益肝明目湯對糖尿病視網(wǎng)膜水腫模型大鼠NLRP3/Caspase-1信號通路的影響

廉藝童 劉志敏 聶輔嬌 胡卓瑜 付美林 胡齊 江婕妤 陳向東

〔摘要〕 目的 觀察益肝明目湯對糖尿病視網(wǎng)膜水腫模型大鼠NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteine aspartate-specific proteinase-1， Caspase-1）信號通路的影響，從細(xì)胞焦亡的角度探討其治療糖尿病視網(wǎng)膜水腫的作用機(jī)制。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（6只）和造模組（30只）。采用一次性腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）溶液聯(lián)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)建立糖尿病視網(wǎng)膜水腫大鼠模型。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組，安多明組，低、中、高劑量組，每組6只，分別予以蒸餾水、羥苯磺酸鈣膠囊（0.09 g/kg）、益肝明目湯（2.8、5.6、11.2 g/kg）進(jìn)行灌胃，每日2次，連續(xù)4周。觀察大鼠一般生物學(xué)特征，監(jiān)測不同時期血糖、體質(zhì)量變化；采用眼底熒光血管造影（fundus fluorescence angiography， FFA）和光學(xué)相關(guān)斷層掃描技術(shù)（optical correlation tomography， OCT）觀測各階段視網(wǎng)膜血管滲漏及視網(wǎng)膜厚度的變化；HE染色檢測視網(wǎng)膜組織病理變化；免疫組化法檢測視網(wǎng)膜組織NLRP3與銜接蛋白（apoptosis-associated speck-like protein， ASC）表達(dá)水平；Western blot檢測視網(wǎng)膜組織Caspase-1與NLRP3表達(dá)水平；ELISA檢測血清炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18， IL-18）含量。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠一般生物學(xué)特征出現(xiàn)較明顯的改變；血糖顯著升高（P＜0.01）；體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；視網(wǎng)膜厚度增加（P＜0.01）；FFA可見視網(wǎng)膜血管走行迂曲，散在微血管瘤及少許點(diǎn)狀強(qiáng)熒光；病理形態(tài)見各層細(xì)胞排列紊亂、稀疏，內(nèi)叢狀層、內(nèi)外核層松散，結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜厚度增加；視網(wǎng)膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)及炎癥因子IL-1β、IL-18含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，中劑量組、高劑量組大鼠血糖均降低（P＜0.05）；安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠體質(zhì)量均升高（P＜0.01）；各給藥組大鼠視網(wǎng)膜厚度呈不同程度減少（P＜0.01）；FFA見微血管瘤及點(diǎn)狀強(qiáng)熒光減少；病理形態(tài)見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)基本完整，排列規(guī)整，厚度減少；視網(wǎng)膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)及炎癥因子IL-1β、IL-18含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)論 以疏肝健脾、活血利水為治法的益肝明目湯可能通過干預(yù)NLRP3/Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，進(jìn)而減輕炎癥因子的釋放，減輕視網(wǎng)膜水腫，從而改善視網(wǎng)膜功能。

〔關(guān)鍵詞〕 益肝明目湯；糖尿病視網(wǎng)膜病變；視網(wǎng)膜水腫；細(xì)胞焦亡；NLRP3/Caspase-1信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.009

