn)花的決定性[20].

1.1.3 調(diào)控種子發(fā)育

AP2在控制種子發(fā)育方面起作用.AP2突變種子缺乏一種稱為小柱的種皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且比野生型種子形狀更不規(guī)則，這表明正常種皮發(fā)育需要AP2的調(diào)節(jié).透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)擬南芥ap2突變體比野生型種子的細(xì)胞大，確定AP2基因可以限制種子珠被中細(xì)胞的大小，從而控制種子的大??；利用RNA凝膠印跡分析和RT-PCR分析了AP2的活性對(duì)控制種子質(zhì)量的重要性，確定其通過母體孢子和胚乳基因組控制擬南芥種子質(zhì)量[21].在鳳梨中，AfAP2-2基因的過度表達(dá)使種子變小并延遲開花，可能是開花、種子大小和重量的負(fù)調(diào)節(jié)因子[22].將落葉松LaAP2L1基因過表達(dá)到模式植物擬南芥中，不僅導(dǎo)致細(xì)胞增殖增強(qiáng)，而且延長了生長時(shí)間，使擬南芥的種子產(chǎn)量增加到200%以上[23].

1.2 SMZ和SNZ成員

SMZ（SCHLAFMUTZE）和SNZ（SCHNARCHZAPFEN）是來自AP2亞家族的花抑制因子[24]，它們的表達(dá)水平在植物生長的早期達(dá)到峰值，并隨著植物的衰老而降低[25].SMZ最初是在激活標(biāo)記中篩選確定的，因?yàn)樗哂酗@性的晚開花表型，而SNZ是SMZ的同源基因，高表達(dá)時(shí)抑制開花[26].在擬南芥中，抽薹和開花受硝酸鹽調(diào)控，硝酸鹽通過激活赤霉素途徑來控制SMZ和SNZ的轉(zhuǎn)錄水平，增加硝酸鹽的濃度會(huì)延遲開花，從而調(diào)節(jié)擬南芥的開花時(shí)間[24].

1.3 TOEs成員

TOEs屬于AP2亞家族，在擬南芥中有3個(gè)成員，包括TOE1、TOE2和TOE3，它通過調(diào)節(jié)光周期信號(hào)組分CO（CONSTANS）抑制并調(diào)節(jié)開花時(shí)間[27].據(jù)報(bào)道，SMZ、SNZ和TOEs都冗余地作為開花的阻遏物，以相互獨(dú)立又彼此協(xié)同的方式控制開花，它們之間存在復(fù)雜的反饋監(jiān)管機(jī)制[28].

TOE1可通過結(jié)合FT（FLOWERING LOCUST）和抑制CO的轉(zhuǎn)錄活性負(fù)調(diào)控FT的表達(dá)和開花.在擬南芥中，將TOE1基因進(jìn)行突變，突變體開花時(shí)間提前；在toe1 toe2雙突變體中，這種效應(yīng)增強(qiáng)，證明TOE1和TOE2均可抑制開花[25].TOE3很可能與TOE1和TOE2一起冗余地抑制開花，它在花器官形成期間，對(duì)于擬南芥花型的形成至關(guān)重要.但是在鹽穗木中，HcTOE3是一種冷調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)冷凍脅迫有正向調(diào)節(jié)作用[29].

2 AP2亞家族中的ANT譜系各成員研究進(jìn)展

ANT譜系屬于AP2亞家族，但兩者之間的差別在于ANT的AP2-R1與AP2-R2結(jié)構(gòu)域分別插入了10 aa和1 aa.根據(jù)前結(jié)構(gòu)域序列和其它特定基序的長度，ANT譜系進(jìn)一步細(xì)分為basalANT亞譜系和euANT亞譜系[30].euANT亞譜系由一個(gè)較長的前結(jié)構(gòu)域和保守基序構(gòu)成，包括euANT2、euANT3和euANT4，而basalANT亞譜系僅有一個(gè)較短的前結(jié)構(gòu)域[31－32].

