禽致病性大腸桿菌clpV基因缺失對雛雞氣管黏膜細胞因子-細胞因子受體相互作用通路的影響

蔣胡艷，肖福泉，龔柳菲，薛新穎，邵 穎，涂 健，祁克宗，宋祥軍

禽致病性大腸桿菌基因缺失對雛雞氣管黏膜細胞因子-細胞因子受體相互作用通路的影響

蔣胡艷，肖福泉，龔柳菲，薛新穎，邵 穎，涂 健，祁克宗，宋祥軍*

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036)

為探究基因在禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic, APEC）感染雛雞氣管黏膜過程中發(fā)揮的作用及機制。將APEC野生株（DE17）及其基因缺失株（DE17Δ）感染7日齡雛雞氣管，12、24 h后收集雛雞氣管黏膜細胞進行轉錄組學測序，篩選野生株和缺失株的差異表達基因，進行GO和KEGG富集分析。結果顯示，在感染12 h后，共篩選到108個差異表達基因（36個上調，72個下調）；在感染24 h后，共篩選到59個差異表達基因（34個上調，25個下調）。GO分析表明，差異表達基因主要富集在細胞內(nèi)信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ的轉錄正調控等生物學過程；蛋白質結合、ATP合成、DNA結合等分子功能類；生物膜及膜的組成成分、細胞質等細胞組分功能；KEGG分析表明，差異表達基因主要富集在緊密連接通路、內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路、細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、內(nèi)吞通路、Wnt信號通路等。結論為基因缺失后，會使部分差異表達基因的表達量下調，對細胞因子-細胞因子受體相互作用等通路產(chǎn)生影響。

禽致病性大腸桿菌；VI型分泌系統(tǒng)；基因；轉錄組學測序；氣管黏膜細胞

禽致病性大腸桿菌 (Avian pathogenic, APEC) 屬于腸道外致病性大腸桿菌，可引起局部或全身性感染[1]，從而導致禽類多系統(tǒng)損傷，主要發(fā)病類型有氣囊炎、肝周炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎等，嚴重可導致胚胎和幼雛死亡[2]，不僅對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有巨大的影響，而且威脅人類的健康。APEC的致病機制十分復雜，有研究表明多種毒力因子是促進禽類腸道外疾病的起因。已發(fā)現(xiàn)的毒力因子包括：黏附素、溶血素、侵襲素、二元調控系統(tǒng)、群體感應系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)等[3]，多種因子能協(xié)調運作，增強APEC的致病力。其中，分泌系統(tǒng)能夠將各種效應蛋白運送至胞外或直接注入宿主細胞內(nèi)[4]，在細菌侵入宿主感染機體的過程中發(fā)揮重要作用。

VI 型分泌系統(tǒng) (type VI secretion system，T6SS) 是一種新型的細菌蛋白分泌系統(tǒng)，廣泛的存在于革蘭氏陰性菌中，可以介導致病菌與宿主的相互作 用[5]，在APEC 的致病過程中扮演重要角色。T6SS是一種多功能的蛋白質注射裝置，核心組分是13種蛋白和若干附屬組件[6]，主要由膜復合物，尾部復合物和基座復合物三部分組成[7]。T6SS通過跨雙層膜管道以注射器的形式將分泌效應蛋白從胞質轉運到靶細胞或胞外環(huán)境中[8]，以接觸依賴的方式主要靶向競爭菌以參與菌間競爭或靶向真核宿主從而致病[9]。T6SS的核心組分包括溶血素共調節(jié)蛋白(Hcp)、纈氨酸谷氨酸重復蛋白 (VgrG)、細胞器運輸?shù)鞍?(DotU)、ATP 水解酶 (ClpV) 等[10]。Hcp和VgrG既是T6SS的效應蛋白又是分泌蛋白，Hcp形成六聚環(huán)結構延伸至VgrG穿刺裝置將效應蛋白注射到細胞內(nèi)[11]。分子伴侶ClpV是T6SS中的能量結合蛋白，為T6SS 的運行提供能量[12]。