Effects of Yigan Mingmu Decoction on the NLRP3/Caspase-1 signaling

pathway in rats model with diabetic retinal edema

LIAN Yitong1，2， LIU Zhimin1， NIE Fujiao1， HU Zhuoyu1，2， FU Meilin1， HU Qi1，2， JIANG Jieyu1，2， CHEN Xiangdong1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Yigan Mingmu Decoction on the NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3）/cysteine aspartate-specific proteinase-1 （Caspase-1） signaling pathway in rats with diabetic retinal edema， and to explore the mechanism of action in the treatment of diabetic retinal edema from the perspective of pyroptosis. Methods A total of 36 SD rats were randomly divided into blank group （n=6） and model group （n=30）. The one-time intraperitoneal injection of 40 mg/kg streptozocin （STZ） solution combined with high-sugar and high-fat feed was applied to establish the rat model of diabetic retinal edema. Then the above models were divided into model groups， andomine group， low-dose， medium-dose and high-dose Yigan Mingmu Decoction groups， with 6 rats in each group. All the rats were treated with distilled water， calcium hydroxybenzenesulfonate granules （0.09 g/kg）， and Yigan Mingmu Decoction （2.8， 5.6， 11.2 g/kg） respectively， twice a day in 4 consecutive weeks. The general biological characteristics of rats were observed; the changes in blood sugar and body weight in different periods were monitored; the retinal vascular leakage and retinal thickness changes at various stages were found using fundus fluorescence angiography （FFA） and optical correlation tomography （OCT）; the renal tissue pathological morphology was detected by HE staining; the expression of NLRP3 and apoptosis-associated speck-like protein （ASC） in retinal tissue was detected by immunohistochemistry; the expression of Caspase-1 and NLRP3 in retinal tissues was detected by Western blot; the content of serum inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） was detected by ELISA. Results Compared with blank group， the general biological characteristics of rats in model group were significantly changed， blood glucose increased significantly （P<0.01）， body weight decreased significantly （P<0.01）， and retinal thickness increased （P<0.01）. FFA showed that the retinal blood vessels were tortuous， scattered with microangiomas and a few punctate strong fluorescence points. Pathological morphology showed disordered and sparse arrangement of cells in each layer， loose inner plexiform layer， inner and outer nuclear layers， disordered structure， and increased retinal thickness. The protein expression of NLRP3， ASC， Caspase-1 and the inflammatory factors of IL-1β， IL-18 significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， blood glucose in medium-dose group and high-dose group decreased （P<0.05）. The body weight of andomine group， low-dose group， medium-dose group and high-dose group was higher than that of model group; the retinal thickness of the rats in each administration group was reduced to varying degrees， and FFA showed that the microvascular tumors and punctate strong fluorescence were reduced. Pathological morphology showed that the structure of each layer of retina was basically intact， regular arranged， and the thickness was reduced. The protein expression of NrLRP3， ASC， and Caspase-1 and the inflammatory factors of IL-1β， IL-18 in retinal tissue were significantly lower （P<0.01， P<0.05）. Conclusion Yigan Mingmu Decoction soothes the liver and fortifies the spleen， activate blood and drain water retention. It may intervene the NLRP3/Caspase-1 mediated pyroptosis， release less inflammatory factors， and relieve the retinal edema and thus improve retinal function.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yigan Mingmu Decoction; diabetic retinopathy; retinal edema; pyrolysis; NLRP3/Caspase-1 signaling pathway

糖尿病黃斑水腫（diabetic macular edema， DME）是糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）最為常見的并發(fā)癥，可發(fā)生在DR的任一時期，是糖尿病患者視力損害的重要原因之一，其主要病理特點(diǎn)是黃斑區(qū)積液、彌漫性毛細(xì)血管滲漏、毛細(xì)血管擴(kuò)張、黃斑區(qū)滲漏等[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。DME發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)貫穿疾病全程，研究表明，高血糖可通過細(xì)胞焦亡或自噬等生物過程引起炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致血管和視網(wǎng)膜組織損傷[2]，最終導(dǎo)致DME發(fā)生。細(xì)胞焦亡典型通路以NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）炎癥小體活化、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteine aspartate-specific proteinase-1， Caspase-1）激活、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18， IL-18）的釋放為特征[3]，其過度活化會加重炎癥反應(yīng)，炎癥因子浸潤會導(dǎo)致DR進(jìn)一步加劇，進(jìn)而加重視網(wǎng)膜水腫，影響視網(wǎng)膜功能[4-6]。目前，玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）為臨床一線治療方法，在抑制視網(wǎng)膜新生血管生長，減輕黃斑水腫等方面取得較好臨床效果[7]，但因藥效時間短，注射費(fèi)用昂貴，需反復(fù)多次注射，會引起白內(nèi)障、頑固性眼壓高、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜脫離等局部并發(fā)癥，也可能因全身吸收引起不良反應(yīng)，尚有許多無效病例[8]。因此，探究安全有效的DME中醫(yī)藥治療方法具有重要的意義。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，益肝明目湯在改善DME患者視力、增加水腫吸收、提高遠(yuǎn)期療效等方面具有明顯優(yōu)勢[9-10]。為進(jìn)一步驗證其療效機(jī)制，本實驗以細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路NLRP3/Caspase-1為切入點(diǎn)，探討益肝明目湯對糖尿病視網(wǎng)膜水腫模型大鼠的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?動物

