中藥材黃連水浸提液對梨樹腐爛病的室內(nèi)防效評價(jià)

蔣晶晶　冀欽隴　周昭旭　徐生海　許永鋒　杜蕙

摘要：梨樹腐爛病是危害梨樹生產(chǎn)的重要病害之一，為探尋梨樹腐爛病（Pear valsa canker）的綠色防治藥劑，室內(nèi)采用菌絲生長速率法和離體枝條打孔接種法，測定了不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病菌菌落生長的影響及其在離體梨樹枝條上的保護(hù)作用。結(jié)果表明，不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病菌均有不同程度的抑制作用，其中濃度為5.000 0%時(shí)抑菌率高達(dá)100%；當(dāng)黃連水浸提液濃度為5.000 0%和10.000 0%時(shí)，病疤面積間無顯著差異，室內(nèi)防效分別高達(dá)75.8%和78.2%。表明不同濃度的中藥材黃連水浸提液對梨樹腐爛病均有一定防效，濃度為5.000 0%時(shí)對菌絲的抑制作用和離體枝條保護(hù)作用最為經(jīng)濟(jì)有效。

關(guān)鍵詞：梨樹腐爛?。稽S連水浸提液；防效；評價(jià)

中圖分類號：S436.612.1；S567.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）01-0078-04

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.01.018

Evaluation of Indoor Control Effects of Water Extract of Chinese Medicinal Materials Coptis chinensis against Pear Valsa Canker

JIANG Jingjing 1， JI Qinlong 2， ZHOU Zhaoxu 1， XU Shenghai 3， XU Yongfeng 4， DU Hui 1

（1. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Wuwei Agriculture Technology and Popularization Centre， Wuwei

Gansu 733000， China; 4. Zhangye Station of Plant Protection and Quarantine， Zhangye Gansu 734000， China）

Abstract： Pear valsa canker is one of the major diseases in pear producton. In search of green control agents for pear valsa canker， the effects of different concentrations of water extract of C. chinensis on the colony growth of V. pyri and its protective effect on isolated pear branches were determined by using mycelial growth rate method and excised twigs inoculation in vitro. The results showed that the different concentrations of water extract of C. chinensis had different degrees of inhibition on V. pyri， among which the inhibition rate was up to 100% at the concentration of 5.000 0%. The results of the in vitro branch protection test showed that there was no significant difference between the area of disease scars when the concentration of water extract of C. chinensis was 5.000 0% and 10.000 0%， and the preventive effect on detached shoots with the efficiency was up to 75.8% and 78.2%， respectively. This study showed that different concentrations of water extract of Coptis chinensis had certain effect on pear valsa canker， and the inhibition of mycelium and protection of isolated branches at a concentration of 5.000 0% is the most economical and effective.

Key words： Pear valsa canker; Water extract of Coptis chinensis; Control effect; Evaluation

梨樹腐爛病（Pear valsa canker）又名臭皮病，是危害梨樹生產(chǎn)的重要病害之一，由蘋果黑腐皮殼梨變種（Valsa mali var. Pyri）侵染引起。該病原菌常侵染梨樹主干及側(cè)枝，導(dǎo)致樹皮呈紅褐色腐爛狀［1? ］。在梨園中，腐爛病常與輪紋病、干腐病復(fù)合侵染梨樹，導(dǎo)致大量梨園被毀，對梨產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅［2 ］。