2.1 euANT亞譜系中ANT和AIL成員

ANT（AINTEGUMENTA）與AIL（AINTEGUMENTA-like）都含有兩個(gè)典型的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域首次在擬南芥AP2蛋白中發(fā)現(xiàn)[31].其中AIL屬于較為保守的一類，主要編碼花器官生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，參與植物生長、發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng)，在發(fā)育過程中起著核心作用.

2.1.1 ANT維持細(xì)胞分生組織

ANT參與維持細(xì)胞分生，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量來控制器官大小.在金魚草中，利用黃瓜花葉病毒載體（CMVA1）誘導(dǎo)VIGS感染金魚草，與未感染植物相比，感染A1∶ANT金魚草的花和葉明顯減小，而細(xì)胞大小差異并不明顯[32].大白菜BrANT-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥，利用掃描電鏡觀察葉表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株比野生型植株的細(xì)胞數(shù)量增加了50%以上，而細(xì)胞大小僅減小了不到6%.因此，該轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量從而增大葉面積[33].同時(shí)在擬南芥中過表達(dá)或敲除AtANT，擬南芥的細(xì)胞數(shù)量和側(cè)生芽的大小均發(fā)生了改變[34].

2.1.2 ANT調(diào)控種子發(fā)育

在擬南芥中，ANT調(diào)節(jié)了胚珠珠被的起始和胚珠的發(fā)育，過表達(dá)ANT會(huì)導(dǎo)致種子的體積增加.MEE45是一種B3型轉(zhuǎn)錄因子，是胚珠珠被啟動(dòng)和發(fā)育時(shí)所必需的，它可以直接與ANT基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，激活A(yù)NT基因轉(zhuǎn)錄，ANT又可調(diào)節(jié)生長素合成基因，從而調(diào)控種子的生長[35].

2.1.3 ANT與AIL冗余調(diào)控花器官生長

ANT在花器官生長方面起重要的調(diào)節(jié)作用，且以冗余的方式與AILs一同起作用.當(dāng)AIL5、AIL6或AIL7功能喪失時(shí)，對(duì)花的表型沒有影響；當(dāng)植物喪失ANT功能時(shí)[36]，AIL5、AIL6與AIL7對(duì)花的發(fā)育有獨(dú)特的貢獻(xiàn).通常，AILs通過增加細(xì)胞數(shù)量或細(xì)胞大小在調(diào)節(jié)器官生長中發(fā)揮重要作用[37].ANT基因缺失突變導(dǎo)致花的體積減小，而AIL6基因缺失突變卻不影響花的外觀；在ant ail6雙突變體中，花的體積會(huì)進(jìn)一步減小，這表明AIL6也有助于器官生長.ANT或AIL6過表達(dá)會(huì)產(chǎn)生更大的花，表明這兩種基因都可以促進(jìn)花器官的生長.另外，AIL5和AIL7也在花發(fā)育中表達(dá)，這兩個(gè)基因已經(jīng)被證明與AIL6一起調(diào)節(jié)嫩枝葉序和側(cè)根起始[38].

2.2 euANT亞譜系中BBM成員

BBM（BABY BOOM）最早發(fā)現(xiàn)于甘藍(lán)型油菜小孢子發(fā)生過程中[39]，參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞全能性，主要在植物胚的發(fā)生、細(xì)胞增殖、再生、植物轉(zhuǎn)化和無配子生殖等多種信號(hào)發(fā)育途徑中起作用[40].

2.2.1 調(diào)控胚胎發(fā)生

利用RNA-seq對(duì)不同時(shí)間段未成熟胚外植體的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一些與控制胚胎發(fā)生的基因高度相似的序列，如轉(zhuǎn)錄因子BABY BOOM、LEAFY COTYLEDON和AGAMOUS，以及重要的體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體樣激酶（SERK）基因.其中BBM 基因與已知胚胎發(fā)生途徑中發(fā)揮作用的GLP、GST、PIN、WOX、LEC2和AGL15等基因共表達(dá)[41].