SPF級雄性SD大鼠36只，鼠齡8周，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0008。飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，溫度24～26 ℃，濕度50%～70%，通風(fēng)良好，晝夜交替。依照實驗動物中心管理辦法，分籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗階段。實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院實驗倫理委員會批準(zhǔn)（2020-0062）。

1.2 ?藥物

益肝明目湯中藥超微顆粒劑組方：柴胡10 g（批號：2015020C），當(dāng)歸10 g（批號：2106029C），白芍10 g（批號：2105009S），川芎10 g（批號：2102028C），丹參15 g（批號：2017003C），茯苓15 g（批號：2102007C），車前子10 g（批號：2102110C），密蒙花10 g（批號：2102005C），蒺藜10 g（批號：2107005C），澤瀉10 g（批號：2104010C），茺蔚子10 g（批號：2103009C），決明子15 g（批號：2105020C），中藥超微配方顆粒均購自湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，將中藥超微顆粒劑溶于蒸餾水。羥苯磺酸鈣膠囊（安多明）（貴州天安藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.25 g/粒，批號：14201658642）。

1.3 ?主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美國Sigma公司，批號：08E221108）；蘇木素、PBS、伊紅（長沙維世爾生物科技有限公司，批號：02A221224、01A221001、05F221211）；檸檬酸、檸檬酸鈉（上海展云化工有限公司，批號：01B221210、03A221023）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（沈陽興齊眼藥股份有限公司，批號：14200221221）；熒光素鈉（廣州白云山明興制藥有限公司，批號：XY19118）；NLRP3抗體、ASC抗體、β-actin抗體、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG（中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：00091876、20000132、10004156、20000242、20000243）；Caspase-1抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：GR2126147-6]；IL-18試劑盒、IL-1β試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：200116、200503）。

1.4 ?主要儀器

眼底血管熒光造影儀、光學(xué)相干斷層掃描儀（德國海德堡公司，型號：Spec-CAM-07973-S1600、Spec-CAM-05529-S2000）；臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；全自動酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：PW-812、MB-530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DHP-500）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）。

1.5 ?造模、分組及給藥

36只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，空腹12～14 h后稱重編號，隨機(jī)分為空白組（6只）、造模組（30只）。空白組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，2周后禁食12～15 h，自由飲水，配制0.1 mmol/L新鮮檸檬酸緩沖液（pH 4.2），制備1% STZ溶液，按照40 mg/kg一次性腹腔注射[11]，在30 min內(nèi)完成注射，防止STZ溶液失效，注射完成后恢復(fù)飲食。72 h后隨機(jī)血糖水平達(dá)到16.7 mmol/L及以上的大鼠，認(rèn)為糖尿病大鼠模型建立成功，不達(dá)標(biāo)或短期內(nèi)血糖降低的大鼠，可同法腹腔注射小劑量（30 mg/kg）造模，至血糖達(dá)標(biāo)[12]。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算[13]，以臨床等效劑量為中劑量，即低劑量組、中劑量組、高劑量組每日分別以濃度為2.8、5.6、11.2 g/kg的益肝明目湯灌胃，安多明組按說明書配制等效劑量0.09 g/kg灌胃，空白組和模型組均予蒸餾水16 mL/（kg·d）灌胃。各組每日灌胃2次，干預(yù)4周。實驗過程中出現(xiàn)死亡的大鼠予以剔除并根據(jù)要求進(jìn)行補(bǔ)充。