目前生產(chǎn)中主要依賴化學(xué)藥劑進(jìn)行該病的防治，效果較好的有氟硅唑乳油、丙環(huán)唑、戊唑醇等［3 ］，但長期使用化學(xué)藥劑存在抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題［4 ］，開發(fā)安全、綠色的新型農(nóng)藥是亟待解決的問題。植物源農(nóng)藥主要指通過不同工藝對植物中抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行加工提取，從而獲得對病蟲害有抑制或殺滅作用的農(nóng)藥產(chǎn)品［5 ］。近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，中草藥中的某些抑菌物質(zhì)能夠干擾病原菌及昆蟲生長，表明中草藥對防治農(nóng)作物病蟲害都具有很好的效果［6 - 7 ］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，肉桂、黃芩和桑白皮的乙醇提取液對4種病原真菌具有較好的抑菌活性［8 ］；蛇床子及細(xì)辛的保護(hù)和治療效果更是優(yōu)于化學(xué)藥劑［9 ］；黃連、黃芩及大黃對多種病原真菌均有顯著的抑制作? ? 用［10 ］；含有紫草素、黃柏堿、小檗堿、黃芩素、綠原酸、黃酮類化合物和皂苷類化合物的中草藥制劑都能很好地防治蘋果輪紋病［11 ］、核桃腐爛病、櫻桃流膠病等病害［12 ］，但未見利用中草藥黃連對梨樹腐爛病菌抑菌研究的報(bào)道。

黃連（Coptis chinensis）為毛茛科黃連屬黃連、三角葉黃連以及云南黃連的干燥根莖［13 ］，有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腹瀉、解熱、降血糖、降血脂、抗氧化以及心血管系統(tǒng)保護(hù)等多種藥理作用［14 ］。我們選用中藥材黃連為原材料制備水浸提液，采用生長速率法和離體枝條法在室內(nèi)測試了黃連水浸提液對梨樹腐爛病的抑制作用，以探討黃連水浸提液對梨樹腐爛病的防治效果，旨在為梨樹腐爛病的綠色防治提供科學(xué)依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試中藥材為黃連（市售）。供試菌株為梨樹腐爛病菌（Valsa mali var. Pyri），由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離保存。供試?yán)鏄渲l為采集于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院榆中試驗(yàn)場的早酥梨樹，樹齡4 a，取當(dāng)年生枝條。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 梨樹腐爛病菌的活化及培養(yǎng)? ? 將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌菌株接種于PDA平板上活化，并置于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后挑取菌落邊緣的菌絲接種至新的PDA平板中純化，備用。

1.2.2? ? 黃連水浸提液的制備與稀釋? ? 取黃連100 g，在1 000 mL蒸餾水中浸泡20 min，然后在電磁爐上加熱至煮沸，轉(zhuǎn)小火煮30 min（溫度160 ℃左右），用紗布過濾出濾液。濾渣再加水500 mL，用同樣方法煎煮約30 min后過濾，取2次濾液混合，用蒸餾水定容至1 000 mL（即黃連水浸提液原液）［10 ］。分別取浸提液原液1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 mL，用蒸餾水分別定容至500 mL，即制成濃度為0.3125%、0.625 0%、1.250 0%、2.500 0%、5.000 0%、10.000 0%的供試浸提液，密封置4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3? ? 含藥培養(yǎng)基的制備? ? 用不同濃度的黃連水浸提液代替PDA培養(yǎng)基中等量的水，配制含藥PDA培養(yǎng)基。

1.2.4? ? 含藥培養(yǎng)基抑菌效果的測定? ? 將供試菌株在PDA平板上活化培養(yǎng)3 d后，在接近菌落邊緣生長一致的地方打取直徑為5 mm的菌餅，單個(gè)菌餅菌絲面朝下緊貼含藥PDA平板中央接入，以PDA平板為空白對照，每處理重復(fù)4次，置于25 ℃條件下培養(yǎng)4 d。采用十字交叉法測量記錄菌落直徑，計(jì)算各處理對菌絲的生長抑制率。

