胡岳云,謝忠穩(wěn),袁靜靜,李慶林*
茯苓配方浸膏對(duì)高脂飲食小鼠肥胖及脂質(zhì)沉積的影響
胡岳云1,2,謝忠穩(wěn)3,袁靜靜1,李慶林1*
(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230012; 3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物資源與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230036)
為了探究茯苓配方(茯苓、山楂、黃大茶)浸膏對(duì)高脂飲食小鼠肥胖及脂質(zhì)沉積的影響,將 C57/BL 6N小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組,模型組,奧利司他藥物對(duì)照組,茯苓配方(Wolf formula,PWF)浸膏低、高劑量組。除對(duì)照組給予低脂飼料,其他組均以高脂飼料喂養(yǎng)12周。每周記錄小鼠的體重、能量攝入。給藥結(jié)束后,計(jì)算各組小鼠Lee’s指數(shù)、臟器系數(shù),采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察各組小鼠肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞形態(tài)變化,全自動(dòng)生化儀測(cè)定各組小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST及ALT水平變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠體重、Lee’s指數(shù)、臟器系數(shù)、TG、TC、LDL-C、AST及ALT水平均顯著升高(<0.01或<0.001),肝臟脂滴數(shù)量與脂肪細(xì)胞直徑增加;與模型組相比,茯苓配方浸膏高劑量組小鼠體重、Lee’s指數(shù)和臟器系數(shù)均顯著降低(<0.05或<0.01),低劑量組小鼠體重、Lee’s指數(shù)和臟器系數(shù)均沒(méi)有顯著變化,茯苓配方浸膏高劑量組小鼠肝臟脂滴數(shù)量與脂肪細(xì)胞直徑減少,TG、TC、LDL-C水平、AST及ALT水平均顯著降低(<0.05或<0.01或<0.001)。綜上所述,茯苓配方浸膏能夠改善高脂飲食小鼠的體重及脂質(zhì)沉積,為開(kāi)發(fā)改善肥胖的天然物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
茯苓;山楂;黃大茶;肥胖;脂質(zhì)沉積
肥胖被定義為體內(nèi)脂肪過(guò)度積累或異常分布,影響人體健康的一種疾病[1]。在過(guò)去幾十年里,肥胖已經(jīng)成為了一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2],全世界有近20億成年人被認(rèn)為超重,其中超過(guò)一半的人被歸類(lèi)為肥胖[3]。肥胖與心血管疾病的發(fā)病率、死亡率密切相關(guān)[4]。然而,目前對(duì)于肥胖的治療手段并不理想,臨床上采用的減肥手術(shù)或藥物通常都具有一定的副作用[5],危害身體健康。因此,尋找天然的藥食同源物質(zhì)是改善肥胖更為安全有效的策略之一。
肥胖被認(rèn)為是由于濕濁內(nèi)生、痰濕內(nèi)聚誘發(fā)的膏脂堆積[6],因此使用利水滲濕藥物可能是改善肥胖的有效方法。茯苓是一種藥用食用菌,主要功效為鎮(zhèn)靜安定、利水滲濕等,臨床用于心臟病、腎病等[7]。山楂屬于薔薇科植物,有悠久的食用和藥用歷史,在中國(guó)和歐美等國(guó)家被用作傳統(tǒng)藥物、中草藥和膳食補(bǔ)充劑,主要功效為健胃、消食等,臨床用于治療消化不良等[8]。茶是世界上最常用的飲料之一,在茶的發(fā)源地中國(guó),4 000多年來(lái)茶一直被認(rèn)為是一種生藥[9]。黃大茶由“1芽3~6片葉”輕度發(fā)酵制成,是安徽的特產(chǎn)黃茶[10],具有抗菌、抗癌等作用[11]。作為一種稀有而珍貴的茶葉品種,黃大茶因其醇厚的口感和保健功效,具有很高的研究?jī)r(jià)值[12]。
在五色養(yǎng)生理論中,黃色在五臟中與脾對(duì)應(yīng),黃大茶對(duì)脾胃有益,可以健脾利濕[13]。在中醫(yī)輔助傳承系統(tǒng)(traditional chinese medicine inheritance support system,TCMISS)、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)和中國(guó)生物醫(yī)學(xué)(CBM)等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄治療肥胖的方劑中,茯苓、山楂藥對(duì)配伍高度關(guān) 聯(lián)[14-16]。改善肥胖的方劑組成思路,主要是健脾祛濕藥配伍消食化積藥物,因此本實(shí)驗(yàn)選擇茯苓、山楂、黃大茶配對(duì)改善肥胖。