1.6 ?一般生物學(xué)特征

觀察SD大鼠在不同時期的體格、毛發(fā)、進(jìn)食、飲水、大小便等行為學(xué)特征及空白組與造模組大鼠的生物學(xué)差異，觀察并評價其晶狀體混濁程度是否隨病情進(jìn)展發(fā)生代謝性白內(nèi)障。

1.7 ?血糖、體質(zhì)量水平

分別在造模前，造模后第1、4、8周（灌胃前），灌胃4周后測量記錄所有大鼠的血糖及體質(zhì)量。

1.8 ?OCT視網(wǎng)膜厚度

分別在造模前，造模后第4、8周（灌胃前），灌胃4周后使用OCT測量大鼠視網(wǎng)膜厚度，腹腔注射10%水合氯醛30 mg/kg進(jìn)行麻醉，雙眼滴用復(fù)方托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳，固定鼠眼，雙眼行OCT檢查并手動測量距離視盤上方、下方、顳側(cè)、鼻側(cè)2個視盤直徑的視網(wǎng)膜厚度，即視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜色素上皮高反射層[14]。

1.9 ?眼底熒光造影檢查

分別在造模后第4、8周及灌胃4周后行眼底熒光血管造影（fundus fluorescence angiography， FFA）檢查，檢查時大鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的熒光素鈉（0.012 mL/g），并快速觀察及拍攝視網(wǎng)膜血管情況，觀察血管充盈狀態(tài)及有無熒光滲漏、灌注區(qū)等。

1.10 ?HE染色

麻醉成功后離斷視神經(jīng)，摘除大鼠眼球，置入眼球固定液中，進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.11 ?ELISA檢測

腹主動脈取血，室溫自然凝固15 min，3000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），取上清液，按照ELISA試劑盒步驟檢測大鼠視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-18含量。

1.12 ?免疫組化檢測

視網(wǎng)膜組織石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟脫水，熱修復(fù)抗原、漂洗、封閉；孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（NLRP3、ASC），4 ℃過夜。PBS漂洗；孵育二抗：滴加50～100 μL HRP goat anti-rabbit IgG于37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)；各級乙醇（60%～100%）脫水，每級5 min。二甲苯透明，中性樹膠封片、顯微鏡拍片采像，并使用圖片分析軟件IPP（Image-Pro-Plus）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別計算NLRP3、ASC陽性表達(dá)的平均光密度值（IOD）。

1.13 ?Western blot檢測

取視網(wǎng)膜組織用冰預(yù)冷，PBS洗滌組織，加入100 μL RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織，直至組織塊溶解；離心，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，各組取80 μL蛋白上清，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h；加入NLRP3（1∶300）、Caspase-1（1∶1000）、β-actin（1∶5000）一抗，4 ℃孵育過夜；PBST洗3次，每次10 min；加入HRP goat anti-mouse IgG（1∶5000）、HRP goat anti-rabbit IgG（1∶6000）二抗，室溫孵育1.5 h，PBST洗3次，每次10 min，ECL顯色曝光，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.14 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0系統(tǒng)軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，多組間比較采用方差分析（LSD法及Dunnet 法），不滿足正態(tài)性時，則用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?益肝明目湯對模型大鼠一般情況的影響

空白組精神狀態(tài)及活動度良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，晶狀體無渾濁，飲水量及攝食量適中，二便正常，體質(zhì)量進(jìn)行性增加，籠內(nèi)墊料干燥；模型組大鼠精神狀態(tài)不佳，體形消瘦，反應(yīng)遲鈍，情緒暴躁，毛發(fā)萎黃易脫，部分晶狀體渾濁，飲水、攝食量、尿量明顯增加，多尿，籠內(nèi)墊料潮濕，部分伴有爛蘋果味，給藥組精神不佳、毛發(fā)枯黃、多飲、多尿、多食等情況均有所改善。