菌絲生長抑制率=［（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5）］×100%。

1.2.5? ? 黃連水浸提液對梨樹離體枝條的保護(hù)作用測定? ? 采用梨樹枝條打孔接種法進(jìn)行［15 - 16 ］。剪取20 cm左右長的當(dāng)年生梨樹枝條，用自來水將表面沖洗干凈，用蘸有75%乙醇的脫脂棉擦拭表面消毒，再經(jīng)無菌水沖洗2次，置于超凈工作臺，晾干后用熔化的石蠟封住枝條兩端。用滅菌的直徑5 mm打孔器取下樹皮韌皮部，用蘸有不同濃度藥液的脫脂棉條包裹于傷口處，保濕培養(yǎng)1 d后去掉棉條，用培養(yǎng)3 d、直徑為5 mm的腐爛菌菌餅進(jìn)行接種。每個(gè)濃度藥液接種3根枝條，每根枝條接種3個(gè)點(diǎn)，共計(jì)9個(gè)接種點(diǎn)，以蘸無菌水的棉條包裹后接種病原菌為空白對照。25 ℃保濕全光照培養(yǎng)7 d后測量枝條上的病斑長度，計(jì)算病疤面積和防治效果。

病疤面積＝1/4×π×長徑×短徑

防治效果＝［（對照病疤面積－處理病疤面積）/對照病疤面積］×100%［17 ］。

1.2.6? ?數(shù)據(jù)處理? ? 利用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著檢驗(yàn)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病病菌的抑菌效果

不同濃度的黃連水浸提液對供試腐爛病病菌均具有一定的抑制作用（表1，圖1），其中當(dāng)浸提液濃度高于0.625%時(shí)對菌絲的抑制率超50%，且隨著濃度升高抑制率也升高，當(dāng)濃度為5.000 0%時(shí)抑制率達(dá)100%。

2.2? ?不同濃度的黃連水浸提液對離體枝條的保護(hù)作用

供試4個(gè)濃度的黃連水浸提液對接種了梨樹腐爛病病菌的離體枝條均有一定程度的保護(hù)作用。當(dāng)黃連水浸提液濃度為1.250 0%時(shí)，病疤面積為386.7 mm2，顯著低于對照（P < 0.05），防治效果達(dá)32.9%。隨著黃連水浸提液濃度升高，這種保護(hù)作用也逐漸增強(qiáng)，黃連水浸提液濃度達(dá)5.000 0%、10.000 0%時(shí)，病疤面積之間無顯著差異，但顯著低于其他濃度時(shí)的病疤面積（P < 0.05），對接種病原菌的離體枝條的保護(hù)作用最強(qiáng)，防治效果分別為75.8%、78.2%（圖2、表2）。

3? ?結(jié)論與討論

黃連作為中醫(yī)臨床常用藥，具有多種藥理功能，其抑菌作用非常廣泛，素有“中藥抗生素”之稱［18 ］。Hao等［19 ］鑒定了黃連根的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)黃連根中有29種化合物，其中包括生物堿、有機(jī)酸、黃酮類化合物以及其他物質(zhì)。目前的研究表明，黃連對多種植物病原細(xì)菌和真菌也同樣具有顯著的抑制作用。周勇等［20 ］發(fā)現(xiàn)，黃連提取液對魔芋軟腐病病原菊果膠桿菌的抑菌效果優(yōu)于其他中草藥；蔣晶晶等［10 ］選用3種中草藥水浸提液對5種植物病原真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，表明黃連抑菌范圍最廣、效果最好；王艷紅等［21 ］發(fā)現(xiàn)黃連對番茄早疫病菌的抑菌效果最好，抑制率達(dá)93.9%，大黃次之；賈正燕等［22 ］和李家洲等［23 ］的研究表明，黃連水提液對作物根腐病病原菌均具有較好的抑制效果。本試驗(yàn)通過菌絲生長速率法，測定了不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病病菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病病原菌的抑菌效果不同，當(dāng)濃度達(dá)到5%以上時(shí)抑菌率為100%，當(dāng)黃連水浸提液濃度為5.000 0%和10.000 0%時(shí)，病疤面積間無顯著性差異，室內(nèi)防效分別為75.8%和78.2%，該結(jié)果與蔣晶晶等［10 ］報(bào)道的黃連水浸提液在濃度為10%時(shí)對辣椒疫霉菌和西瓜蔓枯病菌的抑制率達(dá)75%以上的結(jié)果相近，表明黃連水浸提液有較廣的抗菌譜。