目前尚無(wú)茯苓、山楂、黃大茶三者聯(lián)合用藥改善肥胖的相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)探討三者組成配方對(duì)于改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖及脂質(zhì)沉積的作用,為開(kāi)發(fā)改善肥胖的新產(chǎn)品提供理論依據(jù)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57/BL 6N雄性小鼠40只,體質(zhì)量10~13 g,購(gòu)于南京維通利華公司,于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),條件為12 h/12 h明暗交替,室溫(22±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,定期更換墊料、飲水。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,動(dòng)物倫理編號(hào)為AHUCM-mouse-2020088。
1.1.2 試劑 茯苓(批號(hào)20210730;安徽);山楂(批號(hào)20210730;山東);黃大茶(批號(hào)DB34/ T3020-2017;霍山);奧利司他(批號(hào)96829-58-2;麥克林);組織固定液(合肥臻沃生物醫(yī)藥科技有限公司);TG試劑盒(貨號(hào)110-1-1;南京建成);TC試劑盒(貨號(hào)A111-1-1;南京建成);HDL-C試劑盒(貨號(hào)A112-1-1;南京建成);LDL-C試劑盒(貨號(hào)A113-1-1;南京建成);AST試劑盒(貨號(hào)C010-2-1;南京建成);ALT試劑盒(貨號(hào)C009-2-1;南京建成)
1.1.3 儀器 高速粉碎機(jī)(上海汗諾儀器有限公司);恒溫水浴槽(德祥科技有限公司);KRE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(昆山市超聲儀器有限公司);ALPHA1-2LD 真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó) CHRIST 公司);全自動(dòng)生化分析儀(日立診斷產(chǎn)品上海有限公司);石蠟自動(dòng)切片機(jī)(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);顯微鏡(德國(guó) OLYMPUS BXS1);微量離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。
表1 動(dòng)物飼料制備配方
1.2.1 茯苓配方浸膏及動(dòng)物飼料的制備 分別稱(chēng)取茯苓 215 g,山楂 108 g,黃大茶 215 g(質(zhì)量比為2∶1∶2),純水煎煮1 h,料液比1∶10,重復(fù)煎煮3次,抽濾并合并藥液,旋轉(zhuǎn)濃縮成浸膏狀,–20 ℃保存過(guò)夜,真空冷凍干燥,得凍干粉149 g,提取率約為27.7%。低脂飼料參照美國(guó)Research Diets 公布的D12450H配方制備,高脂飼料參照D12451配方制備,具體成分見(jiàn)表1。
1.2.2 分組與造模 將小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只,適應(yīng)性飼養(yǎng)2周,分別為對(duì)照組,模型組,奧利司他組(0.03 g·kg-1),茯苓配方浸膏低劑量組(0.6 g·kg-1)、茯苓配方浸膏高劑量組(2.4 g·kg-1),查閱2020版《中國(guó)藥典》常用劑量換算得來(lái)[17],對(duì)照組給予低脂飼料喂養(yǎng),其他組給予高脂飼料喂養(yǎng),給藥組分別灌胃相應(yīng)劑量藥物,給藥12周,對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。定期觀察各組小鼠的攝食量、毛發(fā)、精神狀態(tài)等。
1.2.4 組織學(xué)HE染色 固定在4%多聚甲醛的肝臟及脂肪組織過(guò)夜沖水,依次經(jīng)過(guò)不同濃度的乙醇溶液、二甲苯、石蠟脫水包埋,以5mm厚度切片、展片、烤片,將石蠟切片進(jìn)行脫蠟,不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行復(fù)水,蘇木精、伊紅染色,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍照。
1.2.5 血清指標(biāo)檢測(cè) 摘小鼠眼球取血,4 ℃靜置6 h,于低溫離心機(jī)5 000 g,離心5 min,收集上層血清,于–80 ℃保存。根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)各組小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST和ALT水平。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析中的多重比較分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性。
分析各組小鼠12周的體重及Lee’s指數(shù),與對(duì)照組相比,模型組小鼠體重與Lee’s指數(shù)顯著增加(<0.001);與模型組相比,奧利司他組小鼠體重與Lee’s指數(shù)顯著降低(<0.001),茯苓配方浸膏高劑量組小鼠體重與Lee’s指數(shù)顯著下降(<0.01),低劑量組小鼠體重與Lee’s指數(shù)無(wú)顯著變化。觀察各組小鼠能量攝入發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠每天能量攝入顯著增加(<0.001);與模型組相比,奧利司他組、茯苓配方浸膏低劑量組、高劑量組小鼠每天的能量攝入均無(wú)顯著差異。以上結(jié)果見(jiàn)圖1及表2,表明高劑量茯苓配方浸膏能夠在不影響小鼠能量攝入的前提下,降低小鼠體重。