2.2 ?益肝明目湯對模型大鼠血糖、體質(zhì)量的影響

造模前，各組大鼠血糖、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模后，模型組、安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血糖均顯著升高，并趨于穩(wěn)定，與空白組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；灌胃4周后，與模型組對比，中劑量組、高劑量組大鼠血糖均降低（P＜0.05）。造模前、造模后1周，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模后4、8周及灌胃4周后空白組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，高于其余各組（P＜0.01）；灌胃4周后，與模型組對比，安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠體質(zhì)量均升高（P＜0.01）。詳見圖1。

2.3 ?益肝明目湯對模型大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化的影響

灌胃4周后，空白組大鼠眼底清晰，視網(wǎng)膜血管走行規(guī)律，粗細(xì)均勻，以視盤為中心呈放射狀；模型組大鼠眼底較空白組模糊，可見視網(wǎng)膜血管走行迂曲，見散在微血管瘤及少許點(diǎn)狀強(qiáng)熒光；安多明組、中劑量組大鼠眼底可見微血管瘤及點(diǎn)狀熒光數(shù)量減少；低劑量組、高劑量組仍可見散在點(diǎn)狀熒光。詳見圖2。

2.4 ?益肝明目湯對模型大鼠視網(wǎng)膜厚度的影響

造模前、造模后4周，各組大鼠視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模后8周，與空白組對比，模型組、安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜厚度均有不同程度的增加（P＜0.01）；灌胃后4周，與模型組對比，安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜厚度均有不同程度的減少（P＜0.01）。詳見圖3。

2.5 ?益肝明目湯對模型大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，排列整齊；模型組大鼠視網(wǎng)膜可見各層細(xì)胞排列紊亂稀疏，視網(wǎng)膜色素上皮層變薄，內(nèi)叢狀層、內(nèi)外核層松散，結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜厚度增加；與模型組比較，安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)基本完整，排列規(guī)整，厚度減少。詳見圖4。

2.6 ?益肝明目湯對模型大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-18含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-18含量均有不同程度的降低（P＜0.01）。詳見圖5。

2.7 ?益肝明目湯對模型大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、ASC蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、ASC表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，安多明組、低劑量、中劑量及高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、ASC表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。詳見圖6—7。

2.8 ?益肝明目湯對模型大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、Caspase-1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，安多明組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、Caspase-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖8。

3 討論

根據(jù)DME臨床癥狀將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴目病”“視瞻昏渺”“視直如曲”等范疇。《素問·陰陽應(yīng)象大論》云“脾在色為黃”，故五輪學(xué)說中黃斑歸屬于脾；消渴日久，耗傷氣血陰液，肝失所養(yǎng)，肝開竅于目，肝血不足，目失濡養(yǎng)而不能視，引發(fā)目疾；《素問·氣交變大論》曰“歲木太過，風(fēng)氣流行，脾土受邪”，肝病日久，疏泄失常，肝氣郁結(jié)，肝木乘脾土，脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)停不化，上犯目竅，導(dǎo)致黃斑區(qū)水腫、滲出，故DME與肝、脾兩臟密切相關(guān)。陳向東教授基于“血水同治”理論，在四物湯的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立以疏肝健脾、活血利水為治法的中藥湯劑益肝明目湯，該方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、川芎、丹參、密蒙花、茯苓、澤瀉、車前子、蒺藜、茺蔚子、決明子組成。柴胡疏肝解郁、疏暢氣機(jī)為君；密蒙花養(yǎng)肝明目，蒺藜平肝明目、疏肝解郁，車前子明目、利水滲濕，決明子清肝明目，四藥共助君藥以達(dá)益肝明目之效；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝、健脾調(diào)肝為臣；茺蔚子、川芎活血行氣，丹參活血祛瘀，茯苓、澤瀉利水滲濕，共為佐藥；方中川芎為血中之氣藥，協(xié)諸藥上行直達(dá)病所。諸藥合用，共奏疏肝健脾、活血利水之功。臨床研究發(fā)現(xiàn)，益肝明目湯能有效減輕視網(wǎng)膜水腫，改善患者視力，具有遠(yuǎn)期療效穩(wěn)定的優(yōu)勢[9-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡-白芍合用可協(xié)同抗炎[15-16]，且柴胡皂苷能減輕DR大鼠視網(wǎng)膜微血管炎癥及通透性[17]；當(dāng)歸具有刺激胰島素分泌、降糖、抗炎的作用[18]，可抑制VEGF及新生血管的生成[19]；丹參提取物具有抗炎、抗氧化作用[20]，可抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及新生血管的形成[21]；密蒙花能抗VEGF、抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及新生血管生成[22]；川芎、澤瀉能抗炎[23-24]；茯苓、車前子、決明子可降糖、抗炎[25-27]；蒺藜具有保護(hù)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的作用[28]；茺蔚子可抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)[29]。本研究FFA結(jié)果顯示，模型組大鼠眼底模糊，視網(wǎng)膜血管走行迂曲，有散在微血管瘤及少許點(diǎn)狀強(qiáng)熒光；HE染色見模型組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂稀疏，視網(wǎng)膜色素上皮層變薄，內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外核層松散，結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜厚度增加。經(jīng)藥物干預(yù)后各組大鼠血糖、體質(zhì)量、視網(wǎng)膜水腫、視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)均有所改善，提示益肝明目湯能降低DME大鼠血糖、穩(wěn)定體質(zhì)量、減輕視網(wǎng)膜病理損傷及水腫，與臨床研究結(jié)果相似[9-10]。