ClpV屬于ATP酶超家族，與VgrG和Hcp蛋白結合形成復合物，進而為 T6SS分泌效應蛋白提供 ATP[13]。T6SS 基因簇編碼的 ClpV蛋白在對 T6SS 提供能量過程中占主導地位，與整個系統(tǒng)能量供給相關。其與ATP結合后，利用水解獲得的能量以六聚體形式水解底物蛋白，拆解T6SS，完成T6SS的回收和組裝[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcp1的分泌需要ClpV AAA- 1結構域水解ATP，ClpV是在Hcp分泌過程中所必需的[15]。

在APEC感染宿主的過程中，細菌侵入并附著在禽類的呼吸道，黏附氣管是APEC感染過程的一個重要步驟[16]。APEC感染雛雞氣管可導致氣管黏膜發(fā)生病理變化，并導致細胞因子與細胞因子受體相互作用通路基因表達量發(fā)生變化[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，基因缺失后，上清中無法檢測到效應蛋白Hcp和VgrG，從而導致 APEC的T6SS功能的缺失[18]?；驅PEC的致病性有著重要作用，但基因在APEC感染禽氣管黏膜過程中發(fā)揮的具體作用尚不清楚?；诖?，本研究將基因缺失株通過氣管感染雛雞，并篩選氣管黏膜細胞差異表達的mRNA，進行生物學信息分析。探究基因對雛雞氣管黏膜上皮細胞的調控作用，為進一步探究T6SS在APEC致病過程發(fā)揮的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

禽致病性大腸桿菌野生株 (DE17) 和基因缺失株DE17Δ前期已由實驗構建得到[19]，由安徽農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存。試驗雛雞為購于安徽省安禽禽業(yè)有限公司的羅曼蛋雞（1日齡）。

1.2 主要試劑

酵母提取物，購自上海生工公司；氯化鈉、氯霉素、氨芐青霉素，卡那霉素購自上海生工公司；其他試劑有無菌PBS、液氮等。

1.3 雛雞氣管注射

將?DE17以1∶100的比例進行轉接，37 ℃培養(yǎng)至OD=1.0，無菌PBS洗滌菌液3遍，調整菌液濃度為1×106cfu·mL-1。購入的1日齡雛雞同等條件下飼養(yǎng)至7日齡，將7日齡雛雞分成4組（野生株2組，缺失株2組），每組3只。將處理好的菌液分別通過氣管注射DE17和?的方式感染7日齡雛雞，按照50 μL、1×108cfu·mL-1的劑量感染，對照組注入等量的PBS。

1.4 雛雞氣管黏膜細胞轉錄組學測序

1.4.1 組織樣品準備 分別于感染后的12、24 h刮取氣管黏膜，收集氣管黏膜上皮細胞，液氮冷凍后于﹣80 ℃保存，樣品送至杭州聯(lián)川生物公司，利用Illumina Novaseq? 6000進行轉錄組測序。對測序的原始數(shù)據(jù)使用cutadap去除帶接頭 (Akdaptor) 的、無法確定堿基信息的比例大于5%的、低質量的reads，統(tǒng)計原始測序量，對有效測序量，Q20（質量大于20的堿基占總被測堿基的比值），Q30（質量大于 30的堿基占總被測堿基的比值），GC含量（基因中鳥嘌呤 (G) 和胞嘧啶 (C) 的總量在雙股DNA 的4種堿基中的占比）進行綜合測評，利用Hisat對預處理后的數(shù)據(jù)進行參考基因組比對。

1.4.2 差異表達基因的篩選 根據(jù)FPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments mapped) 算法度量基因表達的豐度值，進行樣本間差異分析，以|log2foldchange|≥ 1，≤ 0.05為標準對差異表達基因進行篩選。