表2 茯苓配方浸膏對(duì)小鼠Lee’s指數(shù)的影響(`x ± s, n=6~8)
注:與對(duì)照組相比, ###<0.001;與模型組相比, **<0.01,***<0.001;下同。
與對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;下同。
Figure 1 Effects of PWF extracts on body weight (a) and energy intake (b) in mice (`±=6-8)
分析各組小鼠組織重量及臟器系數(shù)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟、棕色脂肪組織、皮下脂肪組織及附睪脂肪組織的重量及臟器系數(shù)均顯著增加(<0.01或<0.001);與模型組相比,奧利司他組小鼠肝臟、棕色脂肪組織、皮下脂肪組織、附睪脂肪組織的重量及臟器系數(shù)均顯著降低(<0.01或<0.001),茯苓配方浸膏高劑量組小鼠肝臟、棕色脂肪組織、皮下脂肪組織及附睪脂肪組織的重量及臟器系數(shù)均顯著降低(<0.05或<0.01或<0.001),低劑量組小鼠各臟器重量及系數(shù)均無(wú)顯著變化,結(jié)果見(jiàn)表3、表4。脂肪組織主要含有脂類(lèi),參與調(diào)節(jié)全身代謝[18],因此觀察各組小鼠脂肪組織的脂質(zhì)沉積情況。HE染色各組小鼠的肝臟及脂肪組織發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠的肝臟含有大量脂滴,棕色脂肪組織、皮下脂肪組織及附睪脂肪組織細(xì)胞直徑增加;與模型組相比,奧利司他組小鼠及茯苓配方浸膏高劑量組小鼠肝臟中脂滴數(shù)量減少,棕色脂肪組織、皮下脂肪組織及附睪脂肪組織細(xì)胞直徑減小,結(jié)果見(jiàn)圖2。以上結(jié)果說(shuō)明高劑量茯苓配方浸膏能夠改善肥胖伴隨的脂質(zhì)沉積。
表3 茯苓配方浸膏對(duì)小鼠組織重量的影響(`x± s, n=6~8)
表4 茯苓配方浸膏對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(`x± s, n=6~8)
(a) 肝臟HE圖(×400);(b) 棕色脂肪組織HE圖(×400);(c) 皮下脂肪組織HE圖(×200);(d) 附睪脂肪組織HE圖(×200)。
Figure 2 Effects of PWF extracts on lipid deposition of Liver (a), Brown adipose tissue (b), Subcutaneous adipose tissue (c) and Epididymal adipose tissue (d) in mice (×400, ×200)
臨床研究表明,肥胖患者的血清中膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平較高,高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平較低[19],因此進(jìn)一步檢測(cè)各組小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。與對(duì)照組相比,模型組小鼠TG、TC和LDL-C水平均顯著增加(<0.001);與模型組相比,奧利司他組小鼠TC、LDL-C水平顯著降低(<0.001、<0.01),茯苓配方浸膏高劑量組小鼠TG、TC和LDL-C水平均顯著下降(<0.05或<0.001),各組小鼠血清中HDL-C水平無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高劑量茯苓配方浸膏對(duì)肥胖誘發(fā)的血脂異常有改善作用。
圖3 茯苓配方浸膏對(duì)小鼠TG(a)、TC(b)、HDL-C(c)及LDL-C(d)水平的影響(`x ± s, n=6)
Figure 3 Effects of PWF extracts on content of TG (a), TC (b), HDL-C (c) and LDL-C (d) in mice (`±,=6)
圖4 茯苓配方浸膏對(duì)小鼠AST(a)和ALT(b)水平的影響(`x± s, n=6)
Figure 4 Effects of PWF extracts on content of AST (a) and ALT (b) in mice (`±,=6)
肝臟在脂肪的存儲(chǔ)與運(yùn)輸過(guò)程中起著重要作用,當(dāng)脂質(zhì)代謝失衡時(shí),脂質(zhì)會(huì)積累在肝臟中,造成肝功能損傷[20]。臨床應(yīng)用中,肝酶的水平常被作為評(píng)價(jià)肝損傷的重要指標(biāo),最常用的評(píng)估指標(biāo)是谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)[21]。因此,為了考察茯苓配方浸膏對(duì)小鼠肝功能的作用,檢測(cè)各組小鼠血清中AST和ALT水平。與對(duì)照組相比,模型組小鼠AST、ALT水平均顯著升高(<0.001、<0.01);與模型組相比,奧利司他組小鼠AST、ALT水平降低,茯苓配方浸膏高劑量組小鼠AST、ALT水平顯著降低(<0.01、<0.05),表明高劑量茯苓配方浸膏對(duì)肝功能損傷有改善作用。