離體枝條接種時(shí)選取了長勢及含水量一致的一年生健康枝條，且均剪成小段備用，保證了試驗(yàn)條件的一致性。但是在實(shí)際試驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)枝條上9個(gè)接種點(diǎn)的病斑直徑之間差異仍然較大，同一枝條的稍部、中部、基部的發(fā)病率有顯著差異，這與林曉等［24 ］報(bào)道的一致，可為后期室內(nèi)篩選梨樹腐爛病綠色防控農(nóng)藥時(shí)選擇正確的接種及統(tǒng)計(jì)方法提供參考。

有學(xué)者對中藥抑菌活性的影響因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)中藥生長環(huán)境、用藥部位、采摘季節(jié)、不同有效成分、炮制方法、提取方法等因素對中藥的活性成分及抑菌效果均有影響［25 - 26 ］。目前常用的中草藥提取方法主要有煎煮法、浸漬法、回流法和滲漉法等傳統(tǒng)溶劑萃取方法及動(dòng)態(tài)循環(huán)連續(xù)逆流提取技術(shù)［27 ］。采用中草藥水浸提液進(jìn)行試驗(yàn)，可避免提取過程中有機(jī)試劑對環(huán)境的污染，且降低了生產(chǎn)成本。中藥水提取法由于其簡單易行，是最早也是至今應(yīng)用最廣泛的提取方法。水浸提液作用于寄主時(shí)，由于抗菌物質(zhì)在寄主上的滲透能力和持續(xù)時(shí)間不同而效果不同，這就要求通過有效的滲透劑增強(qiáng)其在寄主體內(nèi)的滲透和擴(kuò)散能力，從而增強(qiáng)中草藥水浸提液的藥效，更好地發(fā)揮其防病效果。本研究僅在室內(nèi)測定了不同濃度的黃連水浸提液對梨樹腐爛病的防效，對梨樹腐爛病的防治效果尚需在田間進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

［1］ YIN Z Y， LIU H Q， LI Z P， et al.? Genome sequence of Valsa canker pathogens uncovers a potential adaptation of colonization of woody bark［J］.? New Phytologist， 2015（208）： 1202-1216.

［2］ WANG X L， ZANG R， YIN Z Y， et al.? Delimiting cryptic pathogen species causing apple valsa canker with multilocus data［J］.? Ecology and Evolution， 2014， 4： 1369-1380.

［3］ 曹素芳，王? ?瑋，李國權(quán)，等.? 梨樹腐爛病田間防治藥劑篩選試驗(yàn)［J］.? 中國果樹，2018（6）：60-62.

［4］ 趙新貝，上官妮妮，李月飛，等.? 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌18BS-12發(fā)酵條件的優(yōu)化及防治效果［J］.? 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，44（6）：116-124.

［5］ 黃? ?穎. 三種植物活性物質(zhì)復(fù)配微囊劑對草莓灰霉的防控研究［D］.? 天津： 天津農(nóng)學(xué)院，2020.

［6］ SOLA P， MVUMI B M， OGENDO J O， et al.? Botanical pesticide production， trade and regulatory mechanisms in sub-Saharan Africa： making a case for plant-based pesticidal products［J］. Food Security， 2014， 6（3）： 369-384.

［7］ 歐陽秋飛，楊建波，馬? ?博，等.? 一株芒果蒂腐病病原菌的鑒定及中草藥對其抑制作用分析［J］.? 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，31（12）：54-59.

［8］ 嚴(yán)? ?希，田山君，裴? ?蕓，等.? 幾種中藥提取液對番茄病害病原真菌的抑制效果［J］.? 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，

45（20）：129-134.

［9］ 李發(fā)康，李? ?培，李興昱，等.? 5種中草藥提取液對裸仁美洲南瓜白粉病的防治效果［J］.? 中國蔬菜，2020（3）：56-60.