1.4.3 GO與KEGG的富集分析 根據(jù)篩選出的差異基因，進行GO和KEGG富集分析，計算GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中各個條目映射的差異表達基因數(shù)目，并進行超幾何檢驗。對比整個基因組，篩選出差異表達基因顯著富集的GO條目和KEGG條目。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因的篩選

以|log2fold change| ≥ 1，≤ 0.05為篩選標準，與野生株DE17相比，?在感染氣管的不同時間段均獲得差異表達基因。在感染12 h后，共篩選到108個差異表達基因，其中，36個基因表達量上調，72個基因表達量下調，結果如圖1(a)所示；在感染24 h后，共篩選到59個差異表達基因，其中，34個基因表達量上調，25個基因表達量下調，結果如圖1(b)所示。根據(jù)篩選出的差異表達基因，得到感染?組部分差異表達基因，結果如表1所示。

2.2 GO功能分析結果

對差異表達基因進行生物信息學分析，GO分析結果（表2）可得知，在感染Δ菌株12 h后，108個差異表達基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ的轉錄正調控、DNA轉錄調控、信號轉導等生物學過程；蛋白質結合、ATP合成等分子功能類；生物膜及膜的組成成分、細胞質等細胞組分功能。在感染Δ菌株24 h后，59個差異表達基因主要富集在細胞內(nèi)信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ的轉錄正調控等生物學過程；蛋白質結合、ATP合成、DNA結合等分子功能類；生物膜及膜的組成成分、細胞質等細胞組分功能。

圖1 差異表達基因的篩選

Figure 1 Screening of differentially expressed genes

表1 感染?clpV組部分差異表達基因

表2 感染? clpV組GO條目富集列表

圖2 感染?clpV組KEGG功能分析

Figure 2 KEGG function analysis of group infected by ?

2.3 KEGG富集分析結果

通過計算差異表達基因，對其進行KEGG富集分析。橫軸為Rich factor（富集因子），縱軸為pathway name（通路名稱）。KEGG分析結果表明感染?菌株12 h后，差異表達基因主要富集在細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路等，如圖2(a)所示。在感染?菌株24 h后，差異表達基因主要富集在內(nèi)吞通路、緊密連接通路、Wnt信號通路等，如圖2(b)所示。

3 討論與結論

禽致病性大腸桿菌是禽大腸桿菌病的主要病原菌，禽的大腸桿菌病是目前禽類最為常見的細菌性傳染疾病之一[20]，世界各地的養(yǎng)禽業(yè)都受到它的嚴重威脅。T6SS在APEC的競爭和致病過程中發(fā)揮著重要作用。2006年，在銅綠假單胞菌和霍亂弧菌中首次發(fā)現(xiàn)T6SS，并且T6SS首次作為新型的細菌蛋白分泌系統(tǒng)被定義[21]。T6SS類似于噬菌體尾鞘結構，通過膜相關的復合物錨定在細菌的細胞表面，細胞質內(nèi)鞘的收縮推動由 Hcp蛋白組成的內(nèi)管道通過由VgrG和PAAR組成的刺穿裝置頂向靶細胞，與這個收縮結構相關的效應因子因此被轉運到宿主細胞[22]。一旦效應因子被傳遞至靶細胞，收縮鞘就會在ClpV的作用下拆解。ClpV是AAA+蛋白家族成員[23]，是六聚體ATP酶，位于細胞質內(nèi)。ClpV 的N端無催化活性，C端具有ATP 結合結構域，為T6SS提供 ATP，但其對APEC的調控作用目前尚不清楚[24]。

禽致病性大腸桿菌感染宿主首先要黏附定殖于宿主細胞表面，黏附素是病原菌重要的毒力因子，位于細菌的表面，通過結合宿主細胞表面受體避免被宿主清除到體外[25]。因此，本研究將?菌株以氣管注射的方式感染雛雞，以注射菌株DE17為對照組，研究基因缺失后對雞氣管黏膜細胞mRNA表達譜的影響。注射?菌株12 h、24 h后，差異表達基因主要富集在內(nèi)質網(wǎng)中的細胞因子與細胞因子受體相互作用通路、蛋白質加工通路、緊密連接通路等。前期已有試驗發(fā)現(xiàn)APEC感染影響雞氣管內(nèi)細胞因子-細胞因子受體相互作用通 路[26]，本試驗在此基礎上，重點關注基因缺失后，對雛雞氣管內(nèi)細胞因子-細胞因子受體相互作用通路的影響。