細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，其特征為炎性 Caspase激活導(dǎo)致細(xì)胞膜成孔、透化，細(xì)胞腫脹，直至胞膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，繼而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[30]。DME的發(fā)生、發(fā)展伴隨著高血糖及慢性炎癥，在高血糖及炎癥刺激下，NOD樣蛋白受體被激活，如NLRP1、NLRP3等，通過ASC，與募集而來的Caspase-1前體結(jié)合形成NLRP3炎性復(fù)合物，進(jìn)而活化Caspsae-1[31-32]，有活性的Caspase-1 可對執(zhí)行蛋白GSDMD的N端和C端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行切割，活化的N-結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)細(xì)胞膜形成親水性孔道，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹裂解，釋放出IL-1β和IL-18，進(jìn)而吸引更多的炎性細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織水腫[33-34]。研究證實，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及其下游成熟分子IL-1β、IL-18的表達(dá)增加[35-37]，DR患者的玻璃體及手術(shù)切除的增殖膜中NLRP3、Caspase-1、IL-18也呈高表達(dá)[38]，且水平高低與DR進(jìn)展程度呈正相關(guān)[39]，證實了NLRP3炎癥小體激活誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在DR及DME發(fā)展進(jìn)程中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及血清炎癥因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平均顯著升高，表明糖尿病視網(wǎng)膜水腫大鼠視網(wǎng)膜組織存在細(xì)胞焦亡；與模型組比較，各干預(yù)組均能在不同程度上抑制NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)，減少血清炎癥因子IL-1β、IL-18釋放，表明益肝明目湯可通過抑制NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)，減少NLRP3炎癥小體的形成，進(jìn)而減少炎癥因子IL-1β、IL-18的釋放，減輕視網(wǎng)膜損傷。

綜上所述，益肝明目湯可能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，抑制NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)及炎癥因子IL-1β、IL-18釋放，改善視網(wǎng)膜組織炎癥狀態(tài)，減輕視網(wǎng)膜病理損傷，減輕視網(wǎng)膜水腫，從而改善視網(wǎng)膜功能，延緩DME進(jìn)展。

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〔收稿日期〕2022-11-15

〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥科研計劃課題項目（201917）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（C2022003，E2022044）；湖南省自然科學(xué)基金面上項目（2021JJ30520）；長沙市自然科學(xué)基金項目（kq2014226）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目（19A362）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金項目（2018ZYX60）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題項目（2021CX76）。

〔第一作者〕廉藝童，男，碩士研究生，研究方向：眼底病的防治與研究。

〔通信作者〕*陳向東，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：564259166@qq.com。