［10］ 蔣晶晶，彭沛穰，蘇鋒鋒，等.? 中草藥水浸提液對5種植物病原真菌的影響［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，

48（17）：172-174；235.

［11］ 劉立新，梁鳴早.? 植物次生代謝作用及其產(chǎn)物概述［J］.? 中國土壤與肥料，2009（5）：82-86.

［12］ 劉祥東，徐明舉.? 植物源生物農(nóng)藥（中草藥）在果樹疑難病害中的防治思路與效果［J］.? 果農(nóng)之友，2015（3）：31-32.

［13］ 張? ?瑩，楊艷芳，吳和珍.? 黃連的本草考證［J］.? 中國藥房，2021，32（13）：1634-1638.

［14］ 王? ?舒.? 中藥黃連研究進(jìn)展［J］.? 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，

11（9）：44-46.

［15］ 張美鑫，翟立峰，周玉霞，等.? 梨腐爛病致病力的室內(nèi)快速測定方法研究［J］.? 果樹學(xué)報(bào)，2013，30（2）：317-322；333.

［16］ 王? ?帥，劉召陽，高小寧，等.? 10種生物源殺菌劑對蘋果樹腐爛病菌的室內(nèi)活性評價(jià)［J］.? 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，34（1）：150-156.

［17］ 張? ?杰，劉媛媛，朱會(huì)營，等.? 中草藥源殺菌劑“輪紋一掃光”對蘋果枝干輪紋病防治作用研究［J］.? 中國生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（5）：1050-1057.

［18］ 蔣麗施，左棲楓，張新明，等.? 黃連的抑菌作用及其在食品防腐保鮮中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.? 保鮮與加工，2021，21（12）：132-139.

［19］ HAO Y M， HUO J H， WANG T， et al.? Chemical profiling of Coptis rootlet and screening of its bioactive compounds in inhibiting Staphylococcus aureus by UPLC-Q-TOF/MS［J］.? Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2020， 180： 113089.

［20］ 周? ?勇，代小瑩，劉? ?昔，等.? 10種中藥材和大蒜提取液對菊果膠桿菌的抑菌效果［J］.? 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（1）：120-123.

［21］ 王艷紅，賈桂燕，葛文中，等.? 中藥大黃對番茄早疫病菌抑菌作用的初步研究［J］.? 化學(xué)工程師，2015（5）：8-10.

［22］ 賈正燕，王昌梅，張? ?嘯，等.? 黃連水提液對腐皮鐮孢菌抑制效果研究［J］.? 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（20）：195-197；209.

［23］ 李家洲，洪妙珍，李玉嬋，等.? 抗香蕉枯萎病病原菌中藥材的篩選［J］.? 中國南方果樹，2014，43（2）：64-67.

［24］ 林? ?曉，李寶篤，王彩霞，等.? 低溫、冰凍、失水與蘋果枝條對腐爛病菌敏感性［C］//彭友良，李向東.中國植物病理學(xué)會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.? 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2017：149.

［25］ 劉艷霞，杜寶中.? 中草藥抗菌活性研究進(jìn)展［J］.? 中國醫(yī)藥，2021，16（4）：622-625.

［26］ 賈正燕.? 中藥與沼液對兩株三七根腐病原菌的抑制效果研究［D］.? 昆明： 云南師范大學(xué)，2022.

［27］ 張? ?楓.? 中藥提取工藝對藥品質(zhì)量的影響分析［J］.? 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2020，7（35）：196.

收稿日期：2022 - 10 - 30；修訂日期：2022 - 12 - 02

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金（20JR10RA458）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新專項(xiàng)（2020GAAS38、2021GAAS17）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201404-4）。

作者簡介：蔣晶晶（1988 — ），女，甘肅榆中人，助理研究員，主要從事經(jīng)濟(jì)作物病害及其防治研究工作。Email：jingjingziyu@163.com。

通信作者：杜? ?蕙（1970 — ），女，甘肅臨洮人，研究員，主要從事植物病害及其防治研究工作。Email： dh0928@163.com。