細胞因子是由免疫細胞及相關細胞產(chǎn)生的一類多功能蛋白多肽分子，種類繁多，可分為白細胞介素、干擾素、趨化因子等，它們與細胞因子受體結合才能發(fā)揮作用。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路具有免疫調節(jié)和免疫效應相關功能，在細菌感染宿主的炎癥過程中發(fā)揮重要調控作用[27]。分析測序結果總結發(fā)現(xiàn)，在感染12 h和24 h后，富集在細胞因子與細胞因子受體通路的差異表達基因分別為4個 (、、、) 和3個 () ，且表達量均顯著下調。CCL5通過與其受體CCR1、CCR3、CCR4等結合時，發(fā)揮趨化活性[28]，參與免疫反應。IL1β作為IL-1的重要成員之一，是由上皮細胞、單核細胞等產(chǎn)生的促炎細胞因子，可在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮作用[29]。當IL1β與其受體結合后，即可誘發(fā)一系列炎癥介質及相關趨化因子的釋放，從而引發(fā)炎癥反應。IL1β不僅可以通過旁分泌的方式作用于局部，還可以通過內(nèi)分泌的方式引起全身免疫反應，同時IL1β還可以誘導其他細胞因子如IL6、IL8的表達[30]?；蛉笔е螅瑢е?、表達量的下調，降低了機體炎癥反應的發(fā)生。

在真核細胞中，內(nèi)質網(wǎng)作為蛋白質折疊、轉錄后修飾和轉運的重要細胞器，參與蛋白質的加工以及運輸。當機體受到外源抗原侵襲時，機體需要大量的抗體來應對抗原，機體產(chǎn)生抗體的過程中需要大量蛋白質。在感染?菌株12 h后，富集在內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工通路的差異表達基因表達量均上調，如等，這些基因參與蛋白質的翻譯、折疊、轉運和降解改變，從而導致內(nèi)質網(wǎng)蛋白加工異常，宿主細胞發(fā)生病變[31]。大量的差異表達基因的上調，使得蛋白質輸出增多，抗體增加，應對外源抗體，加快機體的恢復。這為深入研究基因在APEC致病中的作用提供思路。

緊密連接位于相鄰細胞之間，維持著上皮細胞屏障和上皮細胞極性，是上皮和內(nèi)皮細胞間的重要屏障結構[32]。細胞之間的緊密連接閉合了相鄰上皮細胞之間的間隙，阻止了病原微生物和抗原物質進入黏膜的固有層以激活免疫細胞，并維持了黏膜屏障功能的穩(wěn)定性[33]。在感染?菌株24 h后，緊密連接通路中有3個基因上調表達和2個基因下調表達，這說明基因可能通過影響緊密連接功能進而導致黏膜屏障功能受損。

綜上所述，禽致病性大腸桿菌基因缺失株可以通過細胞因子-細胞因子受體相互作用等通路影響機體的炎癥反應和免疫過程。本研究初步探究了基因缺失后感染雛雞后影響氣管黏膜細胞的mRNA表達，差異表達基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路，為深入研究 T6SS 的功能及防控禽致病性大腸桿菌提供了參考。

[1] CROXEN M A, FINLAY B B. Molecular mechanisms ofpathogenicity[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(1): 26-38.

[2] GONG J S, XU M, ZHU C H, et al. Antimicrobial resistance, presence of integrons and biofilm formation ofisolates from Eastern China (1962-2010)[J]. Avian Pathol, 2013, 42(3): 290-294.

[3] HVISTENDAHL M. Public health. China takes aim at rampant antibiotic resistance[J]. Science, 2012, 336(6083): 795.