2.2.2 調(diào)控細(xì)胞增殖

BBM 通過異位表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞增殖.在擬南芥幼苗中，通過DNA微陣列分析的方法和翻譯后調(diào)節(jié)BBM∶GR蛋白與放線菌酮鑒定出一些由AtBBM直接激活的靶基因，這些靶基因已經(jīng)被證明參與分生組織的生長以及與細(xì)胞生長和分裂相關(guān)的細(xì)胞壁的合成[42－43].以上結(jié)果提示，BBM可通過激活與細(xì)胞生長和分裂相關(guān)的基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖.

2.2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞再生

通過構(gòu)建毛白楊PtBBM 過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至愈傷后獲得大量體細(xì)胞胚，進(jìn)而獲得再生植株.因而PtBBM 可作為毛白楊轉(zhuǎn)化的陽性選擇標(biāo)記基因，無需使用任何抗生素即可獲得轉(zhuǎn)基因毛白楊植株[44].

2.2.4 誘導(dǎo)無配子生殖

在珍珠粟中，通過RT-PCR技術(shù)證明了PSASGR-BBML基因在受精前的卵細(xì)胞中表達(dá)，從而誘導(dǎo)孤雌生殖，并產(chǎn)生單倍體后代.而包含PSASGR-BBML基因3′端RNAi結(jié)構(gòu)的無融合生殖F1轉(zhuǎn)基因植物中，PSASGRBBML表達(dá)量的減少導(dǎo)致孤雌生殖胚胎減少，胚胎細(xì)胞數(shù)量減少[43].以上證據(jù)表明PSASGR-BBML在無配子生殖中起著重要作用.

總的來說，BBM主要負(fù)責(zé)分化和維持分生組織，并且與PLT1、PLT2、BBM和PLT3/AIL6在根分生組織和胚胎分化中起著冗余作用[45].

2.3 euANT亞譜系中PLTs成員

PLT（PLETHORA）是決定植物干細(xì)胞命運(yùn)、維持分生組織、控制細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化進(jìn)程的一類轉(zhuǎn)錄因子[46].

2.3.1 決定干細(xì)胞的命運(yùn)

PLT1和PLT2的表達(dá)域與根部干細(xì)胞生態(tài)位相關(guān)，它們對(duì)靜止中心的特異性和干細(xì)胞活性至關(guān)重要，plt1 plt2雙突變體的表型需要特定的干細(xì)胞維持，且過度表達(dá)PLT1和PLT2導(dǎo)致生長區(qū)域的異位誘導(dǎo)[47－48].

2.3.2 維持細(xì)胞分生組織

PLT1和PLT2是維持根分生組織和分生組織邊界位置的主要調(diào)節(jié)因子.PLT1-4對(duì)于根的形成必不可少，該基因的突變導(dǎo)致植物產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷，有時(shí)甚至缺乏根和下胚軸.PLT3、PLT5和PLT7在側(cè)根原基中表達(dá)，是側(cè)根形成過程中分生組織基因激活的關(guān)鍵，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)側(cè)根發(fā)育并防止側(cè)根原基彼此靠近形成[47].在水稻中，OsPLT8/CRL5可被生長素誘導(dǎo)，并通過抑制細(xì)胞分裂素信號(hào)發(fā)揮作用[49]，這表明類似的調(diào)節(jié)途徑可能在花序分生組織中起作用.

2.3.3 控制植物細(xì)胞的增殖和細(xì)胞分化的進(jìn)程

在擬南芥中，AtAIL/PLT被認(rèn)為是擬南芥根和芽發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[50]，其可利用不同的遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂以及根和芽中細(xì)胞分化的時(shí)間.AtPLT的表達(dá)會(huì)激活與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因，而且AtPLT的水平越高，激活效果越明顯，隨著AtPLT水平逐漸降低，激活效果也逐漸減弱.AtPLT激活的基因會(huì)優(yōu)先在分生組織分裂區(qū)表達(dá)，而受AtPLT抑制的基因大都在延伸區(qū)和分化區(qū)表達(dá)，表明它不僅維持了細(xì)胞的分裂狀態(tài)，也防止細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)[51].