茯苓有很高的藥用價(jià)值,通常與其他物質(zhì)配伍使用,在許多方劑中都發(fā)揮著不可替代的作用,在2015年版《中國(guó)藥典》中,含有茯苓的制劑約占15%[22]。山楂是藥食兩用的天然產(chǎn)物,在《中藥成方試劑》中收錄含山楂的方劑共有308個(gè),其中山楂與健脾祛濕藥物聯(lián)用居多[23]。黃大茶是中國(guó)特有的一種微發(fā)酵茶,特殊的“密封變黃”制作工藝,使得黃大茶不僅擁有獨(dú)特的“鍋巴香”風(fēng)味[24],而且富含多酚、可溶性糖、維生素等物質(zhì),具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。茯苓、山楂和黃大茶均具有很高的食用與藥用價(jià)值,但在應(yīng)用時(shí),通常是配伍其他物質(zhì)發(fā)揮功效的。
飲食滯留于脾胃易化生熱邪,濕熱互結(jié)臟腑,導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失調(diào),水濕內(nèi)停,聚濕成痰,淤積于體內(nèi)而導(dǎo)致肥胖[6]。臨床使用由葛根芩連湯為基礎(chǔ)方加減而成的清熱利濕健脾方對(duì)濕熱困脾型肥胖2型糖尿病患者進(jìn)行治療[25],能夠顯著降低患者的高血糖、高血脂。基于肥胖患者多為痰濕體質(zhì),本研究中茯苓、山楂與黃大茶配伍能夠發(fā)揮健脾利濕功效,改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖。
脂肪組織是脂類(lèi)新陳代謝、儲(chǔ)存和分解的主要樞紐[26],其中白色脂肪組織是一種內(nèi)分泌器官,通過(guò)存儲(chǔ)和分泌脂質(zhì),影響人體的血脂水平以及新陳代謝。與肥胖相關(guān)的高脂血癥是一系列心血管疾病和代謝紊亂的危險(xiǎn)因素,肥大的脂肪細(xì)胞是肥胖的標(biāo)志,被廣泛認(rèn)為是高脂血癥的主要誘因[18]。本研究發(fā)現(xiàn)奧利司他及茯苓配方浸膏能夠減小高脂飲食小鼠的皮下脂肪、附睪脂肪等白色脂肪組織以及棕色脂肪組織的脂肪細(xì)胞肥大,改善脂質(zhì)沉積,并顯著降低血脂TG、TC、LDL-C水平。臨床發(fā)現(xiàn),肝臟發(fā)生脂肪變性與體重存在正相關(guān)性[27],在約90%的肥胖患者中,肝臟會(huì)出現(xiàn)脂肪空泡,發(fā)生脂肪變性[20]。肥胖患者的AST及ALT水平通常是顯著升高的,血清中ALT水平是評(píng)估肝功能障礙的特殊標(biāo)志[28]。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓配方浸膏能夠減少肝臟中的脂滴含量,改善肝臟的脂肪變性,顯著降低AST、ALT的水平,對(duì)高脂飲食小鼠肝損傷有一定的改善作用。
研究報(bào)道,茯苓多糖、山楂黃酮、咖啡因、表沒(méi)食子酸兒茶素酸酯均有抗肥胖作用。茯苓多糖能夠通過(guò)增加膽固醇相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),促進(jìn)膽固醇代謝來(lái)改善高脂飲食小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積[29];山楂黃酮能夠上調(diào)激素敏感酯酶(hormone-sensitive lipase,HSL)、甘油三酯水解酶及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c等脂解相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪分解,減少小鼠體脂沉積[30];咖啡因能夠通過(guò)抑制腺苷受體和調(diào)控交感神經(jīng)系統(tǒng)增加兒茶酚胺水平來(lái)促進(jìn)脂肪組織中的脂肪分解過(guò)程[31];表沒(méi)食子酸兒茶素酸酯能夠通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞中脂肪分解酶,如HSL等的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累[32]。因此,推測(cè)茯苓配方浸膏可能通過(guò)促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)或脂肪分解等脂質(zhì)代謝途徑來(lái)改善小鼠肥胖及脂質(zhì)沉積。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)茯苓配方浸膏能夠減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖,改善肥胖伴隨的脂質(zhì)沉積及肝功能損傷,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全有效的改善肥胖的天然產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。
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Effects ofWolf formula extracts on obesity and lipidosis in high-fat diet-induced mice
HU Yueyun1,2, XIE Zhongwen3, YUAN Jingjing1, LI Qinglin1