[4] 林清鵬. 病原菌中六型分泌系統(tǒng)相關蛋白Hcp的結構與功能研究[D]. 合肥: 中國科學技術大學, 2017.

[5] 于菲菲. 六型分泌系統(tǒng)在豬源腸外致病性大腸桿菌引起宿主天然免疫過程中的作用研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學, 2018.

[6] MA J L, BAO Y L, SUN M, et al. Two functional type VI secretion systems in avian pathogenicare involved in different pathogenic pathways[J]. Infect Immun, 2014, 82(9): 3867-3879.

[7] NAVARRO-GARCIA F, RUIZ-PEREZ F, CATALDI á, et al. Type VI secretion system in pathogenic: structure, role in virulence, and acquisition[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 1965.

[8] BOYER F, FICHANT G, BERTHOD J, et al. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?[J]. BMC Genomics, 2009, 10: 104.

[9] DURAND E, CAMBILLAU C, CASCALES E, et al. VgrG, Tae, Tle, and beyond: the versatile arsenal of Type VI secretion effectors[J]. Trends Microbiol, 2014, 22(9): 498-507.

[10] 連麗燕, 宋祥軍, 蔣胡艷, 等. Ⅵ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白ClpV對禽致病性大腸桿菌生物學特性的影響[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2021, 43(8): 848-853.

[11] 劉新. 禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2核心組分VgrG致病作用及調控研究[D]. 揚州: 揚州大學, 2016.

[12] 王棟, 王少輝, 徐鳳, 等. Ⅵ型分泌系統(tǒng)2核心組分ClpB對禽致病性大腸桿菌生物學特性及致病性的影響[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2016, 46(7): 834-840.

[13] 岑雪, 丁雪燕, 婁昆鵬, 等. 細菌分泌系統(tǒng)研究進展[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2019, 41(3): 317-322, 327.

[14] HO B T, DONG T G, MEKALANOS J J. A view to a kill: the bacterial type VI secretion system[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(1): 9-21.

[15] 羅國棟. 嗜水氣單胞菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)分子伴侶蛋白ClpV基因的克隆及生物信息學分析[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學, 2018.

[16] PIZARRO-CERDá J, COSSART P. Bacterial adhesion and entry into host cells[J]. Cell, 2006, 124(4): 715-727.

[17] SONG S J, JIANG H Y, QI Z, et al. APEC infection affects cytokine–cytokine receptor interaction and cell cycle pathways in chicken trachea[J]. Res Vet Sci, 2020, 130: 144-152.

[18] MA J L, BAO Y L, SUN M, et al. Two functional type VI secretion systems in avian pathogenicare involved in different pathogenic pathways[J]. Infect Immun, 2014, 82(9): 3867-3879.

[19] 連麗燕, 宋祥軍, 蔣胡艷, 等. Ⅵ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白ClpV對禽致病性大腸桿菌生物學特性的影響[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2021, 43(8): 848-853.

[20] 郭良富. 禽大腸桿菌病及其中西醫(yī)防治[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2021, 42(3): 27-29.

[21] JANI A J, COTTER P A . Type VI secretion: not just for pathogenesis anymore[J]. Cell Host Microbe, 2010, 8(1): 2-6.

[22] 劉新. 禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2核心組分VgrG致病作用及調控研究[D]. 揚州:揚州大學, 2016.

[23] PIETROSIUK A, LENHERR E D, FALK S, et al. Molecular basis for the unique role of the AAA+chaperone ClpV in type VI protein secretion[J]. J Biol Chem, 2011, 286(34): 30010-30021.

[24] 宋祥軍, 沈嘯, 蔣胡艷, 等. 禽致病性大腸桿菌Hcp2b對雛雞氣管黏膜細胞因子-細胞因子受體相互作用通路的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2021, 52(3): 742-751.