2.4 basalANT亞譜系

以擬南芥為例，basalANT亞譜系成員包括WRI1（WRINKLED1）、WRI3（WRINKLED3）、WRI4（WRINK LED4）和ADAP.

2.4.1 WRI1成員

WRI1轉(zhuǎn)錄因子有兩個(gè)AP2/ERF結(jié)合域，含有VYL、IDR和PEST等基序，在所表征的WRI1蛋白中高度保守[52]，是參與種子代謝的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.

WRI1中的AP2結(jié)構(gòu)域與AW-box（[CnTnG](n)7[CG]）結(jié)合來調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪酸的生物合成.已經(jīng)證明了WRI1參與調(diào)控糖酵解的基因和脂肪酸合成的酶基因（如ACCase和FAS）[53].對(duì)水稻的研究顯示，WRI1直系同源物（OsWRI1）在水稻種子發(fā)育過程中廣泛表達(dá)[54].擬南芥AtWRI3和AtWRI4的突變未對(duì)種子脂肪酸生物合成基因轉(zhuǎn)錄造成影響[55]，但對(duì)其它組織中的脂肪酸合成非常必要.AtWRI3和AtWRI4的表達(dá)定位于營養(yǎng)組織和花，激活角質(zhì)層蠟質(zhì)的產(chǎn)生[56].目前，有關(guān)WRI3的報(bào)道較少.

2.4.2 AtWRI4成員

AtWRI4主要負(fù)責(zé)控制擬南芥莖中表皮蠟的生物合成.AtWRI4主要在莖表皮中表達(dá)，負(fù)責(zé)合成莖表皮蠟.擬南芥突變體atwri4相對(duì)野生型莖中的總蠟含量降低，但是它們?cè)谌~或角果中沒有顯著改變[56].在蘋果中，MpWRI4通過調(diào)節(jié)角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成基因（如LACS1、KCR1、PAS2、ECR和WSD1）來影響蠟質(zhì)生物合成[57].

2.4.3 ADAP成員

ADAP參與了脫落酸（ABA）反應(yīng)[58]，一方面調(diào)節(jié)種子的發(fā)芽和幼苗的生長，同時(shí)也對(duì)非生物脅迫作出積極響應(yīng)[59].研究顯示ADAP與ARIA互作，而ARIA又可與控制ABA基因的BZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABF2互作，進(jìn)而調(diào)節(jié)ABA反應(yīng).擬南芥突變體atadap的發(fā)芽和幼苗生長都顯著優(yōu)于野生型，表明AtADAP是一種參與植物發(fā)芽和幼苗生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子.同時(shí)該突變體變得對(duì)ABA不敏感，提示AtADAP參與調(diào)節(jié)了ABA反應(yīng).在干旱和高鹽脅迫下，突變體atadap在干旱脅迫下的平均存活率低于野生型，而在高鹽脅迫下的種子萌發(fā)率顯著高于野生型，揭示AtADAP參與了植物對(duì)干旱和高鹽的響應(yīng)[60].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AtADAP是在植物防御中發(fā)揮重要作用的硫代葡萄糖苷GSL生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)因子[61].

3 展望

AP2/ERF是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其功能涉及許多生理過程，包括植物的形態(tài)發(fā)生、對(duì)脅迫的響應(yīng)及代謝物調(diào)節(jié)等.盡管開展了AP2亞家族大多數(shù)成員的研究，但有關(guān)WRI3和ADAP的報(bào)道較少，且對(duì)其研究主要處于基因功能驗(yàn)證階段.未來有關(guān)AP2亞家族的研究應(yīng)著重闡明其分子機(jī)制及涉及的信號(hào)通路，同時(shí)如何與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合仍然是廣大科研工作者未來要攻克的難題，從而為分子育種提供新方案、新策略，以培育出更優(yōu)良的新品種.