(1. Key Laboratory of Xin'an Medicine, Ministry of Education, Anhui University of Chinese, Hefei 230038; 2. Medicine School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012; 3. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
To study the effects of the combined formula (Wolf,N. E. Br., and large-leaf yellow tea, PWF) extracts on obesity and lipidosis in high-fat diet (HFD)-fed mice, C57/BL 6N male mice were randomly divided into five groups: low-fat diet (Control), HFD (Model), Orlistat, the low-dose PWF extracts, and the high-dose PWF extracts. The body weight and energy intake of mice were recorded weekly. After a 12-week treatment, Lee’s index and organ coefficient were calculated. Hematoxylin-eosin (HE) staining visualized morphological changes of hepatocytes and adipocytes. The serum levels of TG, TC, HDL-C, LDL-C, AST, and ALT were detected by an automatic biochemistry analyzer. The results showed that the body weight, Lee’s index, organ coefficient, and levels of TG, TC, LDL-C, AST, and ALT were significantly increased (<0.01 or<0.001) as well as the number of lipid droplets of the liver, and the diameter of adipocyte were increased in the HFD model group, compared with the LFD control group. Compared with the model group, the body weight, Lee’s index, and organ coefficient of the high-dose PWF extracts group were significantly decreased (<0.05 or<0.01), while the body weight, Lee’s index, and organ coefficient of the low-dose PWF extracts group were no difference. The levels of TG, TC, LDL-C, AST, and ALT were significantly decreased (<0.05 or<0.01 or<0.001) as well as the number of lipid droplets of the liver, and the diameter of adipocyte were decreased in the high-dose PWF extracts group. In conclusion,PWF extracts significantly reduced HFD-induced obesity and lipidosis, providing a theoretical basis for using traditional Chinese medicine in the improvement of obesity.
Wolf;N. E. Br.; large-leaf yellow tea; obesity; lipidosis
R281.5
A
1672-352X (2023)02-0349-07
[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1338.042.html
2023-01-15
國(guó)家自然科學(xué)基金(82204707),安徽省教育廳高校協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(GXXT-2019-049)和安徽中醫(yī)藥大學(xué)人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(2021rcyb004)共同資助。
胡岳云,碩士研究生,E-mail:1900143094@qq.com
通信作者:李慶林,博士,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:liqinglin@ahtcm.edu.cn
10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.021
2023-05-12 09:39:04
安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2023年2期