[25] 劉新, 王少輝, 孟慶美, 等. VI型分泌系統(tǒng)2核心組分VgrG對禽致病性大腸桿菌致病性的影響[J]. 微生物學通報, 2016, 43(9): 2106-2113.

[26] ONG S J, JIANG H Y, QI Z, et al. APEC infection affects cytokine–cytokine receptor interaction and cell cycle pathways in chicken trachea[J]. Res Vet Sci, 2020, 130: 144-152.

[27] 肖勘, 涂治驍, 黃菲菲, 等. 細胞因子信號傳導抑制因子1在雙氧水誘導的IPEC-1細胞炎癥和損傷中的作用[J].中國畜牧雜志, 2021, 57(7): 159-163.

[28] GLASS W G, ROSENBERG H F, MURPHY P M. Chemokine regulation of inflammation during acute viral infection[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2003, 3(6): 467-473.

[29] DONG M C, YANG L L, QU M L, et al. Autocrine IL-1β mediates the promotion of corneal neovascularization by senescent fibroblasts[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2018, 315(5): C734-C743.

[30] STORR S J, SAFUAN S, AHMAD N, et al. Macrophage-derived interleukin-1beta promotes human breast cancer cell migration and lymphatic adhesion[J]. Cancer Immunol Immunother, 2017, 66(10): 1287-1294.

[31] MOL N, PENG L C, ESNAULT E, et al. Avian pathogenicinfection of a chicken lung epithelial cell line[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2019, 210: 55-59.

[32] 牛亞楠, 高宇, 何倚帆, 等. 上皮細胞黏附分子增強細胞間緊密連接促進乳腺癌細胞耐藥[J]. 中國生物化學與分子生物學報,2022,38(6):809-815.

[33] 朱鵬. 十二指腸賈第蟲組織蛋白酶B對腸上皮細胞緊密連接功能和抗菌肽表達的影響[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學, 2021.

Effect of avian pathogenicgene deletion on the cytokine-cytokine receptor interaction pathway in chick tracheal mucosa

JIANG Huyan, XIAO Fuquan, GONG Liufei, XUE Xinying, SHAO Ying, TU Jian, QI Kezong, SONG Xiangjun

(School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

To investigate the role and mechanism of thegene in the process of Avian pathogenic(APEC) infection of the chicks racheal mucosa. In this study, 7-day-old chicks were infected with the wild strain (DE17) and the deletion strain (DE17Δ) of APEC, and the chicks' tracheal mucosa cells were collected 12 and 24 h later for transcriptomic sequencing to screen the differentially expressed genes of the wild strain and the deletion strain. The results showed that a total of 108 differentially expressed genes (36 up-regulated and 72 down-regulated) were screened 12 h after infection and 59 differentially expressed genes (34 up-regulated and 25 down-regulated) were screened 24 h after infection. GO analysis showed that the differentially expressed genes were mainly enriched in biological processes such as intracellular signal transduction, positive regulation of RNA polymerase II transcription; protein binding, ATP synthesis, DNA binding and other molecular functional classes; cellular component functions such as biofilm and membrane components, cytoplasm. KEGG analysis showed that the differentially expressed genes were mainly enriched in the tight junction pathway, protein processing pathway in the endoplasmic reticulum, cytokine-cytokine receptor interaction pathway, endocytosis pathway and Wnt signalling pathway, etc. It was concluded that deletion of thegene resulted in the down-regulation of the expression of some of the differentially expressed genes, with effects on pathways such as cytokine-cytokine receptor interactions.

avian pathogenic; type VI secretion system;gene; transcriptome sequencing; tracheal mucosal cells

S852.612

A

1672-352X (2023)02-0255-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.007

2023-05-12 10:17:39

2022-04-29

安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(S202110364034)，國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(202110364009)和安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項(202110364027)共同資助。

蔣胡艷，碩士研究生。E-mail：1678207529@qq.com 肖福泉，本科生。E-mail：2044548530@qq.com

通信作者:宋祥軍，博士，副教授。E-mail：sxj@ahau.edu.cn

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1152.014.html